CN103352023A

CN103352023A - 大麦原生质体制备及peg介导转化方法

Info

Publication number: CN103352023A
Application number: CN2013102852105A
Authority: CN
Inventors: 边红武; 韩凝; 朱睦元; 白玉
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2013-07-08
Filing date: 2013-07-08
Publication date: 2013-10-16
Anticipated expiration: 2033-07-08
Also published as: CN103352023B

Abstract

本发明涉及原生质体的培养技术，旨在提供一种大麦原生质体制备及PEG介导转化方法。该方法包括：大麦幼苗的培养、原生质体的制备，以及大麦原生质体的PEG介导转化过程，涉及酶液、W5试剂、PEG–Ca2+试剂、WI试剂的使用。与悬浮细胞体系相比，本发明以大麦幼苗为材料更加省时，省力。通过选取大麦幼苗的茎及叶片为材料，进行原生质体的的提取与转化，均能得到理想的转化效率，转化效率为70%-80 %。

Description

大麦原生质体制备及PEG介导转化方法

技术领域

本发明涉及原生质体的培养技术，特别涉及一种PEG介导的大麦原生质体高效瞬时转化体系。

背景技术

大麦是禾本科大麦属的一年或越年生草本植物，具有生育期短、早熟、气候适应性广以及适合轮作等特性，在世界各地广泛种植，为全球栽培的第四大和谷类作物。用途广泛，主要用于动物饲料、麦芽制造、食品制造、医药等方面。虽然目前有很多方法进行大麦转基因，但是效率低，并且费时费力，严重影响了对大麦遗传及分子方面的研究。

在过去的数年中，植物原生质体的培养及转化体系有了较大的进步。原生质体转化试验操作简单，省时经济，可应用于基因表达、蛋白定位、蛋白互作、胁迫、激素及代谢通路等的研究。在以大麦为材料的研究中，曾有从悬浮细胞中提取原生质体，但是目前还没有以大麦原生质体为材料进行基因转化的报道。

发明内容

本发明要解决的问题是，克服现有技术中的不足，提供一种大麦原生质体制备及PEG介导转化方法。

为解决技术问题，本发明的解决方案是：

提供一种用于PEG介导转化的大麦原生质体的制备方法，包括以下步骤：

（一）大麦幼苗的培养

大麦种子经自来水中浸泡2 h后，用10％次氯酸钠表面消毒30 min，再用ddH₂O清洗8次；消毒后的种子平铺在湿滤纸上，25℃下萌发；36h后，种子露白，选取长势良好的种子进行水培法培养：在pH 5.8的0.1mmol·L^-1 CaCl₂培养液中，以8小时光照/16小时黑暗的条件于25℃培养5天后，得到用于原生质体提取试验的大麦幼苗；

（二）原生质体的制备

（1）首先配制酶液10ml和0.3M甘露醇10 ml；

所述酶液的组份为：0.3 M的甘露醇、10 mM的MES、1.5%（wt/vol）的纤维素酶R10、0.75%（wt/vol）的离析酶R10、1mM的CaCl₂、0.1%（wt/vol）的BSA、1 mM的β-巯基乙醇，余量为ddH₂O；

（2）取50棵幼苗的茎段或5-7片叶子于灭菌的滤纸上，用新的刀片将其切成0.5-1 mm的薄片，切好后迅速加到有10 ml 0.3 M甘露醇的100 ml三角瓶中，以锡箔纸包好三角瓶，黑暗中放置10 min；

（3）用移液器弃甘露醇，尽量吸净；加入10 ml酶液，锡箔纸包好三角瓶，放入真空罐中，抽真空条件200 psi以下，平板摇床上30转/分钟培养30 min；从真空罐中取出三角瓶，空气中平板摇床上30转/分钟，培养3.5 h；

（4）加入等体积的W5试剂，平板摇床上40转/分钟，培养10 min；

所述W5试剂的组份为：154 mM 的NaCl、125 mM 的CaCl₂、5 mM的KCl 、2 mM 的MES ，余量为ddH₂O ；

（5）用W5试剂润湿100目的细胞筛，过滤步骤（4）中的培养产物，滤液用50 ml圆底离心管收集，再用20ml W5试剂冲洗；

（6）500 rcf常温离心3 min后，吸去上清；试管底部为绿色的一层原生质体；

（7）加入2 ml W5试剂，轻柔摇晃离心管，使细胞悬浮；吸取细胞悬浮液至10ml圆底离心管中，锡箔纸包好使离心管避光，原生质体自然沉降30 min后，500 rcf离心3 min；移液器小心移去上清；留在圆底离心管底部的即为大麦原生质体。

