KR100290004B1 - 생물반응기에서 주목세포 배양에 의한 탁솔 및 그 유도체의 고수율 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 주목나무에서 유래된 식물세포를 생물반응에서 배양하여 항암물질인 탁솔 및 그 유도체를 생산하는 데 있어서, 생물반응기에서 생산되어 유출되는 가스속에 포함되어 있는 이산화탄소 및 휘발성 물질을 재순환시켜 공급하여 탁솔 및 그 유도체를 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법을 적용한 결과 탁솔 및 그 유도체의 생산성이 현저히 증가하였고, 세포의 성장속도도 빨라졌다.

Description

생물반응기에서 주목세포 배양에 의한 탁솔 및 그 유도체의 고수율 생산방법

제1도는 공기부양식 반응기에서 가스순환식 공정의 흐름을 개략적으로 묘사한 것이다.

본 발명은 주목에서 유리된 식물세포를 생물반응기에서 대량 배양하여 항암물질인 탁솔 및 그 유도체를 제조하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 주목나무 세포를 생물반응기에서 대량 배양시 나타나는 여러 문제점을 해결하여 탁솔 및 그 유도체를 고수율로 생산하는 방법에 관한 것이다.

탁솔은 최근 항암제로서 각광을 받고있는 물질로서 구조가 매무 복잡하고, 고 기능성이 가지는 다이터펜 알칼로이드(diterpene alkaloid)이다. 탁솔 유도체들은 탁솔과 같이 탁세인링(taxane ring)구조를 가지며, 세팔로마닌(cephalomanine), 10-디아세틸 세팔로마닌, 바카틴 III(baccatin III), 10-디아세틸 바카틴 III 등이 알려져 있으며 탁솔과 함께 주목 및 주목세포에 대부분 함유되어 있는 물질이다.

탁솔의 항암 효과는 매우 특이하게도 마이토시스(mitosis)를 억제하는데 주로 튜블린 중합반응(tubulin polymerization)을 촉진하여 매우 안정하며 기능을 상실한 마이크로튜블(microtubles)로 유도함으로서 항암효과를 발휘한다. 탁솔이 발견초기에는 주로 백혈병(leukemia) 시스템에 대한 억제효과로 부터 시작하여 그후 난소암, 유방암 등 여러 종양시스템에 대한 탁월한 효과가 입증되었다. 최근에 미국 FDA의 허가를 받아 난소암 치료제로 시판되고 있으며 국내에서도 조만간 시판될 예정으로 알려져 있다.

그동안 탁솔의 공급은 주목나무로부터 추출에 의하여 이루어졌으나 주목의 난벌에 의한 환경파괴가 문제시되면서 화학적 합성이나 주목세포 배양에 의한 생산방법 등으로 방향이 바꾸어 지고 있다. 특히 주목나무 세포 배양에 의한 생산 방법은 외부 환경의 영향을 받지 않고 지속적으로 생산이 가능하므로, 탁솔의 공급 부족이나 생태계 파괴와 같은 현안 문제들은 해결할 수 있는 적절한 방법으로 여겨지고 있다. 세포배양에 의한 탁솔생산에 대한 방법은 미국특허 제 5,019,504호에 개시된 이래 많은 연구 논문과 특허에 의하여 발전되어 왔으며 본 발명자도 탁솔의 고수율 세포배양 제조방법을 특허출원중인 상태이다(1993년 특허출원 제 10693호).

주목나무 세포 배양에 의한 탁솔생산에 대한 성공적인 실험실 규모의 연구결과가 많은 특허와 논문으로 발표된 후, 대량생산을 위한 생물반응기의 적용이 이루어지고 있다. 이때 반응기에서 대량 배양을 하게되면 실험실 규모와 플라스크 배양과 매우 다른 배양 환경을 제공하게 되며 이로 인한 세포의 생장과 탁솔의 생산성에 변화가 생기기 마련이다. 일반적으로 생장속도가 떨어지고 생산성이 감소하며 생산물의 조성에도 변화를 보이는 경우가 많다. 이렇게 대량 생산을 위한 생물반응기 적용시 발생하는 생산성 및 조성의 변화는 주목세포 배양에 의한 탁솔의 상업화과정에서 하나의 문제점으로 제기되고 있다.

