KR20110003887A

KR20110003887A - 배추속의 형성층 또는 전형성층 유래 식물줄기세포 및 이의 분리방법

Info

Publication number: KR20110003887A
Application number: KR1020090061368A
Authority: KR
Inventors: 유영미; 진영우; 이은경; 홍선미
Original assignee: 주식회사 운화
Priority date: 2009-07-06
Filing date: 2009-07-06
Publication date: 2011-01-13

Abstract

본 발명은 배추속(genus Brassica)의 형성층 또는 전형성층 유래 줄기세포 및 그 분리방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 배추속의 형성층 및 전형성층 유래 줄기세포는 탈분화과정 없이 미분화상태로 분리되어 장기 배양시에도 세포생장률과 생장 패턴에 변이 없이 안정적으로 유지되어 대량 배양이 가능한바, 배추속 식물 유래의 유용물질 생산에 유용하다.

배추속, 식물줄기세포, 형성층, 전형성층

Description

배추속의 형성층 또는 전형성층 유래 식물줄기세포 및 이의 분리방법{Plant Stem Cell Derived from Cambium or Procambium of Genus Brassica and Method for Isolating the Same}

본 발명은 배추속의 형성층 또는 전형성층 유래 줄기세포 및 그 분리방법에 관한 것이다.

식물은 과거 식량 자원의 의미였으나, 현재에는 약제, 향료, 색소, 농약, 염료 등을 포함한 광범위한 화학물질의 공급원으로서 그 의미가 확대되고 있다. 특히, 식물 유래 유용 물질의 대부분은 항바이러스, 항박테리아, 항암, 항산화 능력 등의 생리 활성이 있어, 신의약품으로서 발전가능한 이상적인 자원으로 주목받고 있으며, 많은 식물 유래 물질들의 화학 구조와 활성 사이의 관계를 규명하기 위한 연구들이 활발히 진행되고 있다.

그러나, 생리 활성 물질은 의약품으로 개발하기 어려운 실정이며, 그 주된 이유는 다음과 같다. 첫째, 식물 내 생리 활성 물질의 함량이 극히 제한적이다. 둘째, 식물의 생장 속도는 매우 느리다. 셋째, 식물 유래 생리 활성 물질은 식물의 특정 기관 내에만 소량 존재한다. 넷째, 자연 훼손이라는 환경 문제가 연루되어 있다. 다섯째, 식물 유래 생리 활성 물질의 경우 화학적인 구조가 매우 복잡하여, 다단계 중합 과정이 요구되어 생산 비용이 매우 높은 경제적인 문제가 있다. 따라서, 식물 유래 생리활성 물질들을 상업적으로 안정적으로 공급하기 매우 어려웠다.

그런데, 생물공학기법의 하나인 식물 세포 배양 방법은 환경문제를 유발시키지 않으면서도 식물 유래 유용물질을 안정적으로 공급할 수 있는, 가장 이상적인 기술로 오랫동안 평가받고 있다. 대한민국 공개특허 1995-0000870 (1995. 01. 03)에 따르면 식물 세포 배양에 의한 유용물질의 생산은 식물에서 직접적인 추출에 의한 방법보다 수많은 장점이 있다. 특히, 기존의 추출법과는 달리, 외부 환경의 영향을 받지 않고도 지속적인 생산이 가능하여, 생태계 파괴와 같은 현안 문제들을 해결할 수 있는 최적의 방법으로 여겨지고 있다. 그러나, 식물 세포 배양에 대한 많은 관심과 노력에도, 산업화에 성공한 예는 아직까지 극히 일부에 불과한 실정이다. 이는 다수의 식물 세포 배양에서 세포 증식과 생산성의 변이가 주요 문제로 여전히 남아있기 때문이다.

