JP6026209B2 - 同期化した植物細胞培養による二次代謝産物の大量生産の安定化 - Google Patents
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Description
単細胞由来の植物細胞株の有用物質生産能力は、多くの種類の細胞からの細胞株より変動が少なくて収率が高い。従来の発明では植物細胞株の誘導に望ましい切片(explant)として、茎(stem)、根(root)、種子(seed)及び葉(needle, leaf)を使った。これらの茎、根、種子、葉は、異なる機能を持った多様な形態の細胞株からなる組織である。従って、これらからの植物細胞株、即ち、カルス(callus)は一種類の細胞ではなく、多くの種類の細胞から構成される。従来の多くの種類の細胞からなる組織からカルスを誘導する方法によっては、生産性の変動(variation)を低減するには限界がある。
植物細胞培養の明らかな特徴の一つは、細胞凝集(cell aggregation)である。大韓民国公開特許第0364478号明細書によると、植物細胞はその直径が30〜300μmで、動物細胞と比べて約30倍も大きく、植物細胞壁は自然に凝集する特性が強く、懸濁液の場合、完璧に単細胞(single cell)の状態としての培養は不可能である。従来の培養技術で説明された懸濁液には、直径が数十μmの凝集体(単一細胞またはいくつかの凝集した細胞)から、数千の細胞からできた直径が数mmの大きさの凝集体まで存在する。培養過程の中での何らかの過程によって細胞を分離しようと努力したが、まだ完璧に分離しにくく、益々凝集の大きさが拡大される。Naill & Roberts (2004)によると、細胞凝集は内部と外部細胞の間に局所的環境の差を誘発して、結果的に生長と物質代謝の変化を導く。
植物組織を脱分化して得られた細胞株、即ちカルスは染色体変異(somaclonal variation)によって遺伝的変異が発生し、これにより有用物質の生産能の変動が大きくなる。異なる機能を有する多様な形態の細胞株からなる永久組織の葉、茎、根、種子由来カルスは、脱分化でできた2期分裂組織なので微細環境にも影響を大きく受ける。従って、Hirasuna et al.(1996)は細胞密度、継代培養周期、温度などの最適条件を確認し、これらの精度を高く維持する研究を行った。
植物細胞培養によって所望の二次代謝産物を産業的規模にて大量生産するためにはスケールアップ段階が必須である。細胞培養による有用物質の生産に関する成功裡な実験室規模の研究結果が、多くの特許と論文に発表された後、大量生産のためのバイオリアクター(bioreactor)への適用が行われている。大韓民国公開特許第0290004号明細書によると、反応器にて大量に培養すると実験室規模のフラスコ培養と非常に違った培養環境を提供するようになり、一般的に生長速度が遅くなり、生産性が減少して、生産物の造成などに変化が生じる。このような大量生産のためのバイオリアクターへの適用の時、発生する生長率、生産性及び造成の変化は、細胞培養による有用物質の産業化過程で問題として考えられる。植物細胞の大規模培養の時、通気(aeration)と混合(mixing)の効率性を考慮して、外部の動力によって空気を入れ込むか、インペラー(impeller)を装着したバイオリアクター(bioreator)が好まれる。しかし、植物細胞は剪断(shear)に敏感で、細胞生存率(cell viability)が急激に減少するので、剪断を減らすための対策が必要である。植物細胞の剪断感受性(shear senstivity)の原因としては、大きいサイズ(large size)、堅い細胞壁(rigid cell wall)、凝集(aggregation)、大型液胞(extensive vacuole)が挙げられる(Yokoi, et al, 1993)。従来の解決方法としては、インペラーの形態を変形するか、撹拌速度の調節できる新しいタイプ、即ち剪断を減らす(low shear)バイオリアクターが考案された。にもかかわらず、微環境要素(microenviornment)の差を乗り越えることができず、否定的な結果を生んでいる。
凍結保存とは、極低温状態で細胞のほとんどの代謝活動を中断させた状態を長期間維持して、次に遺伝的な変化、特性及び生合成活性の変化なしに細胞を回収することを意味する。植物細胞を冷凍保存して、汚染による損失を無くし、連続継代細胞株(continuous cell line)での遺伝的変化を最小化できる。cGMPの観点から、細胞株の長期保管技術は原料の安定的な供給のために必須である。動物組織培養細胞は通常、数年間冷凍保存できるが、植物細胞においては、類似の冷凍保存技術はいっそう困難であると証明された。任意の培養液に存在する植物細胞は不均質(heterogeniety)で生理的及び形態的に多様性を示す。従って植物の懸濁細胞は冷凍保存において多数の過程を要して、また冷凍保存を不適切に実施する場合には変異が発生する心配がある。
