CN104783324B - 烟草细胞提取物的制备方法 - Google Patents
烟草细胞提取物的制备方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104783324B CN104783324B CN201510115159.2A CN201510115159A CN104783324B CN 104783324 B CN104783324 B CN 104783324B CN 201510115159 A CN201510115159 A CN 201510115159A CN 104783324 B CN104783324 B CN 104783324B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- preparation
- tobacco
- extract
- clone
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 title claims abstract description 77
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 title claims abstract description 63
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 152
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 claims abstract description 21
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 18
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 claims abstract description 14
- 210000001728 clone cell Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 238000000199 molecular distillation Methods 0.000 claims description 18
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 13
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 13
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 12
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 12
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 claims description 12
- 238000005286 illumination Methods 0.000 claims description 12
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 12
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 12
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 12
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 12
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 10
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- PVRBGBGMDLPYKG-UHFFFAOYSA-N 6-benzyl-7h-purine Chemical compound N=1C=NC=2N=CNC=2C=1CC1=CC=CC=C1 PVRBGBGMDLPYKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 7
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 6
- 230000032823 cell division Effects 0.000 claims description 6
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 claims description 6
- RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M chloromercury Chemical compound [Hg]Cl RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 238000009833 condensation Methods 0.000 claims description 6
- 230000005494 condensation Effects 0.000 claims description 6
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 claims description 6
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000004821 distillation Methods 0.000 claims description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 6
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 6
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 6
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 6
- 239000007943 implant Substances 0.000 claims description 6
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 6
- 238000010992 reflux Methods 0.000 claims description 6
- 238000012807 shake-flask culturing Methods 0.000 claims description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 6
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 claims description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 2
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 abstract description 23
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 abstract description 15
- UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N Carbon monoxide Chemical compound [O+]#[C-] UGFAIRIUMAVXCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 10
- 239000003546 flue gas Substances 0.000 abstract description 10
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 abstract description 9
- 239000000470 constituent Substances 0.000 abstract description 4
- 239000002304 perfume Substances 0.000 abstract description 4
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 abstract description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 7
- 235000013599 spices Nutrition 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 3
- 239000005631 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid Substances 0.000 description 2
- 244000025254 Cannabis sativa Species 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 2
- QEWYKACRFQMRMB-UHFFFAOYSA-N fluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)CF QEWYKACRFQMRMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HYBBIBNJHNGZAN-UHFFFAOYSA-N furfural Chemical compound O=CC1=CC=CO1 HYBBIBNJHNGZAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000004161 plant tissue culture Methods 0.000 description 2
