JP6705909B2 - ブドウの木の組織の細胞培養からステビオシドを用いてビニフェリンを大量生産する方法 - Google Patents
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Description
本発明においては、代表的な市販のブドウ品種であるキャンベル(Vitisvinifera L. cv Campbell Early)からカルスを誘導した。キャンベルの花を切り取って流水で洗浄し、その後70%のエタノール溶液に1分間浸漬して表面殺菌を行った。表面殺菌は、クリーンベンチ内でブドウの花組織をガラス瓶に入れて市販の漂白剤(約1%の次亜塩素酸ナトリウム)溶液で15分間行い、滅菌蒸留水で3回洗浄した。表面殺菌が完了した組織は、滅菌濾紙を用いて残存する湿気を除去して培養に用いた。表面殺菌が完了したブドウ組織をメスで切り取り、その後それぞれの組織(花弁、葯、花糸)を培養培地に置床した。ブドウカルスの誘導に用いた培地を表1に示す。生長調節剤として0.1mg/LのIAA、0.1mg/LのNAA、1.5mg/Lの2,4−D、及び0.25mg/Lのカイネチンが添加された培地を用いた。培養条件は、25℃の恒温器における暗培養とした。培養後に形成された白色のカルスは、同一組成の固体培地に約4週間間隔で継代培養した。
ブドウカルスからレスベラトロール生産システムを確立するために、前記実施例1で誘導されて安定化したブドウカルスの液体培養により転写発現の分析を行った。1mg/Lの2,4−Dが含まれるMS(ムラシゲ・スクーグ)培地ともいうMS1D(MS4.4g、スクロース30g、MES 0.5g、ミオイノシトール0.1g、チアミンHCl 0.4mg、2,4−D 1mg/L)液体培地で25℃、90rpmで7日間培養し、その後活性誘導剤で処理して24h経過したブドウカルスから総RNAを分離した(非特許文献2)。分離した総RNA(5μg)は、一本鎖cDNA合成キット(First-Strand cDNA Synthesis Kit;Fermantas社、カナダ)を用いて、説明書に従ってcDNAを合成した。合成したcDNA(20μl)を2.5倍に希釈し、その後2μlを鋳型とし、ブドウカルスにおいてレスベラトロール及びプテロスチルベン生合成関連遺伝子を対象にRT−PCRを行った。PCR増幅は、94℃で2分間の変性、95℃で30秒間、50℃で40秒間、72℃で1分間を1サイクルとして25サイクル、及び72℃で10分間の最終延長反応により行われた。本実験のために用いたブドウレスベラトロール、プテロスチルベン生合成遺伝子及びブドウアクチンRT−PCR用プライマーは次の通りである。
STS−F:5'−ATGGCTTCAGTTGAGGAAATCAGA−3'(配列番号1)
STS−R:5'−TTAATTTGTCACCATAGGAATGCTA−3'(配列番号2)
ROMT−F:5'−ATGGATTTGGCAAACGGTGTGA−3'(配列番号3)
ROMT−R:5'−TCAAGGATAAACCTCAATGAGGGA−3'(配列番号4)
ACTIN−F:5'−TGCTGACAGAATGAGCAAGG−3'(配列番号5)
ACTIN−R:5'−TACTAAGAAGCTTTCAACCCAGTATA−3'(配列番号6)
前記実施例2で選択した活性誘導剤(100μMのMeJA)を用いてスチルベン化合物生産を誘導した。20mlのMSに2gのブドウカルスを接種してから125mlフラスコで7日間培養し、その後100μMのMeJAで処理して5日後にブドウカルスを確保した。抽出してHPLC分析を行った結果、ブドウカルス内で微量のピセイド(piceid)が確認されており(データ未提示)、ステビオシド処理により生産されたスチルベン化合物を可溶化して生産率を高める実験を行った。前述したように、ブドウカルスを7日間培養した培養液を5mM、10mM、25mM、50mMのステビオシドで濃度別に処理するか、100μMのMeJAと共に濃度別に処理し、培養5日後に試料をフィルターで濾過してカルスとカルス培養液に分離した。分離したカルスは、フィルターで濾過して脱水作業を行い、液体窒素で凍らせ、その後抽出するまで−80℃で保管して用いた。カルス培養液試料は、保管期間をおかずにすぐに抽出して用いた。
