CN101297028A - 通过同步化植物细胞培养的次级代谢产物批量生产的稳定化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种通过改进均质细胞系使细胞生长和生产的变化最小化的方法。更具体地，其为从前形成层或形成层分离并增殖单细胞克隆的方法，通过解决在长期培养过程中细胞生长和产率的下降问题，增强来自植物的生物活性物质生产的稳定性。
Description
技术领域
植物在我们生活中的应用越来越重要了，它不仅是我们食物的供应者，而且还是许多化学物质的来源，如药物、香精、颜料、农业化学药品和染料等都来源于植物。由植物生产的生物活性物质大部分是次级代谢产物。因为绝大多数次级代谢产物用作生理活性物质，所以人们对这些次级代谢产物具有很大的兴趣，诸如生物碱、过敏原、氨基酸、蒽醌、白血病抑制剂、杀菌剂、肿瘤抑制剂、抗病毒试剂、酶、类黄酮、杀虫剂、鸦片剂、香料、色素、维生素和多糖等。根据Zhong(2002)报道，大约存在100,000种次级代谢产物已被人们所知；在实践使用的药物中有25％以上来源于植物。每年都有新发现的次级代谢产物产生。
在获得这些代谢产物的方法中仍然存在许多问题，诸如，虽然近年来有机化学飞速发展但是仍难于化学合成这些代谢产物，因过度开采和污染环境造成对自然界的破坏和因季节、地区和气候等生产条件的变化代谢产物的成分发生改变并造成生产成本增加。因此，通过体外培养技术生产次级代谢产物的方法正处在积极研制阶段，这种体外培养技术即使在很小的空间内也可以适当控制外部环境条件进行大规模生产。
背景技术
根据韩国专利0130100，通过植物细胞培养生产生物活性物质比直接从植物中提取这些物质有更多的优点。植物细胞培养不仅不受环境影响而且可以解决生态破坏的问题，所以这种方法被认为是能够进行连续生产的最佳方法。
但是，Nail和Roberts(2004)指出用植物细胞培养生产次级代谢产物生长速率慢且产率较低。为了解决这一问题，Zhong(2002)进行了优化培养基、培养条件、工艺和诱导条件等从而提高产率的研究)。在国际专利WO93/17121中，各种培养基被用于培养多种紫杉以便增加细胞生长速率和紫杉醇(paclitaxel)产率。实验的结果指出了生产大量紫杉醇的诱导条件。尽管这种方法提高了有价值的次级代谢产物的生产，然而对于从紫杉中生产紫杉醇或从许多植物中生产有价值的代谢物质来说可变性仍然是主要问题。
只有当在长期培养过程中稳定地保持细胞快速生长和代谢产物的高产量时，通过大规模的植物细胞培养来生产次级代谢产物才有商业化的可能。可产生独特代谢产物的细胞系的性能不稳定，这种不稳定在继代培养中导致细胞系丧失它们最初的产率；还不能太多的说成功和失败取决于我们如何克服这些问题。
在植物细胞培养中，尽管细胞来源于一种植物，但每个细胞系代谢产物的产率不同且不稳定。因此，建立具有高产率和遗传稳定性的细胞系比任何其它事情都重要。
来自单细胞和多细胞的细胞系
来自单细胞植物细胞系比来自多细胞的植物细胞系具有较低的可变性；这导致细胞系的产率来自单细胞高于来自多细胞的。在在先发明中，茎、根、种子、针叶和叶子被用作最好的外植体来诱导细胞系的产生。这些茎、根、种子、针叶和叶子是由不同功能和形态的细胞构成的组织。来自这些组织中的愈伤组织细胞系不止一种。因此，在试图降低来自由多细胞构成的组织的愈伤组织的变种产率方面存在一些限制。
细胞凝集
植物细胞培养的一个明显特征是细胞凝集。根据专利0364478记载，植物细胞的直径为30-300μm，大约比动物细胞大30倍。由于植物细胞具有粘附在一起的天然趋势，所以不可能得到仅仅由分散的单个细胞构成的悬浮液。细胞凝集的比例和尺寸随植物种类和培养物生长的培养基变化而变化。Nail和Roberts指出，细胞凝集导致细胞内外局部环境的不同，这导致了培养物的异质性并最终可导致生长和代谢的变化。