- 230000001953 sensory effect Effects 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 238000010025 steaming Methods 0.000 description 2
- OUDFNZMQXZILJD-UHFFFAOYSA-N 5-methyl-2-furaldehyde Chemical compound CC1=CC=C(C=O)O1 OUDFNZMQXZILJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001585562 Callitris columellaris Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- QAOBEOXFSUJDJL-QFLFCSHESA-O Hyacinthin Natural products O=C(OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](Oc2c(-c3cc(O)c(O)cc3)[o+]c3c(c(O)cc(O)c3)c2)O1)/C=C/c1ccc(O)cc1 QAOBEOXFSUJDJL-QFLFCSHESA-O 0.000 description 1
- YKVWPZJHENXDAJ-VOTSOKGWSA-N Megastigmatrienone Chemical compound CC1=CC(=O)CC(C)(C)C1\C=C\C=C YKVWPZJHENXDAJ-VOTSOKGWSA-N 0.000 description 1
- 206010054949 Metaplasia Diseases 0.000 description 1
- NIDGCIPAMWNKOA-WOJBJXKFSA-N Neophytadiene Natural products [C@H](CCC[C@@H](CCCC(C)C)C)(CCCC(C=C)=C)C NIDGCIPAMWNKOA-WOJBJXKFSA-N 0.000 description 1
- 241000269799 Perca fluviatilis Species 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- QAOBEOXFSUJDJL-RYHKZSCWSA-O [(3s,6s)-6-[2-(3,4-dihydroxyphenyl)-5,7-dihydroxychromenylium-3-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxan-2-yl]methyl (e)-3-(4-hydroxyphenyl)prop-2-enoate Chemical compound C1([C@H](C(C(O)[C@H](OC=2C(=[O+]C3=CC(O)=CC(O)=C3C=2)C=2C=C(O)C(O)=CC=2)O1)O)O)COC(=O)\C=C\C1=CC=C(O)C=C1 QAOBEOXFSUJDJL-RYHKZSCWSA-O 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 150000002083 enediols Chemical class 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000015689 metaplastic ossification Effects 0.000 description 1
- NIDGCIPAMWNKOA-UHFFFAOYSA-N neophytadiene Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(=C)C=C NIDGCIPAMWNKOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 239000000779 smoke Substances 0.000 description 1
- PQDRXUSSKFWCFA-CFNZNRNTSA-N solanone Chemical compound CC(=O)CC[C@@H](C(C)C)\C=C\C(C)=C PQDRXUSSKFWCFA-CFNZNRNTSA-N 0.000 description 1
- PQDRXUSSKFWCFA-UHFFFAOYSA-N solanone Natural products CC(=O)CCC(C(C)C)C=CC(C)=C PQDRXUSSKFWCFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A24—TOBACCO; CIGARS; CIGARETTES; SIMULATED SMOKING DEVICES; SMOKERS' REQUISITES
- A24B—MANUFACTURE OR PREPARATION OF TOBACCO FOR SMOKING OR CHEWING; TOBACCO; SNUFF