Kim et al.(2000)によると、細胞懸濁培養の時、細胞分裂能が消失した細胞株が入っている培養液に、培養細胞の細胞分裂が、最も活発である時の培養液を少量採取して添加すると、細胞分裂を刺激することができる。バラの懸濁培養(Rose suspension culture)のアントシアニン(anthocyanin)の生産において、いちごの懸濁培養(strawberry suspension culture)の培地の一部を採取して添加した結果、生産能が向上した。このように培養細胞から生産・分泌されて細胞の生長及び二次代謝産物の生成を促進する因子を調節因子という。まだこれらの調節因子は具体的に判明されておらず、ただ生長及び産物生産のための化学的シグナルを持っていると理解され、そしてリン酸塩(phosphate)、カルモジュリン(calmodulin)のような、可能性のある少数の物質に対する報告があるだけである。調節因子は調節培地(conditioned medium)、またはヘルパー細胞(helper cells)として供給できる。
細胞の培養法には、培養初期に一回、培養液と細胞を入れて、追加の栄養物質の供給や回収がない回分式培養(batch cultivation)と、培養器に培養液を入れて細胞を培養するのにおいて、外部から新しい培養液を一定の速度で流入させると同時に、培養生成物が含まれた古い培養液を同じ速度で回収して、栄養が枯渇しなく、細胞が連続的に培養されるように維持する連続培養(continuous cultivation)がある。
維管束形成層(cambium)は植物体側部に位置する側方分裂組織(Lateral meristem)である。裸子植物と木本性双子葉植物では形成層の継続的な活動による肥大生長が起きて、その結果、年齢11,000年以上の巨大植物体が存在するようになる。発生学的に、分裂組織は1期分裂組織と2期分裂組織として分けられ、この区別の基準は、1期分裂組織は胚の発生過程の中で発生し、発芽後の植物生長に関与する分裂組織を意味し、2期分裂組織は植物体内の既存永久組織が脱分化してできた分裂組織を意味する。このような観点から見ると、形成層は、中度に永久組織の介入なしに1期分裂組織である前型成層から由来して、分裂組織的に連続性を持った1期分裂組織である。
本発明の目的は木の幼い茎から形成層のみを分離し、これ由来の単一細胞起源の細胞株(single cell clone)を製作する方法を提供するのである。より具体的には、本発明の目的は、従来のスカルペル(scalpel)を利用した物理的な分離方法に、細胞生理化学的な分離方法を加えて、純粋に形成層のみを分離培養することで、植物細胞培養の変動性を解決し、安定的な植物有用物質の生産方法を提供するのである。
本発明において、望ましくは前記(c)段階はオーキシン(auxin)を含む培地で培養することを特徴とする。また、さらに望ましくは前記培地は1〜3mg/Lのオーキシンを含むことができる。
本発明はまた、植物の形成層から誘導され、次の特性を有する単一細胞由来の細胞株(single cell clone)を提供する:(a)懸濁培養時90%以上が単細胞状態として存在する;(b)多数の液胞(vacuole)を有する形態学的特徴を示す;(c)同一植物起源(the same plant origin)の、形成層以外の組織由来の細胞株に比べて生長速度が早く、長期間安定に培養される;(d)生物反応器で剪断ストレス(shear stress)に対して低い敏感性を持つ。
本発明において、望ましくは前記植物はイチイ(the genus Taxus)であることを特徴とする。さらに望ましくは、前記イチイの形成層から由来した単一細胞由来の細胞株は、同一植物起源の形成層以外の胚又は葉由来のカルスに比べて、増加したパクリタキセル(paclitaxel)分泌能を有することを特徴とする。
本発明はまた、次の段階を含むことを特徴とする植物由来の生物学的有用物質の製造方法を提供する:(a)前記単一細胞由来の細胞株を培養して有用物質を生成する段階;及び(b)前記生成した有用物質を回収する段階。この時、望ましくは、前記(a)段階の培養は前記単一細胞由来の細胞株の培養に使われた培地を取り除いて、新しい培地を供給することを含むことができる。
本発明において、望ましくは前記単一細胞由来の細胞株はイチイ(the genus Taxus)の形成層から由来した単一細胞由来の細胞株(single cell clone)であり、有用物質はパクリタキセル(paclitaxel)であることを特徴とする。この場合、前記培地はジャスモン酸メチル(methyl jasmonate)、フェニルアラニン(phenylalanine)及びキトサン(chitosan)からなる群より選ばれた少なくとも1つの物質をさらに含むことができる。
