CN104783324A - 烟草细胞提取液的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种烟草细胞提取物的制备方法，该方法通过愈伤组织的获得、细胞的制备、原生质体的制备和细胞克隆的获得、克隆细胞的收集和烟草细胞提取物的制备的五大步骤获得烟草细胞提取物；本发明的优点是：不占用有效烟叶资源、可控性强、加工周期短、投入低、无污染等，制备的烟草细胞提取物有效成分含量高，能赋予卷烟甜香和清香香韵，柔和细腻烟气，提高烟气浓度，增加香气量，增加甜感，降低刺激。
Description
技术领域
本发明涉及一种工程细胞的培养和提取方法，具体地指一种烟草细胞提取液的制备方法。
背景技术
植物组织培养即植物无菌培养技术，又称离体培养，是根据植物细胞具有全能性的理论，利用植物体离体的器官(如根、茎、叶、茎尖、花、果实等)、组织(如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等)或细胞(如大孢子、小孢子、体细胞等)以及原生质体，在无菌和适宜的人工培养基及温度等人工条件下，能诱导出愈伤组织、不定芽、不定根，最后形成完整的植株的学科。植物组织培养具有培养条件可以人为控制，生长周期短，繁殖率高，而且管理方便，利于工厂化生产和自动化控制的特点。其优势也非常明显，如下所示：
1)占用空间小，不受地区、季节限制；
2)可短时间大量繁殖，用于拯救濒危植物；
3)可诱导之分化成需要的器官，如根和芽；
4)解决有些植物产种子少或无的难题；
5)不存在变异，可保持原母本的一切遗传特征；
6)投资少，经济效益高；
7)繁殖方式多，试用品种多。
烟用香精香料是卷烟产品的灵魂。全世界的烟草行业都高度重视烟用香精香料的开发和应用，而且把能生产高品质香精香料的技术当作自己的秘密武器，以谋求在激烈的市场竞争中占据有利的地位。香精香料在卷烟中可以起到掩盖缺点、改善烟草香气和吃味、改进烟草的物理性能、赋予卷烟独特的口味和风格的作用，并且可以实现产品品质差异化，稳定卷烟抽吸品质，对于卷烟的风格和品质形成有重要影响。同时天然香精香料以其源自天然，各有效成分比例协调，绿色、环保、降害作用明显的特点，在中式卷烟核心技术的形成中，其作用将会越来越重要，尤其是在改善卷烟嗅香与吸味，构筑卷烟独特的口味和风格方面，作用更加明显。而在众多的天然香精香料品种中，烟草提取物具有其它品种提取物不可比拟的优势。首先，烟草提取物来自于烟叶，其成分种类和烟叶基本一致；其次，提取物不会对烟支带来不良气味；第三，提取后的烟草余料还可以用于烟草薄片的生产，达到循环利用的目的。
目前的烟草提取物主要是从烟叶中提取，该方法具有一定的缺陷和不足：
1)烟叶植株的生长过程中易收到温度、雨水、光照、虫害、人员素质等因素的影响；
2)需要牺牲大量的耕地面积，同时烟叶施肥还容易造成土壤板结，引起土地养分严重失调；
3)由于原料来源的不稳定性，导致提取物品质波动；
4)由于烟叶资源的有限性，导致烟叶原料需求无法得到满足。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种烟草细胞提取物的制备方法。该方法利用植物细胞培养技术，通过大规模培养高产烟草工程细胞，获得大量的烟草细胞，并对培养的细胞进行提取分离，最终得到高质量的烟草提取物。本方法具有不占用有效烟叶资源、可控性强、加工周期短、投入低、无污染的特点。通过本方法制备得到的烟草细胞提取物有效成分含量高，能赋予卷烟甜香和清香香韵，柔和细腻烟气，提高烟气浓度，增加香气量，增加甜感，降低刺激。
为解决上述技术问题，本发明提供的一种烟草细胞提取物的制备方法，包括以下步骤：
1)愈伤组织的获得