- A24B15/00—Chemical features or treatment of tobacco; Tobacco substitutes, e.g. in liquid form
- A24B15/18—Treatment of tobacco products or tobacco substitutes
- A24B15/24—Treatment of tobacco products or tobacco substitutes by extraction; Tobacco extracts
- A24B15/26—Use of organic solvents for extraction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/04—Plant cells or tissues
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Botany (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了一种烟草细胞提取物的制备方法，该方法通过愈伤组织的获得、细胞的制备、原生质体的制备和细胞克隆的获得、克隆细胞的收集和烟草细胞提取物的制备的五大步骤获得烟草细胞提取物；本发明的优点是：不占用有效烟叶资源、可控性强、加工周期短、投入低、无污染等，制备的烟草细胞提取物有效成分含量高，能赋予卷烟甜香和清香香韵，柔和细腻烟气，提高烟气浓度，增加香气量，增加甜感，降低刺激。
Description
技术领域
本发明涉及一种工程细胞的培养和提取方法，具体地指一种烟草细胞提取物的制备方法。
背景技术
植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等)、组织(如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等)或细胞(如大孢子、小孢子、体细胞等)以及原生质体，在无菌和适宜的人工培养基及温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的学科。植物组织培养具有培养条件可以人为控制，生长周期短，繁殖率高，而且管理方便，利于工厂化生产和自动化控制的特点。其优势也非常明显，如下所示：
1)占用空间小，不受地区、季节限制；
2)可短时间大量繁殖，用于拯救濒危植物；
3)可诱导之分化成需要的器官，如根和芽；
4)解决有些植物产种子少或无的难题；
5)不存在变异，可保持原母本的一切遗传特征；
6)投资少，经济效益高；
7)繁殖方式多，试用品种多。
烟用香精香料是卷烟产品的灵魂。全世界的烟草行业都高度重视烟用香精香料的开发和应用，而且把能生产高品质香精香料的技术当作自己的秘密武器，以谋求在激烈的市场竞争中占据有利的地位。香精香料在卷烟中可以起到掩盖缺点、改善烟草香气和吃味、改进烟草的物理性能、赋予卷烟独特的口味和风格的作用，并且可以实现产品品质差异化，稳定卷烟抽吸品质，对于卷烟的风格和品质形成有重要影响。同时天然香精香料以其源自天然，各有效成分比例协调，绿色、环保、降害作用明显的特点，在中式卷烟核心技术的形成中，其作用将会越来越重要，尤其是在改善卷烟嗅香与吸味，构筑卷烟独特的口味和风格方面，作用更加明显。而在众多的天然香精香料品种中，烟草提取物具有其它品种提取物不可比拟的优势。首先，烟草提取物来自于烟叶，其成分种类和烟叶基本一致；其次，提取物不会对烟支带来不良气味；第三，提取后的烟草余料还可以用于烟草薄片的生产，达到循环利用的目的。
目前的烟草提取物主要是从烟叶中提取，该方法具有一定的缺陷和不足：
1)烟叶植株的生长过程中易收到温度、雨水、光照、虫害、人员素质等因素的影响；
2)需要牺牲大量的耕地面积，同时烟叶施肥还容易造成土壤板结，引起土地养分严重失调；
3)由于原料来源的不稳定性，导致提取物品质波动；
4)由于烟叶资源的有限性，导致烟叶原料需求无法得到满足。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种烟草细胞提取物的制备方法。该方法利用植物细胞培养技术，通过大规模培养高产烟草工程细胞，获得大量的烟草细胞，并对培养的细胞进行提取分离，最终得到高质量的烟草提取物。本方法具有不占用有效烟叶资源、可控性强、加工周期短、投入低、无污染的特点。通过本方法制备得到的烟草细胞提取物有效成分含量高，能赋予卷烟甜香和清香香韵，柔和细腻烟气，提高烟气浓度，增加香气量，增加甜感，降低刺激。
为解决上述技术问题，本发明提供的一种烟草细胞提取物的制备方法，包括以下步骤：
1)愈伤组织的获得
选取常规烤烟品种的裸种，用体积分数为75％的酒精冲洗2～3次，再用质量分数为0.1％的HgCl2溶液处理3～10min，无菌水冲洗3～5次，然后将灭菌后的种子播撒在不含蔗糖和激素的灭菌后的MS固体培养基上，在25±1℃光照条件下培养3～5周后，选取下胚轴、茎尖等作为外植体，剪碎移入MS诱导固体培养基中，在25±1℃光照条件下培养2～6周，即得到愈伤组织；
2)细胞的制备
将步骤1)得到愈伤组织连续培养2～4代，在无菌条件下，挑取细胞形态好的细胞团块继续接种培养，经挑选的细胞培养物培养1～2代挑选一次，直到所获得的细胞团为疏松颗粒状为止，然后将颗粒状的细胞团置于MS液体培养基进行摇瓶培养，过滤筛选得到单个细胞或者含有2～5个细胞的小细胞团；