식물 발현 시스템에 식물 세포를 이용하는 경우, 식물 세포의 분화 조직, 예컨대 잎, 줄기, 종자 등은 분열능이 상실된 영구 조직이므로, 분열능을 가진 세포주로 전환시키기 위해 탈분화 과정이 필수적으로 선행되고 있다. 상기 탈분화 과정은 식물체의 한 조직이나 기관을 이용하여 배양하였을 때 그 조직이나 세포가 이미 특정 기능을 수행하도록 분화된 상태를 해체하는 것을 의미한다. 그러나, 이러한 탈분화 과정 중에 염색체 변이에 의해 세포주의 심각한 변이가 발생될 수 있다.

특히, 식물 세포 배양을 통한 유용물질의 생산은 장기간의 배양기간 동안 빠른 세포 증식과 높은 대사물질 생산능이 안정적으로 유지되어야만 산업화가 가능하지만, 대부분의 세포주는 계대 배양에 의해 본래와는 다른 수많은 변이를 접하게 된다. 따라서, 이와 같은 변이 문제점을 극복하여, 식물 세포 배양을 통한 유용물질 생산에서 유전적으로 안정한 세포주를 획득하기 위한 방안이 절실한 실정이었다.

한편, 형성층은 세포분열이 가장 활발하게 일어나는 분열조직으로써 식물조직배양의 절편체로 사용 시 세포의 고속 및 대량생산이 가능하다고 보고되어 있다(대한민국 등록특허 제 0533120호). 이러한 형성층의 구조와 미세 구조에 대한 연구는 재료가 가진 고유의 기술적 어려움 때문에 천천히 진행되었는데, 형성층은 몇 개의 좁고 신장되고 얇은 벽의 세포층으로 구성되어 있어서 추출 동안 쉽게 손상됨이 보고된 바 있으며 또한, 고도로 액포화된 활성적인 분열조직 세포들(highly vacuolated active meristematic cells)은 전자현미경을 사용하는 전통적인 방법이나 단백질, RNAs, 다른 분자들의 in situ localization을 연구하기 위해 최근에 완성된 기술로도 적절히 고정하기 어렵다고 보고되었다(Lachaud Suzanne et al ., Life science , 633, 1999).

이외에도 연속적인 형성층의 기계적인 sectioning은 널리 사용되지 못했는데 이것은 형성층 세포의 길이가 길고 벽이 얇다는 기술적인 어려움 때문으로 판단된다. 많은 연구들에서 형성층 세포의 모양과 크기와 배열은 2기 유관속 조직의 구조 가 형성층을 반영한다는 가정 아래 형성층 유도체들의 구조를 바탕으로 간접적으로 특징지어졌다고 보고되었다(Kitin P et al., Ann . Bot ., 86:1109, 2000). 즉, 다양한 분야의 연구를 위해 직접적으로 형성층을 재료로 사용하는데 많은 어려움이 있음이 여러 연구들에서 제시되고 있다.

이에 본 발명자 중 일부는 식물의 줄기에서 채취한 형성층만을 이용하여 캘러스를 유도한 방법을 개발한 바 있으나 (대한민국 등록특허 제0533120호), 이 등록특허는 단순히 목본 식물의 줄기 형성층을 이용하여 캘러스를 유도하였을 뿐이었다. 캘러스(Callus)란 탈분화가 일어나 형성된 조직인 바, 이에 상기 등록특허는 여전히 탈분화에 의한 변이 문제를 보류하고 있는 문제점이 있었다. 또한, 본 발명자 중 일부는 탈분화에 의한 변이의 문제를 해결하고 안정적으로 증식이 가능한 유전적 안정성이 높은 세포주의 제공방법으로서 국제특허출원 PCT/KR 2006/001544호의 발명을 개발한 바 있다.