选取常规烤烟品种的裸种，用体积分数为75％的酒精冲洗2～3次，再用质量分数为0.1％的HgCl2溶液处理3～10min，无菌水冲洗3～5次，然后将灭菌后的种子播撒在不含蔗糖和激素的灭菌后的MS固体培养基上，在25±1℃光照条件下培养3～5周后，选取下胚轴、茎尖等作为外植体，剪碎移入MS诱导固体培养基中，在25±1℃光照条件下培养2～6周，即得到愈伤组织；
2)细胞的制备
将步骤1)得到愈伤组织连续培养2～4代，在无菌条件下，挑取细胞形态好的细胞团块继续接种培养，经挑选的细胞培养物培养1～2代挑选一次，直到所获得的细胞团为疏松颗粒状为止，然后将颗粒状的细胞团置于MS液体培养基进行摇瓶培养，过滤筛选得到单个细胞或者含有2～5个细胞的小细胞团；
3)原生质体的制备和细胞克隆的获得
按原生质体制备的常规方法将步骤2)得到单个细胞或者含有2～5个细胞的小细胞团分解过筛制备得到原生质体细胞，再将原生质体细胞孵育后分离培养，选取细胞壁恢复快、细胞分裂生长正常、迅速的单细胞后代作为备选细胞克隆，经2～20次传代筛选后获得所需细胞克隆；
4)克隆细胞的收集
挑选步骤3)的细胞克隆,培养10～25天后置于干净的纱布上，用蒸馏水冲洗，去除多余的琼脂后，置于40～60℃的干燥培养箱中，处理12～36h后，得到细胞粉末；
5)烟草细胞提取物的制备
a、称取步骤4)得到细胞粉末，加入10～30倍重量的体积分数为50～95％乙醇溶液回流提取1～3h，重复2～3次，收集提取液过滤减压浓缩至1.18～1.22g/cm3；得到初级烟草细胞提取液；
b、向初级烟草细胞提取液中加入其重量10～40％的丙二醇，搅拌均匀，然后进行分子蒸馏分离，得到分子蒸馏轻组分即为烟草细胞提取物。
进一步地，所述步骤1)中，MS诱导培养基中含有质量分数为0.05～0.3％的萘乙酸(NAA)、质量分数为0.05～0.25％的2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、质量分数为0.01～0.5％的6-苄基嘌呤(6-BA)和质量分数为0.1～1.0％的蔗糖。
再进一步地，所述步骤5)的第b小步中，分子蒸馏分离的工艺参数为：真空度≤1.0tor，刮板转速至50～400r/min，蒸馏温度35～60℃，冷凝温度-15～0℃，蒸馏速度0.2～1.0Kg/h。
本发明的有益效果在于：
本发明的优点是：不占用有效烟叶资源、可控性强、加工周期短、投入低、无污染等，制备的烟草细胞提取物有效成分含量高，能赋予卷烟甜香和清香香韵，柔和细腻烟气，提高烟气浓度，增加香气量，增加甜感，降低刺激。
附图说明
图1为获得的愈伤组织；
图2为大量培养的烟草工程细胞株；
图3是烟草细胞烘干前后照片对比；
图4是烟草细胞提取物主要致香成分总离子流图；
具体实施方式
为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。
实施例1
烟草细胞提取物的制备方法，包括以下步骤：
1)愈伤组织的获得
选取常规烤烟品种的裸种，用体积分数为75％的酒精冲洗2次，再用质量分数为0.1％的HgCl2溶液处理6min，无菌水冲洗5次，然后将灭菌后的种子播撒在不含蔗糖和激素的灭菌后的MS固体培养基上，在25±1℃光照条件下培养3周后，选取下胚轴、茎尖等作为外植体，剪碎移入MS诱导固体培养基中，在25±1℃光照条件下培养4周，即得到愈伤组织；所述MS诱导培养基中含有质量分数为0.05％的萘乙酸(NAA)、质量分数为0.15％的2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、质量分数为0.01～0.5％的6-苄基嘌呤(6-BA)和质量分数为0.1～1.0％的蔗糖。