3)原生质体的制备和细胞克隆的获得
按原生质体制备的常规方法将步骤2)得到单个细胞或者含有2～5个细胞的小细胞团分解过筛制备得到原生质体细胞，再将原生质体细胞孵育后分离培养，选取细胞壁恢复快、细胞分裂生长正常、迅速的单细胞后代作为备选细胞克隆，经2～20次传代筛选后获得所需细胞克隆；
4)克隆细胞的收集
挑选步骤3)的细胞克隆,培养10～25天后置于干净的纱布上，用蒸馏水冲洗，去除多余的琼脂后，置于40～60℃的干燥培养箱中，处理12～36h后，得到细胞粉末；
5)烟草细胞提取物的制备
a、称取步骤4)得到细胞粉末，加入10～30倍重量的体积分数为50～95％乙醇溶液回流提取1～3h，重复2～3次，收集提取液过滤减压浓缩至1.18～1.22g/cm3；得到初级烟草细胞提取液；
b、向初级烟草细胞提取液中加入其重量10～40％的丙二醇，搅拌均匀，然后进行分子蒸馏分离，得到分子蒸馏轻组分即为烟草细胞提取物。
进一步地，所述步骤1)中，MS诱导培养基中含有质量分数为0.05～0.3％的萘乙酸(NAA)、质量分数为0.05～0.25％的2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、质量分数为0.01～0.5％的6-苄基嘌呤(6-BA)和质量分数为0.1～1.0％的蔗糖。
再进一步地，所述步骤5)的第b小步中，分子蒸馏分离的工艺参数为：真空度≤1.0tor，刮板转速至50～400r/min，蒸馏温度35～60℃，冷凝温度-15～0℃，蒸馏速度0.2～1.0Kg/h。
本发明的有益效果在于：
本发明的优点是：不占用有效烟叶资源、可控性强、加工周期短、投入低、无污染等，制备的烟草细胞提取物有效成分含量高，能赋予卷烟甜香和清香香韵，柔和细腻烟气，提高烟气浓度，增加香气量，增加甜感，降低刺激。
附图说明
图1为获得的愈伤组织；
图2为大量培养的烟草工程细胞株；
图3是烟草细胞烘干前后照片对比；
图4是烟草细胞提取物主要致香成分总离子流图；
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1
烟草细胞提取物的制备方法，包括以下步骤：
1)愈伤组织的获得
选取常规烤烟品种的裸种，用体积分数为75％的酒精冲洗2次，再用质量分数为0.1％的HgCl2溶液处理6min，无菌水冲洗5次，然后将灭菌后的种子播撒在不含蔗糖和激素的灭菌后的MS固体培养基上，在25±1℃光照条件下培养3周后，选取下胚轴、茎尖等作为外植体，剪碎移入MS诱导固体培养基中，在25±1℃光照条件下培养4周，即得到愈伤组织；所述MS诱导培养基中含有质量分数为0.05％的萘乙酸(NAA)、质量分数为0.15％的2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、质量分数为0.01～0.5％的6-苄基嘌呤(6-BA)和质量分数为0.1～1.0％的蔗糖。
2)细胞的制备
将步骤1)得到愈伤组织连续培养3代，在无菌条件下，挑取细胞形态好的细胞团块继续接种培养，经挑选的细胞培养物培养1代(2-4周)挑选一次，直到所获得的细胞团为疏松颗粒状为止，然后将颗粒状的细胞团置于MS液体培养基进行摇瓶培养，过滤筛选得到单个细胞或者含有2～5个细胞的小细胞团；
3)原生质体的制备和细胞克隆的获得
按原生质体制备的常规方法将步骤2)得到单个细胞或者含有2～5个细胞的小细胞团分解过筛制备得到原生质体细胞，再将原生质体细胞孵育后分离培养，选取细胞壁恢复快、细胞分裂生长正常、迅速的单细胞后代作为备选细胞克隆，经5次传代筛选后获得所需细胞克隆；
4)克隆细胞的收集
挑选步骤3)的细胞克隆,培养10天后置于干净的纱布上，用蒸馏水冲洗，去除多余的琼脂后，置于50℃的干燥培养箱中，处理18h后，得到细胞粉末；
5)烟草细胞提取物的制备
a、称取步骤4)得到细胞粉末，加入15倍重量的体积分数为70％乙醇溶液回流提取2h，重复2次，收集提取液过滤减压浓缩至1.20g/cm3；得到初级烟草细胞提取液；
b、向初级烟草细胞提取液中加入其重量20％的丙二醇，搅拌均匀，然后进行分子蒸馏分离，分子蒸馏分离的工艺参数为：真空度为0.40tor，刮板转速至80r/min，蒸馏温度35℃，冷凝温度-10℃，蒸馏速度0.20Kg/h；得到分子蒸馏轻组分即为烟草细胞提取物1。
实施例2
烟草细胞提取物的制备方法，包括以下步骤：
1)愈伤组织的获得
选取常规烤烟品种的裸种，用体积分数为75％的酒精冲洗2次，再用质量分数为0.1％的HgCl2溶液处理10min，无菌水冲洗5次，然后将灭菌后的种子播撒在不含蔗糖和激素的灭菌后的MS固体培养基上，在25±1℃光照条件下培养3周后，选取下胚轴、茎尖等作为外植体，剪碎移入MS诱导固体培养基中，在25±1℃光照条件下培养6周，即得到愈伤组织；其中，MS诱导培养基中含有质量分数为0.05％的萘乙酸、质量分数为0.15％的2，4-二氯苯氧乙酸、质量分数为0.01～0.5％的6-苄基嘌呤和质量分数为0.1～1.0％的蔗糖。
2)细胞的制备
将步骤1)得到愈伤组织连续培养4代，在无菌条件下，挑取细胞形态好的细胞团块继续接种培养，经挑选的细胞培养物培养2代(2-4周)挑选一次，直到所获得的细胞团为疏松颗粒状为止，然后将颗粒状的细胞团置于MS液体培养基进行摇瓶培养，过滤筛选得到单个细胞或者含有2～5个细胞的小细胞团；