悬浮培养的目的是得到纯的单个细胞。为了实现该目标，可以使用过滤、离析和通过酶的原生质培养方法。但是，过滤和离析并不能获得完全纯化的单个细胞。去除细胞壁的原生质培养技术是产生单细胞的最可靠方法，但是用于培养原生质的酶可引起细胞壁损伤或破损，最终导致细胞生理系统的变化。此外，疏水的次级代谢产物诸如紫杉醇可储存在细胞壁中，使细胞壁的变化与产率之间具有意义深远的关系。
而且，细胞凝集已经是对细胞生长的计数精确测定和对独立细胞的生物化学分析的主要障碍。根据Nail和Roberts(2004)报道，如果单个细胞培养成为可能，将会容易地获得关于培养中细胞单位活动的更快的信息，诸如次级代谢产物中的生物合成、储存和降解等信息。
去分化
由于无性系变异，作为愈伤组织的去分化细胞系在次级代谢方面有很大的可变性。即便微环境略微不同，来自永久组织诸如由具有不同功能和形态的细胞构成的叶片、茎、根和种子的愈伤组织也通常显示戏剧性的变化，因为其为通过去分化形成的次级分裂组织。由于这种敏感性，Hirasuna等(1996)的调查证实了细胞培养的条件，尤其是初始细胞密度，继代培养间隔和温度，并尽可能精确地保持它们。
按比例扩大
为了通过植物细胞培养生产次级代谢产物以便商业化，按比例扩大是必须的。在许多专利和已出版的文章报道了有关通过实验室细胞培养成功产生代谢产物之后，生物反应器已经被用于大规模生产。根据专利0290004记载，通过生物反应器进行大规模生产的培养环境条件解决了在实验室生产代谢产物生长速率慢和产率低的问题。当生物反应器被用于大规模生产时，生长速率、产率和代谢产物的变化变成了通过细胞培养生产生物活性物质商业化的问题。在植物细胞培养的按比例扩大中，通过外部动力接收空气的生物反应器或者通过混合和通风率的具有叶轮的生物反应器是优选的。但是，在生物反应器中细胞发育能力突然下降是因为植物细胞对于切变很脆弱。因此，降低切变的方法成为了必须要解决的问题。植物细胞的切变敏感性的原因在于其较大的尺寸、刚性细胞壁、凝集和广泛形成的液泡(Yokoi等，1993)。为了解决生物反应器中的这些问题，过去通过控制其搅拌速度并修改叶轮类型，从而研究了切变生成较低的生物反应器。但是，这仍然没有得到积极的结果，因为细胞系不能克服微环境差别的影响。
低温储藏
低温储藏通过在极低温度下停止细胞的绝大部分新陈代谢来长期保持细胞。这意味着在低温储藏以后，细胞的遗传、特性和生物合成的变化都处于停止状态。使用低温储藏可消除因为污染造成的细胞损失并且可最小化连续细胞系中的遗传变异。在环鸟苷酸(cGMP)中，为了稳定供应原材料，必须强制保证细胞系的长期保藏。通常培养的动物细胞可低温储藏许多年，但用类似的低温储藏技术保藏培养的植物细胞却具有很大的挑战性。培养的植物细胞是不均质的并显示出生理和形态上的差异。因此，植物悬浮细胞要求许多程序才能低温储藏，不充分的低温储藏可引起变异。
调节因子
Kim等(2000)证明如果把具有分裂活性培养物的培养基加入到丧失细胞分裂能力的培养物中，可刺激细胞分裂。在通过玫瑰花悬浮培养生产花青素时，当将一些草莓悬浮培养物的培养基加入到玫瑰花悬浮培养物中时花青素产率会增加。在该方式中，从培养的细胞中产生和分泌刺激细胞生长的或者次级代谢产物产生的因子被称为调节因子。然而，这些调节因子并没有被具体地鉴别，仅仅理解为用于细胞生长和代谢产物产生的化学信号。而且，很少有报道认为它们是有效物质，诸如被认为是调节因子的磷酸盐和钙调素(calmodulin)等。调节因子可通过条件培养基或者辅助细胞供应。
灌流培养法
