KR20030021976A

KR20030021976A - 포도 유래의 천연 항암물질인 레스베라트롤의 함량을증폭시킨 레스베라트롤 강화 포도 및 그 생산방법

Info

Publication number: KR20030021976A
Application number: KR1020010055574A
Authority: KR
Inventors: 송방호; 김사열; 서영배
Original assignee: 대한민국(경북대학교 총장)
Priority date: 2001-09-10
Filing date: 2001-09-10
Publication date: 2003-03-15

Abstract

본 발명은 포도 유래의 천연 항암물질인 레스베라트롤(Resveratrol)의 함량을 증폭시킨 레스베라트롤 강화 포도 및 그 생산방법에 관한 것으로서, 포도에서 천연 항암물질인 레스베라트롤의 합성을 유도하는 신규한 균주 플라스모파라 비티콜라(Plasmopara viticola)를 분리·동정하고, 최적 재배조건에서 재배되고 최적 수확시기에 수확된 포도에 상기 균주를 인위적으로 접종함으로써 항암효과가 있는 레스베라트롤이 다량 함유된 레스베라트롤 강화 포도 및 이를 이용한 다양한 기능성 식품을 생산할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

Description

포도 유래의 천연 항암물질인 레스베라트롤의 함량을 증폭시킨 레스베라트롤 강화 포도 및 그 생산방법{TRANS-RESVERATROL STRENGTHENED GRAPES INCREASING THE CONTENT OF A TRANS-RESVERATROL, A NATURAL ANTI-CANCER MATERIAL, BY INFECTION OF PLASMOPARA VITICOLA AND THE METHOD FOR PRODUCING THEM}

본 발명은 포도 유래의 천연 항암물질인 레스베라트롤의 함량을 증폭시킨 레스베라트롤 강화 포도 및 그 생산방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 포도에서 천연 항암물질인 레스베라트롤[L. Fremont, Biological effects of resveratrol, Life Sciences (2000) 66, 663-673]의 합성을 유도하는 신규한 균주 플라스모파라 비티콜라(Plasmopara viticola)를 수확된 포도에 인위적으로 접종하여 생산한 항암효과가 우수한 레스베라트롤이 다량 함유된 레스베라트롤 강화 포도, 이를 이용한 기능성 식품 및 그 생산방법에 관한 것이다.

국내산 포도주에 함유된 천연 항암물질 레스베라트롤의 함량을 검토한 결과, 가장 다량으로 함유된 A제품의 경우 3.3mg/ℓ로써 세계적으로 가장 높은 프랑스산 포도주의 2.88∼4.39mg/ℓ에 버금가는 정도이었다. 그러나, 그외 제품 또는 원료가 다른 포도의 품종으로부터 제조한 포도주는 레스베라트롤 함량이 현저히 낮았다. 레스베라트롤은 포도주의 발효과정에서 유도합성되는 물질이 아니라 원료인 포도에 함유되어 있다가 포도주의 발효과정중에 유출되는 성분이다.

수확기의 포도는 날씨가 습하면 감염되는 곰팡이를 방어하기 위하여 피토알렉신(phytoalexin)의 일종인 레스베라트롤을 생산한다. 레스베라트롤은 coumaroyl-CoA와 malonyl-CoA로부터 효소 스틸벤 신타아제(stilbene synthase)에 의하여 합성되는 복합페놀물질로써[K. H. Fritzemeier & H. Kin, Coordinate induction by UV light of stilbene synthase, phenylalanine ammonia-lyase and cinnamate 4-hydroxylase in leaves of vitaceae, Planta (1981), 151, 48-52] 포도 또는 포도주 속에 함유되어 포도가 해충과 환경 스트레스로부터 자신을 방어하기 위하여 생산하는 피토알렉신의 일종이다. 레스베라트롤은 천연 항암물질이며, 항염증 및 항암효과가 탁월한 것으로 알려져 있다[A.A.E. Bertelli 등, Resveratrol, a natural stilbene in grapes and wine, enhances intraphagocytosis in human promonocytes: A co-factor in antiinflmmatory and anticancer chemopreventive activity, Int, J, Tissue React. (1999) 21(4), 93-104]. 레스베라트롤은 허피스 바이러스(herpes virus)의 복제를 억제하거나[J.J. Docherty 등, Resveratrol inhibition of herpes simplex virus replication, Antiviral Research, (1999) 43, 145-155], F0F1-ATP ase/ATP 신타아제[J. Zheng & V. D. Ramirez, Inhibition of mitochondrial proton F0F1-ATP ase/ATP synthase by polyphenolic phytochemicals, British J. Pharmacol. (2000) 130, 1115-1123], 리폭시게나제(lipoxigenase) 또는 시클로옥시게나제(cyclooxygenase)[M. Maccarrone 등, Resveratrol prevents apoptosis in K562 cells by inhibiting lipoxygenase and cyclooxygenase activity, Eur. J. Biochem. (1999) 265, 27-34], 리보뉴클레오티드 리덕타제(ribonucleotide reductase)[M. Fontecave 등, Resveratrol, a remarkable inhibitor of ribonucleotide reductase. FEBS Letters (1998) 421, 277-279] 등의 효소 활성을 저해한다.