2)细胞的制备
将步骤1)得到愈伤组织连续培养3代，在无菌条件下，挑取细胞形态好的细胞团块继续接种培养，经挑选的细胞培养物培养1代(2-4周)挑选一次，直到所获得的细胞团为疏松颗粒状为止，然后将颗粒状的细胞团置于MS液体培养基进行摇瓶培养，过滤筛选得到单个细胞或者含有2～5个细胞的小细胞团；
3)原生质体的制备和细胞克隆的获得
按原生质体制备的常规方法将步骤2)得到单个细胞或者含有2～5个细胞的小细胞团分解过筛制备得到原生质体细胞，再将原生质体细胞孵育后分离培养，选取细胞壁恢复快、细胞分裂生长正常、迅速的单细胞后代作为备选细胞克隆，经5次传代筛选后获得所需细胞克隆；
4)克隆细胞的收集
挑选步骤3)的细胞克隆,培养10天后置于干净的纱布上，用蒸馏水冲洗，去除多余的琼脂后，置于50℃的干燥培养箱中，处理18h后，得到细胞粉末；
5)烟草细胞提取物的制备
a、称取步骤4)得到细胞粉末，加入15倍重量的体积分数为70％乙醇溶液回流提取2h，重复2次，收集提取液过滤减压浓缩至1.20g/cm3；得到初级烟草细胞提取液；
b、向初级烟草细胞提取液中加入其重量20％的丙二醇，搅拌均匀，然后进行分子蒸馏分离，分子蒸馏分离的工艺参数为：真空度为0.40tor，刮板转速至80r/min，蒸馏温度35℃，冷凝温度-10℃，蒸馏速度0.20Kg/h；得到分子蒸馏轻组分即为烟草细胞提取物1。
实施例2
烟草细胞提取物的制备方法，包括以下步骤：
1)愈伤组织的获得
选取常规烤烟品种的裸种，用体积分数为75％的酒精冲洗2次，再用质量分数为0.1％的HgCl2溶液处理10min，无菌水冲洗5次，然后将灭菌后的种子播撒在不含蔗糖和激素的灭菌后的MS固体培养基上，在25±1℃光照条件下培养3周后，选取下胚轴、茎尖等作为外植体，剪碎移入MS诱导固体培养基中，在25±1℃光照条件下培养6周，即得到愈伤组织；其中，MS诱导培养基中含有质量分数为0.05％的萘乙酸、质量分数为0.15％的2，4-二氯苯氧乙酸、质量分数为0.01～0.5％的6-苄基嘌呤和质量分数为0.1～1.0％的蔗糖。
2)细胞的制备
将步骤1)得到愈伤组织连续培养4代，在无菌条件下，挑取细胞形态好的细胞团块继续接种培养，经挑选的细胞培养物培养2代(2-4周)挑选一次，直到所获得的细胞团为疏松颗粒状为止，然后将颗粒状的细胞团置于MS液体培养基进行摇瓶培养，过滤筛选得到单个细胞或者含有2～5个细胞的小细胞团；
3)原生质体的制备和细胞克隆的获得
按原生质体制备的常规方法将步骤2)得到单个细胞或者含有2～5个细胞的小细胞团分解过筛制备得到原生质体细胞，再将原生质体细胞孵育后分离培养，选取细胞壁恢复快、细胞分裂生长正常、迅速的单细胞后代作为备选细胞克隆，经2次传代筛选后获得所需细胞克隆；
4)克隆细胞的收集
挑选步骤3)的细胞克隆,培养20天后置于干净的纱布上，用蒸馏水冲洗，去除多余的琼脂后，置于40℃的干燥培养箱中，处理24h后，得到细胞粉末；
5)烟草细胞提取物的制备
a、称取步骤4)得到细胞粉末，加入10倍重量的体积分数为95％乙醇溶液回流提取2h，重复2次，收集提取液过滤减压浓缩至1.22g/cm3；得到初级烟草细胞提取液；
b、向初级烟草细胞提取液中加入其重量10％的丙二醇，搅拌均匀，然后进行分子蒸馏分离，分子蒸馏分离的工艺参数为：真空度为0.2tor，刮板转速至300r/min，蒸馏温度35℃，冷凝温度-5℃，蒸馏速度0.6Kg/h，得到分子蒸馏轻组分即为烟草细胞提取物2。
实施例3
烟草细胞提取物的制备方法，包括以下步骤：
1)愈伤组织的获得