在细胞培养方法中，有一种在开始时一起接种细胞和培养基并且不再添加养分的成批培养法。另有一种连续培养法，其在培养过程中，当回收用过的培养基中的代谢产物的同时以一致的速度补充新的培养基以防止养分损耗。
由于产率较低，成批培养法很难商业化。在连续培养方法中，近年来灌流培养逐渐引起了注意。在灌流培养中，细胞保持在生物反应器中，当回收用过的培养基中的代谢产物的同时补充新的培养基。
根据Zhang等(2000)报道，诱导是在细胞培养中促进次级代谢产物产生的最有效方式之一。诱导虽然促进了次级代谢产物的合成，但其抑制了细胞生长和降低了细胞发育能力。因此，通过诱导的次级代谢产物合成仅仅可被保持很短一段时间，且数量非常有限。如同Wang等(2001)所提出的那样，灌流培养法是一种能使这些诱导产生的负面效果最小化和使产率最大化的策略。
Wang等(2001)，Wu和Lin(2003)报道了如下内容。通过诱导产生的次级代谢产物被存储在细胞内部(液泡或者细胞壁中)或者被释放到细胞之外(培养基中)。在培养过程中，从细胞中释放次级代谢产物并将其从培养基中除去可使纯化更容易并可减小生物合成和降解的反馈抑制以及产物转化。因此，通过回收用过的培养基并提供新的培养基，内外代谢产物的分泌物可延长细胞的发育能力和生物合成。并且这种方法可显著地增加产率。
由于细胞系的不同，次级代谢产物的储存和分泌也有非常大的差异。紫杉培养基细胞系(Wickremesinhe和Arteca，1994)没有分泌任何物质。因此，需要建立具有显著分泌能力的细胞系。
前形成层或形成层培养
前形成层或形成层是位于植物侧面上的侧生分生组织。在裸子植物和木本双子叶植物中，由于分生组织的连续不断的增长造成了增殖性生长；结果，存在具有11,000年以上生长轮的巨大植物。在遗传学中，前形成层或形成层可被分为初级分生组织和次级分生组织。初级分生组织以种子萌发后在植物生长过程中胚胎发生和生长过程中形成的分生组织为代表。次级分生组织以由植物永久组织去分化形成的分生组织为代表。形成层是前形成层的连续性分生而没有永久组织介入的初级分生组织。
初级分生组织的生长是不确定的，如果条件适合还可继续生长。因此，前形成层或形成层培养已经被用于细胞的快速大量繁殖中。
在前述研究中，形成层外植体制备如下：在树皮被剥去后，树干上切有两个约1mm深间隔为5mm的纵向切口以便到达木质部。这些外植体被称为‘形成层’，其由部分韧皮部、形成层和小片木质部构成(Jouria等，1998)。
合理地说，通过上述方法诱导的细胞不仅仅是形成层来源，而是多种组织的来源，其在解剖学上可严格地被划分为诸如韧皮部、形成层和木质部。因此，可指出上述方法不是从构成树干的各种组织中仅仅分离形成层的理想技术。也因此需要发明从树干的各种组织仅分离前形成层或形成层的创造性方法。
发明内容
技术问题
本发明的目的是产生通过仅仅从短枝和树干分离和培养前形成层或形成层的生产单细胞克隆的方法。为了使其更具体，本发明的目标是解决植物细胞培养的变化，并通过结合物理细胞分离法和生理化学细胞分离法，利用解剖刀分离前述纯的前形成层或形成层，创造植物生物学活性物质的稳定生产方法。
本发明的另一目的是仅仅分离并培养来自紫杉短枝的前形成层或形成层和创造紫杉醇的生产方法。
技术方案
为了实现上述目标，本发明通过分离并培养来自紫杉短枝或者树干的前形成层或形成层而得到单细胞克隆并提供稳定的细胞增殖和紫杉醇的生产方法。特别是，通过得到单细胞克隆的稳定的细胞增殖和生产紫杉醇的方法如下：
1)制备植物材料并分离前形成层或形成层；
2)从分离的前形成层或形成层诱导单细胞克隆；
3)建立长期培养；
4)建立细胞悬浮培养物；
5)按比例扩大；
6)通过诱导子、调节因子和灌流培养进行紫杉醇生产；
7)用低温储藏建立细胞库。
有益效果