레스베라트롤은 독일의 Bayer Aktiengesellschaft, 이탈리아의 Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A., 미국의 Virginia Tech Intellectual Properties, Inc., Sage R & D 등에서 관련 특허 10여개를 확보하여 산업화를 추진중이며, 미국특허 7개를 보유한 독일의 Bayer Aktiengesellschaft는 식물이 만드는 레스베라트롤이 미생물이나 곤충과 같은 해충에 저항성을 가지고 있다는 사실로부터 스틸벤 화합물 대사에 관련된 소나무의 피노실빈(pinosylvine) 신타아제 유전자(미국특허 제5589621호), 땅콩과 포도의 스틸벤 신타아제 유전자(미국특허 제5834268호, 제5689047호 및 제5689046호)를 확보하여 형질전환 식물을 생산하기 위한 시도도 이루어진 바 있다.

적포도주에 레스베라트롤이 함유되어 있다든가 (Siemann & Creasy, 1992) 레스베라트롤이 심장병 및 암에 대한 예방효과가 있다 (Pace-Asciak 등, 1995; Jang 등, 1997)는 보고는 적포도주가 전 세계적으로 관심을 끌게된 계기가 되었다.

레스베라트롤의 생리적 기능은 1998년 이후 극히 활발하게 그 연구가 전개되었기에 그 이전에는 이러한 증폭기술이 알려지지도 않았고 시도되지도 않았다. 그러나, 최근 레스베라트롤의 항암효과가 알려지면서 세인의 주목을 끌게 되었고 그 함량을 인위적으로 증폭시킬려는 시도가 이루어지게 되었다.

본 발명자들은 상기와 같은 점들을 감안하여 안출한 것으로 포도 유래의 천연 항암물질인 레스베라트롤의 함량을 증폭하기 위하여 레스베라트롤의 합성을 특이적으로 유도하는 균주를 분리·동정하고, 포도의 최적 재배조건 및 수확시기를 설정하고, 상기 균주를 상기 최적 재배조건하에서 재배되고 최적 수확시기에 수확된 포도에 인위적으로 접종하여 레스베라트롤이 다량 함유된 레스베라트롤 강화 포도 및 이를 이용한 기능성 식품을 생산한 후 이들에 대한 레스베라트롤의 함량을 측정함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 포도 유래의 천연 항암물질인 레스베라트롤이 다량 함유된 레스베라트롤 강화 포도, 이를 이용한 다양한 기능성 식품 및 그 생산방법를 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은 포도의 표피에 자생하는 진균류로부터 8종의 진균류를 1차 분리하여 포도에 접종한 후 상기 균주들 중에서 레스베라트롤을 가장 많이 생성하는 균주를 분리·동정하고, 포도내 레스베라트롤의 함량이 최대가 되는 최적 재배조건 및 수확시기를 설정하고, 상기 최적 재배조건하에서 재배되고 최적 수확시기에 수확된 포도에 상기 균주를 인위적으로 접종하여 레스베라트롤이 다량 함유된 레스베라트롤 강화 포도를 생산하고, 상기 레스베라트롤 강화 포도를 이용한 기능성 식품, 즉 포도주 또는 환제제를 생산함으로써 달성하였다.

도 1은 HPLC로 측정한 본 발명의 레스베라트롤 강화 포도내 레스베라트롤의 함량을 나타낸 그래프,

도 2는 포도 종류에 따른 플라스모파라 비티콜라 감염시 레스베라트롤의 합성 유도에 의한 레스베라트롤 함량의 증폭현상을 나타낸 그래프,

도 3은 생장기간에 따른 포도내 레스베라트롤의 전이를 나타낸 그래프,

도 4는 수확시기에 따른 포도내 레스베라트롤 함량을 나타낸 그래프,

도 5는 포도에서 레스베라트롤의 합성을 유도하는 신규한 균주 플라스모파라 비티콜라의 사진도이다.