本発明はまた、前記方法で分離した植物の形成層から由来した単一細胞由来の細胞株を凍結することを特徴とする植物細胞株の保存方法を提供する。
本発明の方法によると、木本類の茎の多くの組織から純粋に形成層のみを分離して培養することで、脱分化過程なしに1期分裂組織の分裂組織的連続性を有する単細胞起源の細胞株(single cell clone)の培養が可能である。前記培養細胞株は長期培養工程で細胞の生長率、生長パターンの変化が少なく、有用物質を安定的に生産することができる。また従来技術に比べて凝集面が小さくて、多重液胞(multiple vacuole)を有し、バイオリアクターでの剪断敏感性が少なく、産業レベルの大量生産に理想的である。
イチイの種子(seed)、葉(needle)、茎(stem)を夫々採取した。材料の採取後、直ちに抗酸化剤100mg/Lアスコルビン酸(L-ascorbic acid, DUCHEFA, The Netherlands)溶液に浸漬して運搬・保管した。材料の形態・生理学的特性を考慮して、夫々別の方法にて表面殺菌を行った。
(1)種子(seed):70%エタノールで1分間表面殺菌した後、1%clorox溶液に48時間浸漬した後、滅菌水で3〜4回水洗した。引き継いで0.5%PVP(polyvinyl pyrrolidone, DUCHEFA, The Netherlands)、50mg/Lアスコルビン酸(L-ascorbic acid, DUCHEFA, TheNetherlands)、70mg/Lクエン酸(citric acid, DUCHEFA, The Netherlands)が添加された溶液の中で種子(seed)から胚(embryo)を分離して、カルス誘導培地で培養した。
(2)葉(needle)と茎(stem):1%ベノミル(benomyl, Dongbu Hannong Chemical, Korea)、1%ダコニル(daconil, DongbuHannong Chemical, Korea)、1%ストレプトマイシン(sterptomycinsulphate, DUCHEFA, The Netherlands)、0.1%セフォタキシム(cefotaximesodium DUCHEFA, TheNetherlands)を含む溶液で24時間、前処理した後、フェノール化合物(phenolic compound)と残存化学物質を取り除くため水道水で30分水洗した。70%エタノール(ethanol, DC Chemical, Korea)で1分、30%過酸化水素(hydrogen peroxide, LG Chemical, Korea)で15分、1%CLOROX溶液で15分、3%CLOROX溶液で5分間表面殺菌後、3〜4回洗浄した。酸化防止のため0.5%PVP、50mg/Lアスコルビン酸、70mg/Lクエン酸が添加された溶液の中で葉(needle)を両端部分を切り捨てて、カルス誘導培地で培養した。
(3)茎からの形成層分離(cambium preparation from stem):茎の中央部位である木部をピンセットでつかんで、形成層が含まれた師部(phloem)、皮層(cortex)及び表皮(epidermis)組織を剥離した。剥離した形成層を含む組織は形成層が培地面に付着するように培養した。
初期培養4〜7日目、形成層から細胞分裂が肉眼で観察され、培養15日以後に形成層上部である師部皮層及び表皮からなる層からカルスが誘導し始め、培養30日経過後形成層と師部を含む上層で完全に分離し始めると、2層が自然に分離するのを待ち、完全に分離すると、夫々別のペトリ皿(petridish)に分離・培養した(図1)。
カルスの中で生長率が良く、白くてもろい部分を、21日ごとに新しい培地で継代した。初期培養で胚(embryo)と葉(needle)から誘導したカルスは生長率が非常に不安定であり、容易に茶変する傾向が見える一方、形成層由来の細胞は生長速度が早く、色彩の変化がなく、安定的な細胞の選別が可能であった。
胚及び葉由来のカルス(callus)と形成層由来の細胞を夫々液状培地(表2)が入っているフラスコで培養した。
3Lのエアリフトバイオリアクター(airlift bioreactor, Sungwon SciTech, Korea)で胚(embryo)及び葉(needle)由来のカルスと、形成層由来の細胞を培養した。培地は液状培地を利用し、暗条件で25±1℃を一定に維持した。
エリシターは植物細胞で分子シグナル(molecular signal)を調節し、二次代謝に作用するもので、二次代謝産物の生産効率の増加に広く使われている。本発明者らは、エリシターとして、ジャスモン酸メチル(Methyl Jasmonate)及びそれ以外約10種を処理した結果、ジャスモン酸メチルがパクリタキセルの生産に効果が見られ、ジャスモン酸メチルと他のエリシターを組み合わせて処理することで、相対的に高い物質生産性を得ることができた。特に、パクリタキセルは、ジャスモン酸メチルとキトサン(chitosan)、フェニルアラニン(phenylalanine)が処理された培養体で最も効果的であった(図4)。