根据本发明的方法，能够培养单细胞克隆，单细胞克隆不通过从木本植物短枝或树干的各种组织仅仅精确分离前形成层或形成层的去分化而具有初级分生组织的连续分生性。由于在长期培养过程中细胞生长率和生长模式变化的变少，本发明的细胞系能够保持生物活性物质的稳定生产。其对于商业水平大规模生产来说同样是理想的，因为与来自于前述技术的细胞系相比，由于凝集和多液泡的减少，其对生物反应器中切变的敏感性降低。
通过向细胞系中添加调节因子可刺激代谢产物的活化，并且通过灌流培养细胞将相当大量的产物释放到细胞外培养基中可延长细胞活力和生物合成性能。由于在低温储藏之后这种细胞系的均质性和分裂能力能够很好地恢复，所以设计了用低温储藏建立细胞库。本发明确认了培养物的均质性和次级代谢产物的变异之间具有密切关系。由于本发明的方法控制并降低了不同生物活性物质产生的变异性，所以本发明的方法可用于商业化的战略。
附图说明
图1显示从前形成层或形成层诱导单细胞克隆过程中被分离的部分。
图2显示来自前形成层或形成层、胚芽和针叶的三种不同细胞培养物的总生物产量表达得生长率。
图3显示来自两种不同组织(胚芽或针叶和形成层)的培养物的细胞凝集图像。
图4显示紫杉悬浮培养过程中紫杉醇产生方面的诱导效果。
图5是紫杉悬浮培养过程中紫杉醇产生方面的调节因子的效果。
具体实施方式
下面将解释本发明的实施例。从前形成层或形成层诱导和增殖单细胞克隆的方法不仅在紫杉醇生产系统中被利用，而且还可在所有植物次级代谢产物生产系统中利用。下列实施例仅作为说明，而不是对本发明的限制。
<实施例1>植物材料的制备和前形成层或形成层的分离
收集紫杉树的种子、针叶、短枝。收集完后，将它们立即沉淀在100mg/L抗氧化剂和抗坏血酸溶液(L-抗坏血酸，DUCHEFA，Netherlands)中并转移和保藏。考虑材料的形态和生理特性，对它们的表面进行灭菌。
①种子：用70％的酒精对种子灭菌一分钟，之后将它们浸入到1％的次氯酸钠溶液中48小时，随后用无菌水洗涤3到4次。接着，在0.5％的PVP(聚乙烯吡咯烷酮，DUCHEFA，Netherlands)和50mg/L抗坏血酸(L-抗坏血酸，DUCHEFA，Netherlands)以及70mg/L柠檬酸(DUCHEFA，Netherlands)溶液中，胚芽从种子中分离并在愈伤组织诱导培养基中培养。
②针叶和短枝：用含有1％苯菌灵(Dongbu Hannong Chemical，Korea)+1％百菌清(Dongbu Hannong Chemical，Korea)+1％硫酸链霉素(DUCHEFA，The Netherlands)+0.1％头孢噻肟钠(DUCHEFA，TheNetherlands)的溶液处理24小时之后，将针叶和短枝用自来水漂洗30秒以除去残余化学物质和酚化合物。将它们按顺序用70％的酒精(DC Chemical，Korea)灭菌1分钟、30％过氧化氢(LG Chemical，Korea)灭菌15分钟，1％CLOROX溶液灭菌15分钟、3％CLOROX溶液灭菌5分钟后，将它们用蒸馏水洗涤3到4次。为了防止氧化，将针叶的两端在0.5％PVP，50mg/L抗坏血酸和70mg/L柠檬酸溶液中切割并在愈伤组织诱导培养基上培养。
③从短枝或茎制备前形成层或形成层：通过用钳子保持短枝或茎的中心区的木质部，剥去皮层、表皮组织和包括前形成层或形成层的韧皮部。将剥下的含有前形成层或形成层的组织放置在培养基上；允许前形成层或形成层与培养基表面接触。
<实施例2>从分离的前形成层或形成层诱导单细胞克隆
从培养的第4到7天之后观察前形成层或形成层的细胞分裂，培养的第15天愈伤组织开始从皮层、表皮组织和韧皮部的上部即前形成层或形成层中形成。在培养的第30天，前形成层或形成层开始从包含韧皮部和皮层以及表皮的上层组织中分离；在这两层完全自然分离之后，分别将它们在不同的培养板上培养(图1)。