본 발명의 목적은 생물반응기에서 주목나무 세포 배양시 탁솔 생산의 효율을 높일 수 있는 배양조건을 밝혀냄으로써 세포생장 저하, 탁솔 및 그 유도체의 생산성 감소와 조성변화와 같은 문제점을 해결한 세포배양에 의한 탁솔 및 그 유도체를 고수율로 생산하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 생물반응기내에 공기의 이산화탄소 및/또는 휘발성 물질의 농도를 주목나무 세포 배양에 적합한 일정수준으로 유지하는 것으로 구성되어 있으며, 그 유지 수단으로는 생물반응기에서 유출되는 이산화탄소 및/또는 휘발성 물질을 재순환시키는 방법을 사용한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용되는 생물반응기는 공기부양식(airlift)반응기와 교반탱크형(stirred tank) 반응기, 기포탑(bubble column) 반응기 및 회전드럼식(rotary drum) 반응기이고, 식물세포는 주목나무 세포이고, 배양형태는 현탁배양(suspension culture) 및 고정화 배양(immobilized cell culture)이다.

생물반응기에서 주목나무 세포를 현탁배양하기 위하여 필수적으로 공기와 같이 산소를 포함하는 가스(gas)를 공급(aeration)하여야 한다. 또한 식물세포 배양에서는 산소의 공급 못지않게 이산화탄소나 휘발성 물질의 유지가 중요하다. 그러나 산소를 공급하여 위하여 반응기에 공급된 공기는 반응기 밖으로 배출될 때 이산화탄소와 휘발성 물질들도 같이 유출(stripping)시켜 결국에는 반응기내의 주목나무 세포의 생장과 탁솔생산을 위한 미세환경(microenvironment)의 변화를 초래하여 생산성을 감소시키는 결과를 보인다.

본 발명에서는 이러한 문제점을 해결하기 위하여 반응기로 공급되는 공기에 이산화탄소와 휘발성 물질을 첨가하여 공급함으로서 반응기 내에 적당량의 이산화탄소와 휘발성 물질이 유지되도록 하였다. 여기서 말하는 적당량의 이산화탄소와 휘발성 물질의 농도는 주목나무 세포 배양에 적합한 농도를 지칭한다. 또한 휘발성 물질은 매우 다양하게 존재할 수 있지만, 대표적으로 식물 호르몬인 에틸렌(ethylene)을 대상으로 연구하였다. 이렇게 공급되는 공기에 이산화탄소와 휘발성물질을 같이 공급하여 생물반응기에서 주목나무 세포 현탁배양을 실시한 결과 탁솔 및 그 유도체의 생산성이 현저히 증가하였고 세포의 성장속도도 빨라졌다.

또한 본 발명자는 생물반응기에서 이산화탄소 및 휘발성 물질의 유출을 억제하는 새로운 공정을 개발하였다. 반응기로부터 유출되는 가스의 일부 또는 전부를 순화시켜 반응기로 다시 공급하는 순화식 생물반응기 운전 공정을 개발하였다. 이 공정은 반응기 내에서 배양중 생산된 이산화탄소와 휘발정 물질을 유출시키지 않고 재사용하기 때문에 주목나무 세포 배양에 적합한 이산화탄소 및 휘발성 물질의 유지가 가능하다는 장점을 가지고 있다. 특히 순환되는 가스의 중간경로에 가스 저장 탱크를 설치하여 순환되어 반응기로 공급되는 가스의 유용성분 농도를 조절할 수 있게 하여 반응기에서의 주목나무 세포 배양환경을 더욱더 향상시킬 수 있었다. 개발된 가스 순환식 생물반응기에서 주목나무 세포 현탁배양을 한 결과 탁솔 및 그 유도체들의 생산이 현저히 증가하였고 세포의 생장상태도 우수하였다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 좀 더 구체적으로 설명하나 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[참고예 1]

5리터의 내용적을 갖는 공기부양식 반응기에서 주목나무 세포를 배양하였다. 배지는 SH 기본 배지에 NAA 5ppm을 첨가한 액체배지를 이용하였고 배양온도는 25℃로 일정하게 유지하였다. 최초 주목세포 접종량은 15%(v/v)로 하였고 공기 주입량은 분당 200㎖를 유지하였다. 배양을 하면서 주목나무 세포의 생장상태와 탁솔 및 그유도체의 생산성을 분석하였다.

상기와 같은 조건으로 공기 부양식 반응기에서 주목나무 세포를 배양하였는데 이때 공급하는 공기에 이산화탄소를 첨가하였다. 공급되는 공기중의 이산화탄소 농도는 4%를 유지하였다. 또한 공급되는 공기에 이산화탄소 뿐 아니라 휘발성 물질인 에틸렌을 공급하여 배양하였다. 이때 이산화탄소의 농도는 4%, 에틸렌의 농도는 20ppm으로 하였다. 각각의 경우 배양하면서 주목나무 세포의 생장과 탁솔 및 그 유도체의 생성을 분석하였다. 표 1은 공급하는 공기에 이산화탄소 및 에틸렌의 유무에 따른 주목나무 세포 생장과 탁솔의 생산성을 나타내는 결과이다. 이산화탄소를 공급하였을 때 공기만을 주입할 때보다 세포 생장 및 탁솔 생산이 우수하였고 에틸렌을 함께 주입했을 때 이산화탄소 단독 주입의 경우 보다 결과가 우수하였다.