前記実施例3の結果に基づいて、ブドウカルス懸濁培養時のp−クマル酸及びレスベラトロールを基質として用いて生物変換を試みた。まず、100μMのMeJAと50mMのCD−Mに基質を入れていないものを対照区とし、2mMのp−クマル酸及びレスベラトロールを基質として処理したものを実験区としてそのパターンを確認した(図4A)。その結果、基質を入れた場合、レスベラトロール以外にパリドール(Pallidol)、パルテノシッシンA(Parthenocissin A)、クアドラングラリンA(Quadrangularin A)及びδ−ビニフェリンが生産された(図4A)。次に、100μMのMeJAと50mMのステビオシド(E95)に基質を入れていないものを対照区とし、2mMのp−クマル酸及びレスベラトロールを基質として処理したものを実験区としてそのパターンを確認した(図4B)。その結果、基質で処理していない対照区と同様に、基質で処理した実験区においてδ−ビニフェリンが多く生産されることが確認された。これらの結果から、ステビオシドをブドウカルス懸濁培養時の可溶化剤として用いるとδ−ビニフェリンを生産するのに非常に効果的であることが確認された(図4)。
前記実施例1で安定化したブドウカルスを100mlのMS1D液体培地に10gずつ3つのフラスコにそれぞれ接種し、その後25℃、90rpmで14日間培養した。14日間培養して増殖したカルスを予め滅菌して乾燥させた3Lバイオリアクターに全て継代し、その後1.2LのMS1D液体培地を追加した。前記実施例3と同様に、100μMのMeJAと共に50mMのステビオシドで処理し、培養5日後に試料をフィルターで濾過してカルスとカルス培養液に分離した。分離したカルスは、フィルターで濾過して脱水作業を行い、液体窒素で凍らせ、その後抽出するまで−80℃で保管して用いた。カルス培養液試料は、保管期間をおかずにすぐに抽出して用いた。カルス培養液抽出物をHPLC分析した結果、ε−ビニフェリン及びδ−ビニフェリンが生産されることが確認された(図5)。
前記実施例3、4及び5で分離したブドウカルスは、液体窒素を用いて粉末化した。前記カルス粉末1gを3mlの80%メタノールで抽出し、その後遠心分離することにより上層部のカルス抽出物を得た。抽出した濾液に空気(air)を注入して乾燥させ、乾燥物を600μlの80%メタノールに溶解し、0.2μmのPTFEフィルター(親水性、アドバンテック社、日本)で濾過してHPLC分析に用いた。10mlのカルス培養液は、同量の酢酸エチルにより水と酢酸エチルで分配抽出して得られた酢酸エチル層に空気を注入して乾燥させた。乾燥物を1mlの80%メタノールに溶解し、0.2μmのPTFEフィルターで濾過してHPLC分析に用いた。HPLCは、アジレント・テクノロジー社の1200シリーズを用いて分析した。ポンプシステムには、クォータナリポンプ(quaternary pump)を用い、カラムには、アジレント社のZORBAX SB−18(5mm、4.6×150mm)を用い、移動相には、水(A、0.05%トリフルオロ酢酸)とアセトニトリル(B、0.05%トリフルオロ酢酸)を用いて傾斜溶離で分析を行った。前記ブドウカルスを7日間培養した培養液を100μMのMeJAと5mM、10mM、25mM、50mMのステビオシドで濃度別に処理した結果、低い濃度から高い濃度にステビオシドで処理した場合、濃度が高くなるにつれてスチルベン含有量が増加する様相を示し、50mMで最も高いスチルベン化合物含有量が確認され(データ未提示)、ステビオシドで処理していない処理区に比べて、はるかにスチルベン化合物含有量が増加することが観察された(図3)。ステビオシドで処理していない処理区及びカルス抽出物においては、スチルベン化合物が確認されなかった。