이하, 본 발명은 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 포도에서 레스베라트롤의 생성을 유도하기 위한 균주의 분리 및 동정

포도에서 레스베라트롤의 생성을 자극·유도하는 진균류를 분리하기 위하여수확된 포도를 10℃의 암실에 방치한 후 포도의 표피에 자생하는 곰팡이를 분리하였다. 오염된 곰팡이의 포자를 5㎖의 생리식염수에 현탁한 후, PDA(potato dextrose 2.4%, agar 1.8%) 배지에 도말하고, 생성된 균체들로부터 8종류의 진균류를 순수분리하였다. 상기 각 균주를 포도에 접종하여 레스베라트롤 합성을 유도한 후 레스베라트롤 함량이 가장 많은 포도에 기생하는 균주를 생명공학연구소 부설 유전자은행에 의뢰하여 동정한 결과 플라스모파라 비티콜라(Plasmopara viticola)로 동정되었다.

실시예 2 : 레스베라트롤의 인위적 합성 유도

포도 껍질에 상처를 내고 상기 균주 플라스모파라 비티콜라를 접종한 후 10℃에서 2주간 배양하면서 주기적으로 레스베라트롤의 생성변화를 검토하였다. 상기 균주로 감염된 포도 30g을 마쇄한 후 에틸 아세테이트 가용성분을 추출하고, 에탄올에 용해시킨 후 레스베라트롤 함량을 HPLC로 측정하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.

분리된 균주의 포자를 포도알과 가지 사이에 접종하거나 PD(potato dextrose 2.4%) 배지에서 20℃에서 24시간 동안 종배양하여 그 배양액을 포도에 산포하였다. 접종 후 4℃∼20℃까지 온도차를 두고 배양하면서 레스베라트롤의 함량변화를 주기적으로 측정하였다. 또, CO₂와 N₂가스의 충진하에서도 레스베라트롤의 생합성 변화를 관찰하였다. 플라스모파라 비티콜라 접종에 의한 레스베라트롤 함량(mg/kg)을하기 표 1에 나타내었다.

플라스모파라 비티콜라 접종에 의한 레스베라트롤 함량 ^* (mg/kg) 증폭

	상처 접종	산포접종
	대조구	14일후	대조구	14일후
켐벨	0.2	1.8	0.8	2.3
거봉	0.3	4.5	0.8	3.5
MBA^**	1	13(다습)	1.2	5.3(건조)

* : 레스베라트롤 함량(mg/kg)의 증폭

** : 접종후 다습한 곳 또는 건조한 곳에 저장

상기 표 1에서 알 수 있는 바와 같이, 켐벨(Campbell Early)이나 거봉(Kyoho)의 경우 산포접종시나 상처접종시 접종방법에 따른 차이는 크게 나타나지 않았으나, MBA(Muscat Bailey A)의 경우에는 습한 곳에 두어 곰팡이가 많이 증식된 경우 레스베라트롤의 함량이 현저히 증가하였다.

실시예 3 : 재배 포도의 레스베라트롤(트랜스-레스베라트롤) 함량 측정

경북 경산 지역에서 1998년 가을에 수확한Vitis labruscanaB에 속하는 'MBA' 및 '세리단(Sheridan)'의 레스베라트롤 함량은 6.1mg/kg 이었다. 본 발명에서 레스베라트롤이라함은 트랜스-레스베라트롤(trans-resveratrol)을 의미한다. 상기 트랜스-레스베라트롤의 구조를 하기 화학식 1에 나타내었다.

포도 부위별 레스베라트롤의 함량을 분석한 결과, 포도껍질에는 5.3mg/kg, 과육에서는 거의 검출되지 않았고, 씨앗속에는 미량 존재하였다. 따라서, 레스베라트롤은 대부분 껍질에 존재함을 알 수 있었다.