选取常规烤烟品种的裸种，用体积分数为75％的酒精冲洗2次，再用质量分数为0.1％的HgCl2溶液处理8min，无菌水冲洗3次，然后将灭菌后的种子播撒在不含蔗糖和激素的灭菌后的MS固体培养基上，在25±1℃光照条件下培养5周后，选取下胚轴、茎尖等作为外植体，剪碎移入MS诱导固体培养基中，在25±1℃光照条件下培养3周，即得到愈伤组织；其中，MS诱导培养基中含有质量分数为0.3％的萘乙酸、质量分数为0.25％的2，4-二氯苯氧乙酸、质量分数为0.01～0.5％的6-苄基嘌呤和质量分数为0.1～1.0％的蔗糖。
2)细胞的制备
将步骤1)得到愈伤组织连续培养3代，在无菌条件下，挑取细胞形态好的细胞团块继续接种培养，经挑选的细胞培养物培养2代挑选一次，直到所获得的细胞团为疏松颗粒状为止，然后将颗粒状的细胞团置于MS液体培养基进行摇瓶培养，过滤筛选得到单个细胞或者含有2～5个细胞的小细胞团；
3)原生质体的制备和细胞克隆的获得
按原生质体制备的常规方法将步骤2)得到单个细胞或者含有2～5个细胞的小细胞团分解过筛制备得到原生质体细胞，再将原生质体细胞孵育后分离培养，选取细胞壁恢复快、细胞分裂生长正常、迅速的单细胞后代作为备选细胞克隆，经10次传代筛选后获得所需细胞克隆；
4)克隆细胞的收集
挑选步骤3)的细胞克隆，培养20天后置于干净的纱布上，用蒸馏水冲洗，去除多余的琼脂后，置于60℃的干燥培养箱中，处理12h后，得到细胞粉末；
5)烟草细胞提取物的制备
a、称取步骤4)得到细胞粉末，加入30倍重量的体积分数为75％乙醇溶液回流提取2h，重复3次，收集提取液过滤减压浓缩至1.18g/cm3；得到初级烟草细胞提取液；
b、向初级烟草细胞提取液中加入其重量40％的丙二醇，搅拌均匀，然后进行分子蒸馏分离，分子蒸馏分离的工艺参数为：真空度为0.5tor，刮板转速至400r/min，蒸馏温度35℃，冷凝温度0℃，蒸馏速度1.0Kg/h；得到分子蒸馏轻组分即为烟草细胞提取物3。
实施例4
烟草细胞提取物的制备方法，包括以下步骤：
1)愈伤组织的获得
选取常规烤烟品种的裸种，用体积分数为75％的酒精冲洗2次，再用质量分数为0.1％的HgCl2溶液处理6min，无菌水冲洗3次，然后将灭菌后的种子播撒在不含蔗糖和激素的灭菌后的MS固体培养基上，在25±1℃光照条件下培养5周后，选取下胚轴、茎尖等作为外植体，剪碎移入MS诱导固体培养基中，在25±1℃光照条件下培养5周，即得到愈伤组织；其中，MS诱导培养基中含有质量分数为0.2％的萘乙酸、质量分数为0.1％的2，4-二氯苯氧乙酸、质量分数为0.01～0.5％的6-苄基嘌呤和质量分数为0.1～1.0％的蔗糖。
2)细胞的制备
将步骤1)得到愈伤组织连续培养4代，在无菌条件下，挑取细胞形态好的细胞团块继续接种培养，经挑选的细胞培养物培养1～2代挑选一次，直到所获得的细胞团为疏松颗粒状为止，然后将颗粒状的细胞团置于MS液体培养基进行摇瓶培养，过滤筛选得到单个细胞或者含有2～5个细胞的小细胞团；
3)原生质体的制备和细胞克隆的获得
按原生质体制备的常规方法将步骤2)得到单个细胞或者含有2～5个细胞的小细胞团分解过筛制备得到原生质体细胞，再将原生质体细胞孵育后分离培养，选取细胞壁恢复快、细胞分裂生长正常、迅速的单细胞后代作为备选细胞克隆，经15次传代筛选后获得所需细胞克隆；
4)克隆细胞的收集
挑选步骤3)的细胞克隆，培养18天后置于干净的纱布上，用蒸馏水冲洗，去除多余的琼脂后，置于40℃的干燥培养箱中，处理36h后，得到细胞粉末；
5)烟草细胞提取物的制备
a、称取步骤4)得到细胞粉末，加入105倍重量的体积分数为55％乙醇溶液回流提取2h，重复2次，收集提取液过滤减压浓缩至1.20g/cm3；得到初级烟草细胞提取液；