为了诱导细胞和愈伤组织，可使用植物细胞和组织培养的公知培养基：例如mB5(改性的Gamberg’s B5培养基)，MS(Murashige&Skoog培养基)，WPM(Lloyed&McCown)，SM(schenk&Hildebrand培养基)，LP(Quoirin&Lepiovre)。所有这些培养基都可以应用。在需要时，可添加各种添加剂，并且根据需要培养基的成分可减少或除去。在这些培养基中，最合适的培养基是mB5。表1列出了mB5的成分。
表1红豆杉中细胞系诱导和维持培养基
在25±1℃黑暗环境下，培养物在添加植物生长调节因子、植物激素(1-3mg/L)的培养基中生长。
前形成层或形成层由均质细胞构成，所以其细胞以均匀方式分裂并且以板的形式增殖。另一方面，韧皮部、皮层及表皮的组织因为细胞组成不同造成细胞分裂后产生不同的细胞，从而表皮层以不规则的形式增殖。于是，前形成层或形成层和含有韧皮部、皮层及表皮的组织之间自动分层(图1)。前形成层或形成层是均质的，含有韧皮部、皮层及表皮的组织是异质的，所以上下层之间的自动裂层视为不同分裂速率造成的结果。
培养的第15天之后，在由异质细胞构成的胚芽和针叶的外植体上经过分化形成愈伤组织，并且由于各种细胞的分裂速率不同，这些愈伤组织以不规则的形式增殖，就像包含韧皮部、皮层以及表皮的组织那样(图1)。
<实施例3>长期培养的建立
在这些愈伤组织中，白色的、易碎的愈伤组织具有良好生长率，这些部分每21天在新的培养基上继代培养。来源于胚芽和针叶的培养物的生长速率非常不稳定，通常显示变褐的趋势。相反，来源于前形成层或形成层的培养物的生长速度很快并且培养物没有颜色变化。因此，这样的培养物能够选出稳定的细胞。
在培养六个月之后，绝大多数来源于胚芽和针叶的培养物为黄色或者浅褐色并形成凝集。来源于前形成层或形成层的培养物为白-黄色并以单个细胞或者小的细胞蔟形式存在。转变成褐色并凝集的形成使培养物的生长速率降低，培养物由于它们所分泌的酚类化学物质存在而逐渐死亡。
本发明表明：维持和大量增殖来源于胚芽和针叶的培养物在6个月后就变得很困难；但对于来源于前形成层或形成层的培养物来说，稳定维持20个月以后，细胞生长速率、生长模式和凝集水平仍没有任何变化(图2)。换言之，生长模式方面的变化，取决于初始植物材料均质性和异质性。
<实施例4>细胞悬浮培养物的建立
来源于胚芽和针叶以及来源于前形成层或形成层的培养物分别在含有液体培养基的长颈瓶中培养(表2)。
表2红豆杉中的悬浮培养基
以两周为继代间隔，培养物在25±1℃黑暗的100rpm摇床上培养，这样培养物可以连续保持较高活力即指数生长期。
测定作为细胞产率变化的主要原因的凝集水平。用生物显微镜(CX31，Olympus，Japan)测定细胞凝集量。上述实验结果见表3。
表3紫杉长期培养的细胞凝集类型
大细胞凝集：尺寸大于1.5×103μm；
中等细胞凝集：1×103μm；
小细胞凝集：4×102μm＜尺寸＜1×103μm
在来自胚芽和针叶的培养物悬浮液中，大约60％的细胞凝集尺寸超过1.5mm，但在来自前形成层或形成层的培养物悬浮液中，90％的细胞都以单个细胞形式培养。
<实施例5>按比例扩大
在25±1℃的黑暗环境下，来自胚芽和针叶以及来自前形成层或形成层的培养物在3L气升式生物反应器(Sung-Won SciTech，Korea)中培养。
与在长颈瓶中培养物相比，来自胚芽和针叶的培养物的细胞大小和形状有很大变化。凝集细胞的直径可大到2-3mm，从而抑制了生物反应器内物质的流动性增加了未混合区域。由粘附在生物反应器的内壁上的细胞为准形成生长环。因为不能提供充分培养基，生长环中心的细胞在20天后死亡。死亡的细胞会分泌毒性物质并且这些毒性物质会降低生物反应器中所有细胞的活力。相反，来自前形成层或形成层培养物细胞的较少凝集会引起生物反应器中空气的平缓循环；因此其能够将送气量从每分钟200ml降低到每分钟150ml，在培养基表面上形成的气泡的量也因此极大地减少。