前記実施例3で準備した可溶化剤処理ブドウ葯由来のカルス培養液を水と酢酸エチルで分配抽出して得られた酢酸エチル層を減圧濃縮した。得られた濃縮物(15g)をMPLC機器で逆相カラム(10×30cm)にて1段階分離した。ここで、溶離溶媒としては水−アセトニトリルを用い、水−アセトニトリル混合溶液を100:1から100%アセトニトリルまで極性を低くしながら溶離させることにより、7つの分画物(A〜G)を得た。目標化合物であるδ−ビニフェリン(trans-δ-viniferin、下記化学式1)が多量に含まれる分画Cを濃縮して濃縮物1.3gを得た。得られた濃縮物1.3gにRecylcing LC機器で逆相カラムクロマトグラフィーを水−アセトニトリル(2:2)混合溶媒条件で行い、80%以上の純度のδ−ビニフェリン160mgを得た。得られた分画物を95%メタノールで溶離させるゲルクロマトグラフィー(Sephadex LH-20)を行い、98%の純度のδ−ビニフェリン12mgを得た。得られた化合物の構造は、1H−NMR、13C−NMR、2D−NMR、DEPT及び質量分析器を用いて解明した。
trans−δ−ビニフェリン:1HNMR(500MHz、アセトン−d6)d 7.45(dd、J=8.5、2.0Hz、H−6)、7.27(s、H−4)、7.25(d、J=8.5Hz、H−2,6A)、7.07(d、J=16.5Hz、H−2´)、6.92(d、J=16.5Hz、H−1´)、6.88(d、J=8.1Hz、H−7)、6.86(d、J=8.5Hz、H−3,5A)、6.55(d、J=2.0Hz、H−2,6C)、6.29(t、J=2.0Hz、H−2B)、6.27(t、J=2.0Hz、H−4C)、6.21(d、J=2.0、H−4,6B)、5.47(d、J=8.0Hz、H−2)、4.48(d、J=8.0Hz、H−3);13CNMR(125MHz、アセトン−d6)d 159.7(C−7a)、158.8(C−1,3B)、158.6(C−3,5C)、157.5(C−4A)、144.3(C−5B)、139.8(C−1C)、131.6(C−3a)、131.2(C−1A)、130.8(C−5)、128.2(C−2´)、127.7(C−6)、127.6(C−2,6A)、126.3(C−1´)、123.0(C−4)、115.2(C−3,5A)、109.2(C−7)、106.4(C−4,6B)、104.7(C−2,6C)、101.8(C−4C)、101.4(C−2B)、93.1(C−2)、56.9(C−3)。
前記実施例5で準備した可溶化剤処理ブドウ葯由来のカルス培養液を水と酢酸エチルで分配抽出して得られた酢酸エチル層を減圧濃縮した。得られた濃縮物(10g)をMPLC機器で逆相カラム(10×30cm)にて1段階分離した。ここで、溶離溶媒としては水−アセトニトリルを用い、水−アセトニトリル混合溶液を70:1から100%アセトニトリルまで極性を低くしながら溶離させることにより、5つの分画物(A〜E)を得た。目標化合物であるε−ビニフェリン(trans-ε-viniferin、下記化学式2)が多量に含まれる分画Bを濃縮して濃縮物1.5gを得た。得られた濃縮物1.5gにRecylcing LC機器で逆相カラムクロマトグラフィーを水−アセトニトリル(2:1)混合溶媒条件で行い、85%以上の純度のε−ビニフェリン100mgを得た。得られた分画物を95%メタノールで溶離させるゲルクロマトグラフィー(Sephadex LH-20)を行い、98%の純度のε−ビニフェリン30mgを得た。得られた化合物の構造は、1H−NMR、13C−NMR、2D−NMR、DEPT及び質量分析器を用いて解明した。