3)原生质体的制备和细胞克隆的获得
按原生质体制备的常规方法将步骤2)得到单个细胞或者含有2～5个细胞的小细胞团分解过筛制备得到原生质体细胞，再将原生质体细胞孵育后分离培养，选取细胞壁恢复快、细胞分裂生长正常、迅速的单细胞后代作为备选细胞克隆，经2次传代筛选后获得所需细胞克隆；
4)克隆细胞的收集
挑选步骤3)的细胞克隆,培养20天后置于干净的纱布上，用蒸馏水冲洗，去除多余的琼脂后，置于40℃的干燥培养箱中，处理24h后，得到细胞粉末；
5)烟草细胞提取物的制备
a、称取步骤4)得到细胞粉末，加入10倍重量的体积分数为95％乙醇溶液回流提取2h，重复2次，收集提取液过滤减压浓缩至1.22g/cm3；得到初级烟草细胞提取液；
b、向初级烟草细胞提取液中加入其重量10％的丙二醇，搅拌均匀，然后进行分子蒸馏分离，分子蒸馏分离的工艺参数为：真空度为0.2tor，刮板转速至300r/min，蒸馏温度35℃，冷凝温度-5℃，蒸馏速度0.6Kg/h，得到分子蒸馏轻组分即为烟草细胞提取物2。
实施例3
烟草细胞提取物的制备方法，包括以下步骤：
1)愈伤组织的获得
选取常规烤烟品种的裸种，用体积分数为75％的酒精冲洗2次，再用质量分数为0.1％的HgCl2溶液处理8min，无菌水冲洗3次，然后将灭菌后的种子播撒在不含蔗糖和激素的灭菌后的MS固体培养基上，在25±1℃光照条件下培养5周后，选取下胚轴、茎尖等作为外植体，剪碎移入MS诱导固体培养基中，在25±1℃光照条件下培养3周，即得到愈伤组织；其中，MS诱导培养基中含有质量分数为0.3％的萘乙酸、质量分数为0.25％的2，4-二氯苯氧乙酸、质量分数为0.01～0.5％的6-苄基嘌呤和质量分数为0.1～1.0％的蔗糖。
2)细胞的制备
将步骤1)得到愈伤组织连续培养3代，在无菌条件下，挑取细胞形态好的细胞团块继续接种培养，经挑选的细胞培养物培养2代挑选一次，直到所获得的细胞团为疏松颗粒状为止，然后将颗粒状的细胞团置于MS液体培养基进行摇瓶培养，过滤筛选得到单个细胞或者含有2～5个细胞的小细胞团；
3)原生质体的制备和细胞克隆的获得
按原生质体制备的常规方法将步骤2)得到单个细胞或者含有2～5个细胞的小细胞团分解过筛制备得到原生质体细胞，再将原生质体细胞孵育后分离培养，选取细胞壁恢复快、细胞分裂生长正常、迅速的单细胞后代作为备选细胞克隆，经10次传代筛选后获得所需细胞克隆；
4)克隆细胞的收集
挑选步骤3)的细胞克隆，培养20天后置于干净的纱布上，用蒸馏水冲洗，去除多余的琼脂后，置于60℃的干燥培养箱中，处理12h后，得到细胞粉末；
5)烟草细胞提取物的制备
a、称取步骤4)得到细胞粉末，加入30倍重量的体积分数为75％乙醇溶液回流提取2h，重复3次，收集提取液过滤减压浓缩至1.18g/cm3；得到初级烟草细胞提取液；
b、向初级烟草细胞提取液中加入其重量40％的丙二醇，搅拌均匀，然后进行分子蒸馏分离，分子蒸馏分离的工艺参数为：真空度为0.5tor，刮板转速至400r/min，蒸馏温度35℃，冷凝温度0℃，蒸馏速度1.0Kg/h；得到分子蒸馏轻组分即为烟草细胞提取物3。
实施例4
烟草细胞提取物的制备方法，包括以下步骤：
1)愈伤组织的获得
选取常规烤烟品种的裸种，用体积分数为75％的酒精冲洗2次，再用质量分数为0.1％的HgCl2溶液处理6min，无菌水冲洗3次，然后将灭菌后的种子播撒在不含蔗糖和激素的灭菌后的MS固体培养基上，在25±1℃光照条件下培养5周后，选取下胚轴、茎尖等作为外植体，剪碎移入MS诱导固体培养基中，在25±1℃光照条件下培养5周，即得到愈伤组织；其中，MS诱导培养基中含有质量分数为0.2％的萘乙酸、质量分数为0.1％的2，4-二氯苯氧乙酸、质量分数为0.01～0.5％的6-苄基嘌呤和质量分数为0.1～1.0％的蔗糖。
2)细胞的制备
将步骤1)得到愈伤组织连续培养4代，在无菌条件下，挑取细胞形态好的细胞团块继续接种培养，经挑选的细胞培养物培养1～2代挑选一次，直到所获得的细胞团为疏松颗粒状为止，然后将颗粒状的细胞团置于MS液体培养基进行摇瓶培养，过滤筛选得到单个细胞或者含有2～5个细胞的小细胞团；
3)原生质体的制备和细胞克隆的获得
按原生质体制备的常规方法将步骤2)得到单个细胞或者含有2～5个细胞的小细胞团分解过筛制备得到原生质体细胞，再将原生质体细胞孵育后分离培养，选取细胞壁恢复快、细胞分裂生长正常、迅速的单细胞后代作为备选细胞克隆，经15次传代筛选后获得所需细胞克隆；
4)克隆细胞的收集
挑选步骤3)的细胞克隆，培养18天后置于干净的纱布上，用蒸馏水冲洗，去除多余的琼脂后，置于40℃的干燥培养箱中，处理36h后，得到细胞粉末；
5)烟草细胞提取物的制备
a、称取步骤4)得到细胞粉末，加入105倍重量的体积分数为55％乙醇溶液回流提取2h，重复2次，收集提取液过滤减压浓缩至1.20g/cm3；得到初级烟草细胞提取液；
b、向初级烟草细胞提取液中加入其重量15％的丙二醇，搅拌均匀，然后进行分子蒸馏分离，分子蒸馏分离的工艺参数为：真空度为0.2tor，刮板转速至150r/min，蒸馏温度40℃，冷凝温度-10℃，蒸馏速度0.5Kg/h；得到分子蒸馏轻组分即为烟草细胞提取物4。
将实施例1制备得到烟草细胞提取物1进行成分检测
表1.烟草细胞提取物中主要挥发性成分种类及含量