来自胚芽和针叶的培养物在长颈瓶中的倍增时间为12天，但在生物反应器中延长为21天。这是因为由于细胞凝集和刚性细胞壁对切变敏感而导致了生长环形成和细胞活力的快速下降。来自前形成层或形成层的培养物的倍增时间为4到5天，并且在长颈瓶和生物反应器中没有差别，甚至倍增时间在生物反应器中变短(表4)。来自前形成层或形成层的培养物在生物反应器中形成非常小的生长环，并且生长环很容易通过以简单的刺激搅拌培养基而溶解。此外，由于细胞凝集较少和更多的液泡，对切变敏感性较低，因此细胞活力没有下降。
表4东北红豆杉(T.cuspidata)细胞培养物在长颈瓶和生物反应器中倍增时间模式与外植体来源之间的关系
<实施例6>诱导子
诱导子能够控制植物细胞中的分子信号，因此对于增加次级代谢物的产率有广泛的应用。在用茉莉酮酸甲酯诱导子和其它10种诱导子处理之后，我们观察到茉莉酮酸甲酯对紫杉醇生产具有积极影响。通过结合茉莉酮酸甲酯与其它诱导子能够得到相当高的代谢物产率。特别是，使用茉莉酮酸甲酯、壳聚糖和苯丙氨酸进行处理对于紫杉醇生产非常有效(图4)。
<实施例7>调节因子
当细胞正在生长或者停止生长时会产生来源于次级代谢的物质。因此，两阶段培养对于生产代谢产物是合适的，例如紫杉醇的细胞生长阶段和代谢产物产生阶段是分开的，这样非常适合生产代谢产物。在第一阶段，通过优化细胞生长使细胞最大化增殖，在第二阶段，通过改变培养条件来优化产生的代谢产物。
与具有低产率的细胞系相比，具有高次级代谢产物产率的细胞系长得更慢但死得更快。因此，大量增殖是困难的并代谢产物的大量生产是不可能的。
在本发明中，没有将具有低增殖和高产率能力的细胞系用于大规模增殖，而将它们用作有助于次级代谢产物产生的调节因子的辅助细胞。在加入辅助细胞之后我们观察到产生了紫杉醇。其结果可参见图5。
<实施例8>灌流培养
在培养的第14天，用诱导子处理来自胚芽和针叶以及来自前形成层或形成层的培养物。从诱导的那一时间起，每5天用吸液管在无菌状态下回收用过的培养基并同时补充相同量的新培养基。在45天长期培养后可观察到细胞和培养基中紫杉醇的产生。其结果可参见表5。
表5来源于各种外植体的东北红豆杉细胞的紫杉醇的产生和释放
诱导5天之后将更新培养基一起合成到细胞培养物中，即将50mg/L壳聚糖、0.1mM苯基丙氨酸和100μM茉莉酸甲酯添加到用过14天的培养物中。以每5天重复更新培养基而进行实验。
细胞释放到培养基中的紫杉醇依细胞系不同而不同。来源于前形成层或形成层的培养物的释放能力高于现有技术的培养物的释放能力。此外，灌流培养的应用有利于次级代谢产物释放到培养基中。周期性地更换培养基对加强由来源于前形成层或形成层的单细胞克隆向细胞外释放次级代谢产物是非常重要的，因为其允许生物量和简单纯化的连续循环。
换言之，在来源于前形成层或形成层的单细胞克隆培养中培养基的周期性更换可被认为是在长期培养中产生有价值的代谢产物的稳定方法，因为它防止了细胞中积累的代谢产物的反馈抑制、培养基中代谢产物的降解和转化。
<实施例9>低温储藏
在培养的第6或第7天，悬浮的细胞在含有0.16M甘露醇的培养基中室温下预培养3天，然后在4℃下保持3小时。收集细胞并将其置于含有40％乙二醇(Sigma，USA)和30％山梨醇(DUCHEFA，The Netherlands)的培养基的4ml冷冻管中，在4℃下培养3分钟。