한편, 최근 웰빙 추세와 함께 주목받고 있는 채소가 십자화과에 속하는 브로콜리인데, 최근 서양은 물론 국내에서도 소비량이 증가되고 있는 실정이다. 브로콜리에는 항산화물질로 알려진 ascorbic acid, β-carotene, rutin, selenium, glutathione, quercetin 등이 다량 함유되어 있으며, 암세포 증식억제 및 해독효소의 유도효과가 크다고 알려져 많은 연구가 진행되고 있다 (Kim 등, J. Korean Soc . Food Sci . Nutr . 28:1201, 1999). 특히 브로콜리에는 신체의 자연치유력을 증강시켜 암 발생의 위험성을 줄여주는 물질인 sulforaphane (S-methylsulfinylbuty isothiocyanate)가 함유되어 있다고 알려져 있는데, sulforaphane는 최근 연구에서 발암물질로 전 처리한 생쥐의 유선에서 종양발생을 억제하고, 전립선암의 예방에도 유효한 것으로 보고되었다. 이에 이러한 십자화과 배추속에 속하는 식물인 브로콜리로부터 탈분화에 의한 변이의 문제를 해결하고 안정적으로 증식이 가능한 유전적 안정성이 높은 세포주를 획득하는 것이 요청되었다.

이에 본 발명자는 배추속 식물의 형성층 또는 전형성층 유래 동질적인 세포주를 분리함으로써 유용한 식물세포주를 제공하고자 예의노력한 결과, 배추속 식물의 형성층 또는 전형성층 유래 세포주를 분리하고, 상기 세포주가 안정적으로 증식되고, 다양한 조직 또는 세포로의 분화능을 확인함과 아울러 배양 시 변이가 없음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 탈분화 과정 없이 배추속의 형성층 또는 전형성층 유래 동질적인 줄기세포 및 그 분리방법을 제공하는 데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 배추속(genus Brassica)의 형성층 또는 전형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 배추속의 형성층 또는 전형성층 유래 줄기세포를 제공한다:

(a) 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임;

(b) 동질적인 세포주(homogeneous cell line)임;

(c) 다수의 작은 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄; 및

(d) 다수의 발달된 형태의 미토콘드리아를 가짐.

본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 배추속의 형성층 또는 전형성층 유래 줄기세포의 분리방법을 제공한다:

(a) 배추속의 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 수득하는 단계;

(b) 상기 수득된 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 배양하여 형성층 또는 전형성층으로부터 증식되는 형성층 또는 전형성층의 층(cambium or procambium layer)을 유도하는 단계; 및

(c) 상기 유도된 형성층 또는 전형성층의 층(cambium or procambium layer) 을 분리하여 형성층 또는 전형성층 유래 줄기세포를 수득하는 단계.

본 발명은 탈분화 과정 없이 배추속의 형성층 또는 전형성층 유래 동질적인 줄기세포 및 그 분리방법을 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 배추속의 형성층 및 전형성층 유래 줄기세포는 탈분화과정 없이 미분화상태로 분리되어 장기 배양시에도 세포생장률과 생장 패턴에 변이 없이 안정적으로 유지되어 대량 배양이 가능한바, 배추속 식물 유래의 유용물질 생산에 유용하다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.

본원에서, 유관속 "형성층"은 식물체의 측부에 위치하는 측재분열조직으로 형성층의 활동에 의해 식물의 비대생장이 일어나며, 그 결과 11,000년 이상의 연륜을 가진 거대 식물체가 존재할 수 있게 된다. 발생학적으로 유관속 형성층은 전형성층으로부터 기원되므로 분열조직적 연속성을 유지하면서 점진적으로 분화된 동일 분열조직이다. 이러한 형성층과 전형성층은 1기 분열조직으로서, 본 발명에 있어서 형성층 및 전형성층 조직을 사용하여 동일한 효과를 얻을 것으로 기대되었다.

본원에서 "선천적인 미분화 상태(innately undifferentiated)"란 탈분화 과정을 거쳐 미분화 상태로 존재하는 것이 아닌, 본래부터 분화 전 상태를 유지하는 것을 말한다.

본 발명은 일 관점에서, 배추속의 형성층 또는 전형성층 유래 줄기세포에 관한 것이다.