[표 1]

[참고예 2]

참고예 1과 동일한 주목나무 세포 배양을 교반탱크형 반응기에서 실시하였다. 모든 배양 조건은 참고예 1과 같고 교반속도는 150rpm으로 유지하였다. 이산화탄소와 에틸렌을 참고예 1과 같은 조건으로 공급하는 각각의 경우로 배양하면서 주목나무 세포의 생장과 탁솔 생성을 분석하였다. 표 2는 교반탱크형 반응기에서 공급하는 공기에 이산화탄소 및 에틸렌의 유무에 따른 주목나무 세포 생장과 탁솔 생산성을 나타내는 결과이다. 이산화탄소를 공급하는 경우가 공기만 주입할 때 보다 세포 생장 및 탁솔 생산이 우수하였고 에틸렌을 함께 주입하였을 때, 그 결과가 더 향상되었다.

[표 2]

[실시예 1]

참고예 1과 동일한 공기 부양식 반응기에서 가스 순환식 방법으로 주목나무 세포 배양을 실시하였다. 모든 배양조건은 참고예 1과 같고, 단지 반응기로부터 유출되는 가스를 순환시켜 반응기로 다시 공급하는 것이 참고예 1과 차이점이다. 이 방법은 반응기에서 주목나무 세포 배양중 생성된 자연상태의 이산화탄소와 휘발성 물질을 고스란히 재 공급하여 반응기 내의 배양환경을 좋게 유지시키는 효과가 있다. 제1도는 공기 부양식 반응기에서 가스 순화식 공정의 흐름도이다. 제1도에서 가스 순환을 위하여 중간 경로에 저장 탱크를 설치하였는데 이 저장탱크에서 반응기로 공급되는 가스 성분의 농도를 조절하게 하였다. 특히 저장탱크의 산소 농도를 측정하여 소모된 산소 양 만큼 공기를 보충(make-up)하였다. 이러한 가스 순환식 공기부양식 반응기에서 주목나무 세포를 배양한 결과 표 3과 같이 세포 생장 및 탁솔 생산이 우수하였다.

[표 3]

[실시예 2]

실시예 1과 동일한 주목나무 세포 배양을 교반탱크형 반응기에서 실시하였다. 가스 순환등 모든 배양 조건은 실시예 1과 같고 교반속도는 참고예 2와 같이 유지하였다. 표 4는 가스순환식 교반탱크형 반응기에서 주목나무 세포 배양을 하였을 때 세포 생장과 탁솔 생성을 나타내는 결과이다. 가스를 순환시키는 배양방법이 순환하지 않는 배양보다 세포 생장 및 탁솔 생산이 우수하였다.

[표 4]

[실시예 3]

실시예 1과 동일한 주목나무 세포 배양을 기포탑 반응기에서 실시하였다. 모든 배양조건을 실시예 1과 같이 유지하였다. 이러한 가스 순환식 기포탑 반응기에서 주목나무 세포를 배양한 결과 실시예 1과 유사한 결과를 얻었다. 즉, 가스를 순환시키는 배양 방법이 순환하지 않는 배양보다 세포 생장 및 탁솔 생산이 우수하였다.

Claims (4)

1. 주목에서 유리된 식물세포를 생물반응기에서 배양하여 항암물질인 탁솔 및 그 유도체를 생산하는데 있어서, 생물반응기내에서 생산되어 유출되는 가스속에 포함되어 있는 이산화탄소 및 휘발성 물질을 재순환시켜 공급하는 것을 특징으로 하는 탁솔 및 그 유도체를 고수율로 생산하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 생물 반응기가 공기부양식(airlift) 반응기, 교반탱크형(stirred tank) 반응기, 기포탑(bubble column) 반응기 및 회전드럼식(rotary drum) 반응기 임을 특징으로 하는 탁솔 및 그 유도체를 고수율로 생산하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 생물 반응기에서 배양의 형태가 현탁배양 및 고정화세포 배양임을 특징으로 하는 탁솔 및 그 유도체를 고수율로 생산하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 공기부양식 반응기는 반응기내에서 생산되어 유출된 가스를 다시 반응기내로 재순환시키기 위한 가스펌프(gas pump)가 설치된 가스저장탱크(gas reservoir)를 포함함을 특징으로 하는 탁솔 및 그 유도체를 고수율로 생산하는 방법.