植物体由来の二次代謝産物は、細胞が生長する時生成される場合と、細胞の生長が止める時生成される場合がある。従って、パクリタキセルのように、細胞の生長と産物の生成が分離された場合には、初期段階培養で細胞の生長を最適化して短期間に産物を生産することができる細胞を大量増殖した後、次の段階で培養環境を産物の生産に最適な条件に換える、2段階の培養が望ましい。
胚及び葉由来のカルス(callus)と形成層由来の細胞を、培養14日目エリシターで処理した。エリシテーション時点から5日ごとに、各フラスコから使われた培地(spent medium)をピペットを用いて無菌的に回収して、同時に同量の新しい培地を供給した。この方法にて45日間延長培養した後、細胞と培地でのパクリタキセルの生成を観察し、結果を表5にまとめた。
培養6日〜7日の懸濁培養物を、室温で0.16Mのマンニトール(mannitol)が添加された培地に3日間予備培養した後、4℃で3時間低温処理した。低温処理した細胞を回収した後、40%エチレングリコール(ethylene glycol / Sigma, USA)と30%ソルビトール(sorbitol / DUCHEFA, The Netherlands)が含まれた培地を4mLクリオバイアル(cryovial, Duran, USA)に移して4℃で3分間培養した。
回収したサンプルを細胞と培地で分離した後、夫々のパクリタキセルの含量を分析した。細胞は真空乾燥器(vacuum desicator, Sam Shin Glass, Korea)で完全に乾燥した後、質量を測定した。乾燥重量約100mgの細胞にメタノール(Sigma, USA)、メチレンクロライド(Sigma, USA)の混合液(1:1, v/v)4mLを交ぜた後、室温で1時間ずつ3回にわたって超音波を利用して(ultrasonic cleaner, Branson, USA)抽出した。真空で完全に乾燥させて、また4mLのメチレンクロライドを入れて数回分離した。分離した有機溶媒層は真空乾燥して、残った抽出物を1mLのメタノールに再溶解した。溶解した抽出物を超音波で均質に撹拌し、遠心分離(8,000g×5分)を利用して固相物を取り除いた。
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Claims (12)
- カルスへの脱分化の過程を経ることなく、1期植物分裂組織の分裂組織的継続性を有する植物の形成層から分離された均質な細胞群。
- 前記細胞群が、次の特性の少なくとも1つを含む請求項1に記載の細胞群:
(a)植物の脱分化したカルス由来細胞と比較して、懸濁培養において、多数の単細胞を含むか、又はより小さなサイズの細胞凝集体を含む;
(b)多数の液胞(vacuole)を有する形態学的特徴を示す;
(c)植物の脱分化したカルス由来細胞と比較して、より早く、そしてより長く生長することができる;及び
(d)植物の脱分化したカルス由来細胞と比較して、生物反応器における剪断ストレス(shear stress)に対して低い感受性を有する。 - 前記細胞群が、前記特性(a)〜(d)の少なくとも2つを含む、請求項2に記載の細胞群。
- 前記細胞群が、前記特性(a)〜(d)の少なくとも3つを含む、請求項2に記載の細胞群。
- 前記細胞群が、前記特性(a)〜(d)を含む、請求項2に記載の細胞群。
- 前記植物はイチイ属であることを特徴とする、請求項1に記載の細胞群。
- 前記イチイ属の形成層由来の細胞群は、イチイ属の胚又は葉由来のカルスと比較して、増加したパクリタキセル分泌能を有する、請求項6に記載の細胞群。
- 次の段階を含むことを特徴とする植物由来の生物学的有用物質の製造方法:
(a)請求項1〜7のいずれか一項に記載の細胞群を培養して有用物質を生成する段階;及び
(b)前記生成した有用物質を回収する段階。 - 前記段階(a)の培養は前記細胞群の培養に使われた培地を取り除いて、新しい培地を供給することを含むことを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 前記細胞群は、イチイ属の形成層由来であり、有用物質はパクリタキセルであることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
- 前記イチイ属の形成層由来の細胞群は、ジャスモン酸メチル、フェニルアラニン及びキトサンからなる群より選ばれた少なくとも1つの物質をさらに含む培地で培養することを特徴とする、請求項10に記載の方法。
- 請求項1〜7のいずれか一項に記載の細胞群を、凍結することを含む植物細胞株の保存方法。
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