이미 분화된 조직인 잎이나 줄기, 뿌리 부분을 사용할 경우, 캘러스를 형성하기 위해서는 분화된 조직에서 미분화조직으로 되돌아가는(rejuvenation) 탈분화(dedifferentiation) 과정을 거쳐야 하는데 이 탈분화 과정 중에 체세포에 돌연변이가 나타나 세포 불안정성의 원인이 된다. 이에 본 발명자들은 체세포 변이가 거의 없는 식물 세포 시스템을 연구하던 중, 분열조직인 형성층에서만 특이적으로 세포주를 유도할 경우 탈분화를 거치지 않고 분열조직 자체가 가지고 있는 왕성한 분열능을 사용할 수 있으므로 체세포 변이가 없어 유전적으로 안정성이 높고, 생리적으로 균일한 동질적인 세포주를 유도할 수 있다는 점에 착안하고 형성층 및 전형성층 유래 줄기세포를 분리하였다.

본 발명에 따른 배추속의 형성층 또는 전형성층 유래 줄기세포는 (a) 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임; (b) 동질적인 세포주(homogeneous cell line)임; (c) 다수의 작은 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄; 및 (d) 다수의 발달된 형태의 미토콘드리아를 가짐을 특징으로 할 수 있다.

이때, "다수의 작은 액포"를 가진다고 함은, 배추속의 다른 조직세포, 캘러 스 등과 비교하여 크기면에서 작으면서 2배 이상의 다수의 액포를 가짐을 말한다. 아울러, "다수의 발달된 형태의 미토콘드리아"를 가진다고 함은, 배추속의 다른 조직세포, 캘러스 등과 비교하여 2배 이상의 다수의 미토콘드리아를 가지며, 크기면에서도 타원형 또는 로드형으로 크면서, 내막과 외막이 발달하여 표면적이 큰 형태로서, 활성면에서도 매우 활발한 미토콘드리아를 가짐을 말한다.

본 발명에 있어서, 상기 배추속 형성층 또는 전형성층 유래 줄기세포는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 얻어진 것임을 특징으로 할 수 있다:

(c) 상기 유도된 형성층 또는 전형성층의 층(cambium or procambium layer)을 분리하여 형성층 또는 전형성층 유래 줄기세포를 수득하는 단계.

본 발명에 있어서, 상기 (b)단계는 옥신(auxin)을 포함한 배지에서 배양하는 것을 특징으로 할 수 있는데, 이때, 옥신으로는 NAA (α-Naphtalene acetic acid) 또는 IAA (Indole-3-acetic acid)를 사용할 수 있으며, 이러한 옥신은 1~3㎎/ℓ의 농도로 포함되는 것을 특징으로 할 수 있다.

아울러, 상기 (c)단계는 상기 유도된 형성층 또는 전형성층의 층을 상기 형성층 또는 전형성층 이외의 부분으로부터 무정형으로 증식되는 캘러스 층으로부터 분리하는 것임을 특징으로 할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 배추속의 형성층 또는 전형성층 유래 줄기세포의 제조

1-1: 식물재료의 준비

배추속의 브로콜리(Brassica oleracea var . italica)로부터 상기 형성층 및 전형성층 유래 줄기세포를 수득하기 위하여, 먼저 브로콜리의 줄기 및 화경을 채취한 후(도 1A), 즉시 항산화제 100㎎/L 아스코르브산(L-ascorbic acid, DUCHEFA, The Netherlands) 용액에 침적하여 운송·보관하였다.

그 후, 1% 베노밀(benomyl, Dongbu Hannong Chemical, Korea), 1% 다코닐(daconil, Dongbu Hannong Chemical, Korea), 1% 스트렙토마이신(sterptomycin sulphate, DUCHEFA, The Netherlands), 0.1% 세포탁심(cefotaxime sodium DUCHEFA, The Netherlands)의 혼합용액에 10분간 전처리 후 페놀 화합물(phenolic compound)과 잔존 화학물질을 제거하기 위하여 수돗물(tap water)로 5분간 세척하였다. 그리고, 70% 에탄올(ethanol, DC Chemical, Korea)에 1분, 1.5% 과산화수소(hydrogen peroxide, LG Chemical, Korea) 3분, 1% CLOROX 용액에 5분, 2% CLOROX용액에 5분 표면 살균 후 3~4회 세척하였다.