실시예 4 : 포도주의 트랜스-레스베라트롤 함량 측정

국내산 포도를 발효시켜 100% 적포도주로 제품화한 '영농법인 경상포도조합' (경북 경산시 유곡동 소재)의 상품명 "노을와인" 1998년산내 트랜스-레스베라트롤 함량은 3.3mg/ℓ이었으며, 시판되는 외국산 적포도주 중 프랑스산 적포도주의 트랜스-레스베라트롤 함량은 대체로 높아 어떤 것은 "노을와인"의 함량보다 높고 어떤 경우는 낮았다. 미국산과 이태리산은 상대적으로 아주 낮았으며 그 분석 결과는 이미 보고된 결과와 크게 다르지 않았다[D. M. Goldberg 등, A global survey oftrans-resveratrol concentrations in commercial wines. Am. J. Enol. Vitic. (1995) 46, 159-165]. 대부분의 외국산 적포도주에 함유된 레스베라트롤의 농도는 1.04∼1.64mg/ℓ, 프랑스산은 2.88∼4.39 mg/ℓ, 일본산은 1.04 mg/ℓ 정도이었다. 상기 포도주내 레스베라트롤 함량 분석결과를 하기 표 2에 보다 자세하게 기재하였다.

포도주내 레스베라트롤 함량(mg/ℓ) 분석결과

제품명	국가	제조년도	레스베라트롤	참고
깔라리까버넷	칠레	1999	1.2
아방가르데	독일	〃	극미량	백포도주
케덤콩코드	USA	1999	0.2
Plam Veneyards	〃	1994	0.6
Kenwood	〃	〃	1.2
1992카버네쇼비뇽	〃	1992	0.6
래스베리	이탈리아	〃	0.3
란셀로타	〃	1999	1
끼안띠클라씨	〃	〃	1.6
Verazzano Chianti	〃	1996	2
Chianti	〃	1996	2.7
로휠드보르도	프랑스	〃	0.5
보졸레	〃	〃	0.9	수입국산
쌩에스터페레드	〃	1994	1.1
꼬뜨드루베론	〃	1998	1.1
마주앙보졸레	〃	〃	1.2
밀리엄레드	〃	1999	1.6	수입국산
알록스꼬동	〃	1996	2.1
말르상까버네	〃	〃	2.2
말르쌍보졸레	〃	〃	2.7
보르도cordier	〃	1999	2.8
샤또삐뇽	〃	1994	3.4
샤또아띠그아르노	〃	1994	5
Jacobs Creek	호주	1998	1
Coonawarra	〃	1996	2.2
Majuang Rioja	스페인	1995	1.1
국내산포도주 A	한국	1998	3.3	국내산
국내산포도주 B	〃	1999	3.25	국내산
국내산포도주 C	"	1999	0.24	국내산
국내산포도주 D	"	1999	1.26	국내산

실시예 5: 포도에서의 레스베라트롤 증폭요인분석

레스베라트롤 고함유 포도주의 생산은 원료 포도내 레스베라트롤의 다량함유가 필수적이므로 포도의 단맛의 지표인 당도(sugar degree-brix)와 함께 포도종류별 함량차이, 생장주기별 천이도, 포도의 재배조건 및 부위별 분포 등을 검정하였다. 포도종류별 시료로는 현재 포도농가에서 주로 재배되고 있는 켐벨, 거봉, 세리단, MBA 및 경산포도시험장에서 재배되는 시험종을 사용하였다.

포도 종류별 레스베라트롤의 함량은 거봉이 가장 높았고, MBA가 그 다음이었으며, 세리단과 켐벨은 훨씬 더 낮은 수준이었다(도 2). 생장주기별로는 성숙초기에는 잎에서 고농도로 검출되었으나(50mg/kg) 성숙이 진행됨에 따라 점차 열매로 레스베라트롤 성분이 전이됨을 알 수 있었다(도 3). 재배 조건별로는 거봉의 경우 비닐하우스 또는 야외에서 재배한 경우 약 2mg/kg으로 큰 차이는 없었으나 봉지를 싼 경우는 현저하게 그 함량이 줄어듦을 알 수 있었다. 특히, MBA및 세리단의 경우, 레스베라트롤은 수확시기 중 특정 시기에서 그 함량이 절정에 달하였으나 그 이후부터는 다시 감소하였으며, 상대적으로 당도는 지속적으로 증가하였다(도 4). 상기 결과로 알 수 있는 바와 같이, 레스베라트롤이 다량 함유된 포도를 수확하는 요인으로 적절한 수확시기를 결정하는 것이 매우 중요함을 알 수 있었다.

실시예 6 : 항암성 포도 및 포도주에서의 레스베라트롤 함량 측정

수확된 포도 50g을 유수(流水)에 세척하고, 풍건(風乾)하고, 마쇄한 후 포도중량과 동일한 양의 에틸 아세테이트 가용성분을 2-3회 추출하고, 감압 농축하였다. 농축된 시료에 포도 중량의 1/10의 메탄올 가용성분을 회수하고, 여과하여 HPLC에서 레스베라트롤의 함량을 정량하였다.