b、向初级烟草细胞提取液中加入其重量15％的丙二醇，搅拌均匀，然后进行分子蒸馏分离，分子蒸馏分离的工艺参数为：真空度为0.2tor，刮板转速至150r/min，蒸馏温度40℃，冷凝温度-10℃，蒸馏速度0.5Kg/h；得到分子蒸馏轻组分即为烟草细胞提取物4。
将实施例1制备得到烟草细胞提取物1进行成分检测
表1.烟草细胞提取物中主要挥发性成分种类及含量
如图4和表1所示：以上成分中的糠醛、5-甲基糠醛可以赋予卷烟清甜香，增加卷烟烟气甜感；茄酮能增加烟草香，使烟气丰满细腻；巨豆三烯酮具有增加烟草甜香，使烟气和顺的作用；苯乙醛能增加烟香；西柏三烯二醇可以丰满烟气体香；新植二烯能增进烤烟香气。
表2.烟草细胞提取物感官评吸分值
从卷烟感官评吸结果来看，烟草细胞提取物在光泽、卷烟香气、烟气协调性、掩盖杂气、降低刺激性和改善口腔余味方面均优于对照样，这说明烟草细胞提取物在卷烟中具有较好地应用效果。
表3.烟草细胞提取物卷烟评价结果
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
Claims (3)
1.一种烟草细胞提取物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)愈伤组织的获得
选取常规烤烟品种的裸种，用体积分数为75％的酒精冲洗2～3次，再用质量分数为0.1％的HgCl2溶液处理3～10min，无菌水冲洗3～5次，然后将灭菌后的种子播撒在不含蔗糖和激素的灭菌后的MS固体培养基上，在25±1℃光照条件下培养3～5周后，选取下胚轴、茎尖等作为外植体，剪碎移入MS诱导固体培养基中，在25±1℃光照条件下培养2～6周，即得到愈伤组织；
2)细胞的制备
将步骤1)得到愈伤组织连续培养2～4代，在无菌条件下，挑取细胞形态好的细胞团块继续接种培养，经挑选的细胞培养物培养1～2代挑选一次，直到所获得的细胞团为疏松颗粒状为止，然后将颗粒状的细胞团置于MS液体培养基进行摇瓶培养，过滤筛选得到单个细胞或者含有2～5个细胞的小细胞团；
3)原生质体的制备和细胞克隆的获得
按原生质体制备的常规方法将步骤2)得到单个细胞或者含有2～5个细胞的小细胞团分解过筛制备得到原生质体细胞，再将原生质体细胞孵育后分离培养，选取细胞壁恢复快、细胞分裂生长正常、迅速的单细胞后代作为备选细胞克隆，经2～20次传代筛选后获得所需细胞克隆；
4)克隆细胞的收集
挑选步骤3)的细胞克隆，培养10～25天后置于干净的纱布上，用蒸馏水冲洗，去除多余的琼脂后，置于40～60℃的干燥培养箱中，处理12～36h后，得到细胞粉末；
5)烟草细胞提取物的制备
a、称取步骤4)得到细胞粉末，加入10～30倍重量的体积分数为50～95％乙醇溶液回流提取1～3h，重复2～3次，收集提取液过滤减压浓缩至1.18～1.22g/cm3；得到初级烟草细胞提取液；
b、向初级烟草细胞提取液中加入其重量10～40％的丙二醇，搅拌均匀，然后进行分子蒸馏分离，得到分子蒸馏轻组分即为烟草细胞提取物。
2.根据权利要求1所述烟草细胞提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤1)中，MS诱导培养基中含有质量分数为0.05～0.3％的萘乙酸、质量分数为0.05～0.25％的2，4-二氯苯氧乙酸、质量分数为0.01～0.5％的6-苄基嘌呤和质量分数为0.1～1.0％的蔗糖。
3.根据权利要求1或2所述烟草细胞提取物的制备方法，其特征在于：所述步骤5)的第b小步中，分子蒸馏分离的工艺参数为：真空度≤1.0tor，刮板转速至50～400r/min，蒸馏温度35～60℃，冷凝温度-15～0℃，蒸馏速度0.2～1.0Kg/h。
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