1-2: 줄기 및 화경으로부터 형성층 및 전형성층 포함 절편체의 제조

실시예 1-1의 살균과정을 거친 줄기 및 화경을 4등분하여, 분열능이 왕성한 형성층 및 전형성층 부분이 포함되도록 가로×세로×높이=0.4~0.5cm×0.6~0.7cm×0.2~0.4mm의 크기로 절단을 하였다. 도 1A는 브로콜리 재료사진이고, 도 1B는 이로부터 수득한 형성층 포함 절편체를 제조한 모습이다.

1-3: 브로콜리의 형성층 유래 줄기세포 유도단계

실시예 1-2에서 준비한 형성층 포함 절편체 및 전형성층 포함 절편체는 형성층 및 전형성층이 각각 배지면에 닿도록 표 1의 줄기세포 유도배지(배지 1)에 치상하여 배양하였다.

<표 1> 줄기세포 유도배지 (배지 1)

	Composition	Contents(㎎/L)
Inorganic salts	KNO₃	2500
	(NH₄)₂SO₄	134
	MgSO₄·7H₂O	121.56
	MnSO₄·4H₂O	10
	ZnSO₄ _·7H₂O	2
	CuSO₄·5H₂O	0.025
	CaCl₂·2H₂O	113.23
	KI	0.75
	CoCl₂·6H₂O	0.025
	NaH₂PO₄·H₂O	130.44
	H₃BO₃	3
	Na₂MoO₄·2H₂O	0.25
	FeNaEDTA	36.7
Vitamin	Myo-inositol	200
	Thiamine-HCl	20
	Nicotinic acid	2
	Pyridoxine-HCl	2
	L-ascorbic acid	50
	Citric acid	75
Amino acid	L-aspartic acid	133
	L-arginine	175
	Glycine	75
	Proline	115
Hormone	α-Naphtalene acetic acid	2
Sucrose		10,000
Activated charcoal		100
Gelrite		2,000

배지에 생장 조절제로서 NAA, IAA와 같은 옥신(Auxin)류를 1~3mg/L의 농도로 첨가하였는데, 바람직하게는 2mg/L의 농도로 첨가한다. 배양은 25±1℃로 조절된 암실에서 실시되었다.

상기와 같이, 배양한 결과, 초기 배양 3~4일째 형성층 및 전형성층으로부터 세포 분열이 육안상으로 관찰되고, 도 1C에 나타난 바와 같이 배양 20일 이후에 형성층 유래의 동질적인 세포가 분열함에 따라 자연적으로 그 이외의 조직으로부터 분리되기 시작하였다. 또한, 전형성층 포함 절편체에서도 유사한 모습이 관찰되었다. 두 층이 자연스럽게 분리될 때까지 기다려 완벽한 분리가 이루어진 후, 페트리 디쉬에 분리 배양하였다. 분리 후, 생장률이 좋은 희고 무른 부분을 유도배지와 동일한 새로운 배지로 매 14일째 계대하였다.

그 결과, 브로콜리의 전형성층 및 형성층 유래 줄기세포는 장기 배양시 세포의 생장률, 생장 패턴, 응집 정도에 변이 없이 안정적으로 유지되어 대량 배양이 가능함을 확인하였다.

실시예 2: 배추속의 형성층 및 전형성층 유래 줄기세포의 증식 및 특성관찰

실시예 1에서 분리한 형성층 및 전형성층 유래 줄기세포를 하기 <표 2>의 액상배지가 함유된 플라스크에 넣어 암조건에서 25±1℃에서 100rpm의 회전 교반기(shaker)에서 배양하였다. 계대배양 주기는 2주일로 고정함으로써 배양세포가 항상 대수생장기 상태에서 높은 활력을 유지할 수 있도록 하였다.