포도주의 경우에는 시료가 되는 포도주를 50㎖ 취하여 1N NaOH로 적정하여pH 7.0으로 조정한 후, 저온에서 함유된 에탄올을 감압 휘발시키고, 에틸 아세테이트 30㎖를 가하여 가용성분을 3회 반복 추출하였다. 레스베라트롤이 함유된 에틸 아세테이트 가용획분을 감압 농축한 후, 유효성분을 5㎖의 메탄올에 전이시켰다. 가드 컬럼(Guard column)이 장착된 C18 리버스 컬럼(C18 reverse column)에 아세토니트릴 22% 및 물 78%의 혼합 용액을 0.4㎖/min의 유속으로 가하면서 메탄올 검액 10㎕를 주입하고, 305nm에서 레스베라트롤을 검출한 후 피크의 면적을 계산하여 그 함량을 정량하였다. 레스베라트롤 성분의 동정은 LC-mass로 확인하였다. 포도 및 포도주에 존재하는 레스베라트롤의 함량은 시스-레스베라트롤, 트랜스-레스베라트롤, 카테킨(catechin) 및 루틴(rutin) 등과 같은 페놀성 생리활성물질의 정확한 양을 측정할 수 있는 역상 HPLC 방법으로 측정하였으며, 레스베라트롤의 확인은 LC-mass로 하였다.

실시예 7: 레스베라트롤 강화 포도의 생산

(1)수확된 포도를 10∼15℃의 암실에 하루 동안 저장한 후, 분리된 균주 플라스모파라 비티콜라의 포자 현탁액을 상기 포도송이에 접종하여 2주 동안 배양한 후 균사가 형성되는 단계에서 저장을 중지하는 방법, (2)분리된 균주의 포자현탁액을 포도알과 가지 사이에 접종하거나 PD 배지에서 20℃에서 24시간 동안 종배양한 후, 이 배양액을 포도에 산포하는 방법, (3)접종 후 레스베라트롤의 함량변화를 주기적으로 측정하여 그 함량이 가장 높은 경우에 배양을 중지하는 방법 중 어느 한 방법으로 레스베라트롤 강화 포도를 생산하였다.

실시예 8 : 천연 항암물질인 레스베라트롤을 다량 함유하는 포도환제제의 생산

상기 실시예 7의 방법 중 어느 한 방법으로 처리한 포도의 껍질을 분리한 후 액체 질소에 침적 고화된 상태에서 마쇄하여 2∼3일 동안 풍건하였다. 이때, 감압건조를 실시함으로써 더 우수한 효과를 얻을 수 있었다. 그후, 건조된 분말에 유당을 가한 후 환제제를 제조하는 통상의 방법에 따라 포도환제제를 제조하였다.

이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명의 방법으로 생산한 레스베라트롤 강화 포도 및 이를 이용한 기능성 식품은 천연 항암물질인 레스베라트롤을 제품내 다량 함유하고 있어 항암효과가 우수하므로, 상기 레스베라트롤 강화 포도 및 그 생산방법은 기능성 식품가공 산업상 매우 유용한 발명인 것입니다.

Claims

포도 유래의 천연 항암물질인 레스베라트롤의 합성을 유도함을 특징으로 하는 포도에서 분리한 신규한 플라스모파라 비티콜라(Plasmopara viticola).
포도 유래의 천연 항암물질인 레스베라트롤의 합성을 유도하는 포도에서 분리한 신규한 플라스모파라 비티콜라(Plasmopara viticola)를 수확된 포도에 접종하여 포도내 레스베라트롤의 함량을 증폭시킴을 특징으로 하는 레스베라트롤 강화 포도의 생산방법.
포도 유래의 천연 항암물질인 레스베라트롤의 합성을 유도하는 포도에서 분리한 신규한 플라스모파라 비티콜라(Plasmopara viticola)를 수확된 포도에 접종하여 포도내 레스베라트롤의 함량을 증폭시킨 레스베라트롤 강화 포도.
포도 유래의 천연 항암물질인 레스베라트롤의 합성을 유도하는 포도에서 분리한 신규한 플라스모파라 비티콜라(Plasmopara viticola)를 수확된 포도에 접종하여 포도내 레스베라트롤의 함량을 증폭시킨 레스베라트롤 강화 포도를 이용한 기능성 식품인 천연 항암성 포도환제제.