trans−ε−ビニフェリン:1H−NMR(400MHz、MeOD)d 7.14(2H、d、J=8.0Hz、H−2(6)a)、7.03(2H、d、J=8.0Hz、H−2(6)b)、6.80(1H、d、J=13.6Hz、H−7b)、6.78(2H、d、J=8.0Hz、H−3(5)a)、6.65(2H、d、J=8.0Hz、H−3(5)b)、6.56(1H、d、J=13.6Hz)、6.28(1H、brs、H−12b)、6.21(1H、brs、H−12a)、6.18(2H、brs、H−10a,14a)、5.37(1H、d、J=8.0Hz、H−7a)、4.35(1H、d、J=4.0Hz、H−8a);13C−NMR(100MHz、MeOD)d 161.3(C−11b)、158.6(C−11a,13a)、158.3(C−13b)、157.1(C−4a)、156.9(C−4b)、146.0(C−9a)、135.6(C−9b)、132.5(C−1a)、129.1(C−1b,7b)、127.5(C−2(6)b)、127.0(C−2(6)a)、122.4(C−8b)、118.8(C−10b)、115.1(C−3(5)b)、115.1(C−3(5)a)、106.3(C−14a,10a)、103.1(C−14b)、101.0(C−12a)、95.6(C−12b)、93.5(C−7a)、56.9(C−8a)。
前記実施例1で誘導されたブドウカルスからレスベラトロール及びδ−ビニフェリンをそれぞれ主に生産するために、異なる条件で物質生産を誘導した。1mg/Lの2,4−Dを含むMS(ムラシゲ・スクーグ)培地100mlに10gのブドウカルスを接種し、その後25℃にて90rpmで6日間培養した。これを25mlずつ分注して24時間同一条件で培養し、その後100μMのMeJA及び50mMのステビオシドでそれぞれ処理し、25℃での静置培養又は90rpmの2つのグループに分けて5日間培養した。その後、前記実施例6の方法で物質を抽出してHPLC分析に用いた。培養速度条件を異なる条件にした結果、静置培養した試料においては、レスベラトロールがδ−ビニフェリンに比べてはるかに多く生成されることが確認され、振盪培養した試料においては、δ−ビニフェリンがレスベラトロールに比べてはるかに多く生成されることが確認された(図6)。
Claims (7)
- (a)ブドウの木の組織切片をカルス誘導培地に置床してブドウの木のカルスを誘導するステップと、
(b)前記誘導したブドウの木のカルスを増殖培地で培養して増殖するステップと、
(c)前記増殖したカルスにジャスモン酸メチル(methyl jasmonate)及びステビオシド(stevioside)を添加して振盪培養するステップとを含む、ブドウの木由来のビニフェリン(viniferin)を大量生産する方法。 - 前記ジャスモン酸メチル及びステビオシドは、それぞれ50〜350μM及び40〜60mMの濃度で添加することを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- 前記ビニフェリンは、δ−ビニフェリン又はε−ビニフェリンであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- ジャスモン酸メチル(MeJA)及びステビオシド(stevioside)を有効成分として含有する、ブドウの木のカルスからビニフェリンを大量生産するための組成物。
- 50〜350μMのジャスモン酸メチル及び40〜60mMのステビオシドであることを特徴とする、請求項4に記載の組成物。
- (a)ブドウの木の組織切片をカルス誘導培地に置床してブドウの木のカルスを誘導するステップと、
(b)前記誘導したブドウの木のカルスを増殖培地で培養して増殖するステップと、
(c)前記増殖したカルスにジャスモン酸メチル(MeJA)及びステビオシド(stevioside)を添加して静置培養するステップとを含む、ブドウの木由来のレスベラトロール(resveratrol)を大量生産する方法。 - 前記静置培養は、24〜26℃にて4〜7日間静置培養することを特徴とする、請求項6に記載の方法。
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