<표 2> Suspension medium (배지 2)

	Composition	Contents(㎎/L)
Inorganic salts	Ca(NO₃)₂	471.26
	NH₄NO₃	400
	MgSO₄·7H₂O	180.54
	MnSO₄·4H₂O	22.3
	ZnSO_4·7H₂O	8.6
	CuSO₄·5H₂O	0.25
	CaCl₂·2H₂O	72.5
	K₂SO₄	990
	Na₂MoO₄·2H₂O	0.25
	H₃BO₃	6.2
	KH₂PO₄	170
	FeNaEDTA	36.7
Vitamin	Myo-inositol	200
	Thiamine-HCl	20
	Nicotinic acid	2
	Pyridoxine-HCl	2
	L-ascorbic acid	50
	Citric acid	75
Amino acid	L-aspartic acid	133
	L-arginine	175
	Glycine	75
	Proline	115
Hormone	α-Naphtalene acetic acid	2
Sucrose		30,000

세포 응집정도(biological microscope CX31, Olympus, Japan)를 살펴 볼 때, 본 발명에 따른 세포주는 현탁배양 시 단세포 수준으로 존재하나, 브로콜리의 체세포(사부, 피층 및 표피 조직에서 유도한 캘러스)의 경우, 응집됨을 관찰할 수 있었다.

한편, 본 발명에 따른 줄기세포는 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 관찰할 수 있었으며, 동질적인 세포주로서 미분화상태임을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명에 따른 줄기세포는 활성이 높고 타원형 또는 로드형으로 내막과 외막이 발달된 형태의 미토콘드리아를 다수 가짐을 확인할 수 있었다. 이에 반하여, 일반 브로콜리의 체세포(사부, 피층 및 표피 조직에서 유도한 캘러스)의 경 우, 이러한 특징을 확인할 수 없었다.

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1A는 재료식물(브로콜리)의 사진이며, 1B는 이로부터 수득한 형성층 포함 절편체의 사진이며, 1C는 형성층 유래 줄기세포가 증식된 모습을 보이는 사진이다.

Claims

배추속(genus Brassica)의 형성층 또는 전형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 배추속의 형성층 또는 전형성층 유래 줄기세포:

(a) 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임;

(b) 동질적인 세포주(homogeneous cell line)임;

(c) 다수의 작은 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄; 및

(d) 다수의 발달된 형태의 미토콘드리아를 가짐.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 분리된 것을 특징으로 하는 배추속의 형성층 또는 전형성층 유래 줄기세포:

(a) 배추속의 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 수득하는 단계;

(b) 상기 수득된 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 배양하여 형성층 또는 전형성층으로부터 증식되는 형성층 또는 전형성층의 층(cambium or procambium layer)을 유도하는 단계; 및

(c) 상기 유도된 형성층 또는 전형성층의 층(cambium or procambium layer)을 분리하여 형성층 또는 전형성층 유래 줄기세포를 수득하는 단계.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배추속 식물은 브로콜리인 것을 특징으로 하는 배추속의 형성층 또는 전형성층 유래 줄기세포.
다음의 단계를 포함하는 배추속의 형성층 또는 전형성층 유래 줄기세포의 분리방법:

(a) 배추속의 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 수득하는 단계;

(b) 상기 수득된 형성층 또는 전형성층 함유 조직을 배양하여 형성층 또는 전형성층으로부터 증식되는 형성층 또는 전형성층의 층(cambium or procambium layer)을 유도하는 단계; 및

(c) 상기 유도된 형성층 또는 전형성층의 층(cambium or procambium layer)을 분리하여 형성층 또는 전형성층 유래 줄기세포를 수득하는 단계.
제4항에 있어서, 상기 (b)단계는 옥신(auxin)을 포함한 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 옥신은 1~3㎎/ℓ의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 상기 (c)단계는 상기 유도된 형성층 또는 전형성층의 층을 상기 형성층 또는 전형성층 이외의 부분으로부터 무정형으로 증식되는 캘러스 층으로부터 분리하는 것임을 특징으로 하는 방법.