本发明还提供了利用所述大麦原生质体的PEG介导转化方法，包括以下步骤：

（1）在2 ml圆底离心管中加入5 ug的 pUGW11-GFP质粒，ddH₂O定容至10 ul混匀；再加入100 ul所述大麦原生质体，轻轻混匀后，加入110 ul PEG–Ca²⁺试剂，轻轻混匀后，于25 ℃室温、黑暗放置20 min；

以大麦幼苗的茎为材料时，PEG–Ca²⁺试剂的组份为：0.3 M的甘露醇、0.1 M 的CaCl₂、40%W/V的PEG 4000，余量为ddH₂O；

以大麦幼苗的叶片为材料时，PEG–Ca²⁺试剂的组份为：0.4 M的甘露醇、0.1 M 的CaCl₂、40%W/V的PEG 4000，余量为ddH₂O；

（2）缓慢加入440 ul W5试剂，缓慢颠倒试管，500 rcf离心3 min，小心移去上清；

（3）向试管中加入含50 ug/ml Amp（氨苄青霉素）的WI试剂，如果使用12孔板，每管加入400 ul WI试剂；如果使用24孔板，则每管加250 ul WI试剂；轻轻混匀，然后转移到多孔板上，室温黑暗培养16h，得到原生质体的转化产物；

所述WI试剂的组份为：0.5 M的甘露醇、20 mM的KCl、4 mM的MES、余量为ddH₂O 。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

与悬浮细胞体系相比，本发明以大麦幼苗为材料更加省时，省力。通过选取大麦幼苗的茎及叶片为材料，进行原生质体的的提取与转化，均能得到理想的转化效率，转化效率为70 %-80 %。

附图说明

图1为大麦原生质体的形态观察结果（叶片来源）。

图2为大麦原生质体的形态观察结果（茎来源）。

图3为叶来源原生质体转化后的绿色荧光蛋白表达观察结果。

图4为茎来源原生质体转化后的绿色荧光蛋白表达观察结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例子对本发明的实现方式进行详细描述。

试剂及配方：

（一）母液（均用0.45 um过滤器抽滤灭菌）

1、0.2 M MES，pH 5.7（Sigma）

2、0.8 M 甘露醇（Sigma）

3、1M NaCl（Sigma）

4、1 M CaCl₂（Sigma）

5、2 M KCl（Sigma）

6、2 M MgCl₂（Sigma）

7、10% (wt/vol) BSA（Sangon）

（二）试剂配方

1、酶液（现配）的组份为：0.3 M的甘露醇、10 mM的MES、1.5%（wt/vol）的纤维素酶R10、0.75%（wt/vol）的离析酶R10、1mM的CaCl₂、0.1%（wt/vol）的BSA、1 mM的β-巯基乙醇，余量为ddH₂O；

表1 配制10 ml酶液所需试剂的用量

2、W5试剂（可室温保存）的组份为：154 mM 的NaCl、125 mM 的CaCl₂、5 mM 的KCl 、2 mM 的MES ，余量为ddH₂O ；

表2 配制250 ml W5所需试剂的用量

成分	用量（g）	终浓度
			1 M NaCl	2.249 g	154 mM
1 M CaCl₂	3.468 g	125 mM
			2 M KCl	0.0186 g	5 mM
0.2 M MES	0.213 g	2 mM
			ddH₂O	定容至250 ml
Total	250 ml

3、MMG试剂（可室温保存）的组份为：0.3 M的甘露醇，15 mM 的MgCl₂，4 mM的MES、余量为ddH₂O。

表3 配制10 ml MMG所需试剂的用量

4、 PEG–Ca²⁺试剂（至少转化前1h配置，可在室温下贮存5天，但最好当天配置）：

以大麦幼苗的叶片为材料时，PEG–Ca²⁺试剂的组份为：0.4 M的甘露醇、0.1 M 的CaCl₂、40%W/V的PEG 4000，余量为ddH₂O。

表4.1配制5 ml 含0.3 M甘露醇的PEG–Ca²⁺所需试剂的用量

成分	用量	终浓度
			0.8 M 甘露醇	1.875 ml	0.3 M
1M CaCl₂	0.5 ml	0.1 M
			ddH₂O	定容至5ml
PEG 4000	2.0 g	40%(W/V)
			Total	5 ml

表4.2配制5ml 含0.4 M甘露醇的 PEG–Ca²⁺所需试剂的用量

成分	用量	终浓度
			0.8 M 甘露醇	2.5 ml	0.4 M
1M CaCl₂	0.5 ml	0.1 M
			ddH₂O
PEG 4000	2.0 g	40%(W/V)
			Total	5 ml

5、WI试剂（可室温保存）的组份为：0.5 M的甘露醇、20 mM的 KCl、4 mM的MES，余量为ddH₂O。

表5 配制10 ml WI各试剂的用量

实验步骤：

一、大麦幼苗的培养

以品种名称为“金色的希望”（拉丁名Hordeum vulgare L., cv.Golden promise）的大麦为试验对象。将其种子经自来水中浸泡2h后，用10 ％次氯酸钠表面消毒30 min，再用ddH2O清洗8次。消毒后的种子平铺在湿滤纸上，25 ℃下萌发。约36 h后，种子露白，选取长势良好（即芽和根均萌发）的种子进行水培法培养。在含0.1mmol·L^-1 CaCl₂培养液（pH 5.8）中，25℃，光照培养（8小时光照/16小时黑暗条件）约5天后，进行原生质体提取试验。

二、原生质体的制备

1.首先配置酶液10 ml及0.3 M甘露醇10 ml。

2.取50棵苗的茎段或5-7片叶子于灭菌的滤纸上，用新的刀片将其切成0.5-1 mm的薄片，切好后迅速加到含10 ml 0.3 M甘露醇的100ml三角瓶中，锡箔纸包好，避光放置10 min。

3.用移液器吸去甘露醇，尽量吸净。加入10 ml酶液，锡箔纸包好，抽真空条件下，平板摇床上30转/分钟培养30 min。取出三角瓶，空气中平板摇床上30转/分钟培养3.5 h。

4.加入等体积的W5试剂，平板摇床上40转/分钟培养10 min。

5.用W5试剂润湿100目的细胞筛，过滤步骤（4）中的培养产物，滤液用50ml圆底离心管收集，再用20 ml W5试剂冲洗。

6.500 rcf常温离心3 min，吸去上清。试管底部为绿色的一层原生质体。

7.加入2ml W5试剂，轻柔的摇晃离心管，使原生质体悬浮。吸取原生质体悬浮液至10 ml圆底离心管中，锡箔纸包好，自然沉降30 min。500 rcf离心3 min。移液器小心移去上清。留在圆底离心管底部的即为大麦原生质体。

镜检的过程：

加入1 ml MMG试剂，使原生质体悬浮。取10 ul进行镜检，依据镜检观察的细胞密度加入适量的MMG试剂，使原生质体浓度达到大约2×10⁶/ml。

提取后显微镜观察，放大200倍的结果如图1、2所示。

三、原生质体的转化

1.在2 ml离心管中依次加入5 ug的pUGW11-GFP质粒，ddH₂O定容至10 ul混匀，加入100 ul制备获得的大麦原生质体，轻轻混匀后，然后加入110 ul PEG–Ca²⁺试剂，再轻轻混匀。于25 ℃室温、黑暗放置20 min。

以大麦幼苗的茎为材料时，PEG–Ca²⁺试剂的组份为：0.3 M的甘露醇、0.1 M 的CaCl₂、40%W/V的PEG 4000，余量为ddH₂O；以大麦幼苗的叶片为材料时，PEG–Ca²⁺试剂的组份为：0.4 M的甘露醇、0.1 M的CaCl₂、40%W/V的PEG 4000，余量为ddH₂O。

2.缓慢加入440 ul W5试剂，缓慢颠倒试管，500 rcf离心3 min，小心移去上清。

3.加入含50 ug/ml Amp的WI试剂，如果使用12孔板，每管加入400ul WI试剂，如果使用24孔板，则每管加250 ul WI试剂。轻轻混匀，然后转移到多孔板上，室温黑暗培养16h，得到原生质体的转化产物。

试验用到的表达基因为35S::GFP-FLAG，表达载体为pUGW11，分别以叶片及茎为材料制备的原生质体，观察到的转化结果如图3、4.其中，GFP为490 nm激发光下观察到绿色荧光蛋白表达的结果，红色是叶绿体自发荧光，Merged为叶绿体自发荧光（红色）与GFP表达（绿色）叠加得到的结果，Bright为可见光下观察结果。转化效率均达到70% 以上。

实验材料说明：

“金色的希望”（拉丁名Hordeum vulgare L., cv. Goldenpromise）是国内外大麦转基因研究最经典的品种之一。本发明以该品种大麦为原生质体分离制备和瞬时转化研究的试验材料，获得了理想的实验结果。因此，本发明为其他品种大麦的相关研究亦提供参考。

Claims

1.用于PEG介导转化的大麦原生质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（一）大麦幼苗的培养

（二）原生质体的制备

（1）首先配制酶液10ml和0.3M甘露醇10 ml；

2.利用权利要求1所述大麦原生质体的PEG介导转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

（3）向试管中加入含50 ug/ml Amp的WI试剂，如果使用12孔板，每管加入400 ul WI试剂；如果使用24孔板，则每管加250 ul WI试剂；轻轻混匀，然后转移到多孔板上，室温黑暗培养16h，得到原生质体的转化产物；