如图4和表1所示：以上成分中的糠醛、5-甲基糠醛可以赋予卷烟清甜香，增加卷烟烟气甜感；茄酮能增加烟草香，使烟气丰满细腻；巨豆三烯酮具有增加烟草甜香，使烟气和顺的作用；苯乙醛能增加烟香；西柏三烯二醇可以丰满烟气体香；新植二烯能增进烤烟香气。
表2.烟草细胞提取物感官评吸分值
从卷烟感官评吸结果来看，烟草细胞提取物在光泽、卷烟香气、烟气协调性、掩盖杂气、降低刺激性和改善口腔余味方面均优于对照样，这说明烟草细胞提取物在卷烟中具有较好地应用效果。
表3.烟草细胞提取物卷烟评价结果
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (3)
1.一种烟草细胞提取物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)愈伤组织的获得
选取常规烤烟品种的裸种，用体积分数为75％的酒精冲洗2～3次，再用质量分数为0.1％的HgCl2溶液处理3～10min，无菌水冲洗3～5次，然后将灭菌后的种子播撒在不含蔗糖和激素的灭菌后的MS固体培养基上，在25±1℃光照条件下培养3～5周后，选取下胚轴、茎尖作为外植体，剪碎移入MS诱导固体培养基中，在25±1℃光照条件下培养2～6周，即得到愈伤组织；
2)细胞的制备
将步骤1)得到愈伤组织连续培养2～4代，在无菌条件下，挑取细胞形态好的细胞团块继续接种培养，经挑选的细胞培养物培养1～2代挑选一次，直到所获得的细胞团为疏松颗粒状为止，然后将颗粒状的细胞团置于MS液体培养基进行摇瓶培养，过滤筛选得到单个细胞或者含有2～5个细胞的小细胞团；
3)原生质体的制备和细胞克隆的获得
按原生质体制备的常规方法将步骤2)得到单个细胞或者含有2～5个细胞的小细胞团分解过筛制备得到原生质体细胞，再将原生质体细胞孵育后分离培养，选取细胞壁恢复快、细胞分裂生长正常、迅速的单细胞后代作为备选细胞克隆，经2～20次传代筛选后获得所需细胞克隆；
4)克隆细胞的收集
挑选步骤3)的细胞克隆，培养10～25天后置于干净的纱布上，用蒸馏水冲洗，去除多余的琼脂后，置于40～60℃的干燥培养箱中，处理12～36h后，得到细胞粉末；
5)烟草细胞提取物的制备
a、称取步骤4)得到细胞粉末，加入10～30倍重量的体积分数为50～95％乙醇溶液回流提取1～3h，重复2～3次，收集提取液过滤减压浓缩至1.18～1.22g/cm3；得到初级烟草细胞提取液；
b、向初级烟草细胞提取液中加入其重量10～40％的丙二醇，搅拌均匀，然后进行分子蒸馏分离，得到分子蒸馏轻组分即为烟草细胞提取物。
2.根据权利要求1所述烟草细胞提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，MS诱导固体培养基中含有质量分数为0.05～0.3％的萘乙酸、质量分数为0.05～0.25％的2，4-二氯苯氧乙酸、质量分数为0.01～0.5％的6-苄基嘌呤和质量分数为0.1～1.0％的蔗糖。
3.根据权利要求1或2所述烟草细胞提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤5)的第b小步中，分子蒸馏分离的工艺参数为：真空度≤1.0tor，刮板转速至50～400r/min，蒸馏温度35～60℃，冷凝温度-15～0℃，蒸馏速度0.2～1.0Kg/h。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510115159.2A CN104783324B (zh) | 2015-03-17 | 2015-03-17 | 烟草细胞提取物的制备方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510115159.2A CN104783324B (zh) | 2015-03-17 | 2015-03-17 | 烟草细胞提取物的制备方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104783324A CN104783324A (zh) | 2015-07-22 |
| CN104783324B true CN104783324B (zh) | 2016-08-17 |
Family
ID=53548871
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510115159.2A Active CN104783324B (zh) | 2015-03-17 | 2015-03-17 | 烟草细胞提取物的制备方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104783324B (zh) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106924138A (zh) * | 2017-03-23 | 2017-07-07 | 广州翰江生物科技有限公司 | 一种中草药活性物的制备方法 |