细胞在液氮中浸泡后，用低温冷冻储藏法处理悬浮细胞。为了融化，将放入液氮中超过10分钟的培养细胞在40℃水浴中融化1-2分钟。为了使细胞再生长，低温储藏的细胞被转移到含有0.5M山梨醇的半固体生长培养基(表1)上并在室温下缓解(alleviate)30分钟。细胞在含有0.1M山梨醇的半固体生长培养基上培养24小时。然后，细胞在不含山梨醇的半固体生长培养基上培养24小时，两次。评估细胞活力。
<实施例10>紫杉醇含量分析
将细胞从回收的样品培养基中分离之后，分析紫杉酮的含量。在用真空烘干器(Sam Shin Glass，Korea)完全干燥细胞后，测定细胞量。在室温下混合大约100mg(干重)细胞与4ml甲醇(Sigma，USA)溶液(1∶1v/v)以及氯甲烷(Sigma，USA)，以一小时为间隔用超声波除垢器(Branson，USA)提取3次。待细胞完全干燥后，用4ml氯甲烷多次提取。真空干燥分离的有机溶剂层并且将残渣溶解在1ml甲醇中。溶解的提取物同样通过超声波除垢器搅拌。然后，离心后除去颗粒(8,000gX5min)。
从细胞分离的培养基(1-5ml)与相同体积的氯甲烷混合并在充分搅拌后提取3次。有机溶剂经完全真空干燥后，将其再次溶解到0.5ml的甲醇中。
用HPLC(高效液相色谱，Shiseido，Japan)进行含量分析，用Sigma产品进行紫杉醇标准物质测定。通过使用炉子用Capcell pak(C18，MGII，5um，3.0mmX250mm，Shiseido，Japan)保持在40℃的温度，以水和氰化甲烷(acetonitril，Burdick&Jackson，USA)(50∶50，v/v)为流动相，并以0.5ml/min的速度有规律的滴落。使用UV-VIS探测器(227nm，Shiseido，Japan)。
工业实用性
在本发明中，通过单纯从短枝或树干中分离由于比现有技术的细胞系更短的倍增时间而导致的更高产率的前形成层或形成层，获得单克隆细胞、具有分裂组织连续性而不去分化的初级分裂组织。由于在长期培养过程中细胞生长和生长模式中更小地变化，还允许稳定的产率，并且由于细胞系的更少凝集和多个液泡，按比例扩大是可能的。在低温储藏之后该细胞系可被回收而在遗传上没有任何变化。
Claims (10)
1、一种植物细胞培养方法，其特征在于，从植物组织分离前形成层或形成层，其包括下列步骤：
①收集植物组织后灭菌
②从灭菌的植物组织分离前形成层或形成层
③从前形成层或形成层诱导单细胞系
2、根据权利要求1所述的植物细胞培养方法，其特征在于，通过使用单细胞克隆利用具有用于植物细胞培养的调节因子的辅助细胞进行植物细胞培养。
3、根据权利要求1所述的植物细胞培养方法，其特征在于，通过回收单细胞克隆培养的用过的培养基并供给新的培养基来延长细胞活力和生物合成。
4、根据权利要求1所述的植物细胞培养方法，其特征在于，使用单细胞克隆的低温储藏建立细胞库。
5、一种植物生物活性物质的生产方法，其特征在于，利用通过权利要求1所述的方法利用单细胞克隆或其培养基进行诱导。
6、根据权利要求5所述的植物生物活性物质的生产方法，其特征在于，通过茉莉酮酸甲酯处理来增加产率。
7、根据权利要求6所述的植物生物活性物质的生产方法，其特征在于，通过茉莉酮酸甲酯、苯丙氨酸和壳聚糖处理来增加产率。
8、根据权利要求5所述的植物生物活性物质的生产方法，其特征在于，通过使用单细胞克隆利用具有用于植物生物活性物质的调节因子的辅助细胞进行植物生物活性物质的生产。
9、根据权利要求5所述的植物生物活性物质的生产方法，其特征在于，回收单细胞克隆培养的用过的培养基并供给新的培养基来延长细胞活力和生物合成。
10、根据权利要求5所述的植物生物活性物质的生产方法，其特征在于，使用单细胞克隆的低温储藏建立细胞库。
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