| CN106924137A (zh) * | 2017-03-23 | 2017-07-07 | 广州翰江生物科技有限公司 | 一种气垫粉底液及其制备方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BRPI0619656C1 (pt) * | 2005-10-31 | 2011-12-20 | Unhwa | método para isolar um clone de célula única derivada de um procámbio vegetal, clone resultante, método de produção de substáncias vegetais biologicamente ativas e método de preservação de uma linha de célula vegetal |
| CN102894466B (zh) * | 2012-07-18 | 2014-12-31 | 深圳市华旭升香料有限公司 | 一种改性烟草提取物的制备方法 |
| KR101738715B1 (ko) * | 2013-01-30 | 2017-05-22 | 서울대학교산학협력단 | 식물 줄기세포 또는 식물 역분화 줄기 세포의 추출물을 이용한 맞춤형 만능줄기세포의 유도 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 만능줄기세포 |
| CN103352023B (zh) * | 2013-07-08 | 2014-10-29 | 浙江大学 | 大麦原生质体制备及peg介导转化方法 |
| CN103720031A (zh) * | 2013-12-19 | 2014-04-16 | 云南中烟昆船瑞升科技有限公司 | 一种烟草提取物的制备方法及该提取物在卷烟中的应用 |
-
2015
- 2015-03-17 CN CN201510115159.2A patent/CN104783324B/zh active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104783324A (zh) | 2015-07-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Sakila et al. | Micropropagation of strawberry (Fragaria x ananassa Duch.) a newly introduced crop in Bangladesh | |
| CN107182780A (zh) | 滇黄精的育苗方法 | |
| CN105475130A (zh) | 一种红锥高效离体培养植株再生方法 | |
| CN109429973A (zh) | 一种雪茄烟的制备方法 | |
| CN103081807B (zh) | 耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法 | |
| CN102960239A (zh) | 红肉苹果的培育方法 | |
| Naz et al. | In vitro propagation of tuberose (Polianthes tuberosa) | |
| CN105766654B (zh) | 一种南川木菠萝组织培养方法 | |
| CN102771397B (zh) | 一种金铁锁不定根培养体系的建立与扩大培养方法 | |
| CN104783324B (zh) | 烟草细胞提取物的制备方法 | |
| CN109819892B (zh) | 一种草果优良单株的组织培养方法 | |
| CN112970588B (zh) | 一种黄樟愈伤组织高效诱导不定芽分化的繁育方法 | |
| CN108834894B (zh) | 一种钩藤的组织培养方法 | |
| CN104687232B (zh) | 一种用于雪雅香卷烟产品的专用烟叶生产方法 | |
| CN102342246A (zh) | 一种大白杜鹃组培快速繁殖方法 | |
| CN103503771A (zh) | 澳洲紫蔓豆种苗的组培快繁方法 | |
| CN106613172A (zh) | 一种广东从化天湖道地金线莲原生态种植方法 | |
| CN104160867A (zh) | 一种田间套种麦冬改善烤烟品质的方法 | |
| CN103109745A (zh) | 一种试管内脱除烟草花叶病毒和无毒苗的快速繁殖方法 | |
| Jha et al. | Micropropagation of Dendrocalamus hamiltonii through nodal explants | |
| CN107411161B (zh) | 一种降低上部烟叶烟碱和淀粉含量的方法 | |
| CN105660276A (zh) | 一种银杏树的栽植方法 | |
| CN104221663A (zh) | 一种田间套种沙参改善烤烟品质的方法 | |
| CN106631179A (zh) | 一种用于烤烟品种nc55的专用移栽基质配方 | |
| CN105900834B (zh) | 一种黄樟离体植株再生的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| EXSB | Decision made by sipo to initiate substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |