JPS60256376A - 細菌培養物、その製造方法およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は難生物分解性の芳香族化合物を分解できる細菌
培養物、特に混合細菌培養物、およびこのタイプの培養
物を得そして安定化するだめの培養方法、および前述の
芳香族化合物を含有する下水をｆ＃製するためのそれら
の用途に関する。

家庭下水および工業廃水の分解には生物学的方法が世界
中で用いられている。処理すべき流量、下水組成の変動
および下水プラントに対する季節的影響に鑑み、主に技
術的改良、例えば’　＃ｊｌ［ｌ送、＠　＠　、ＯＫｍ
　成、Ｔｚｋ　７７　？　（７）耐蝕性、スラッジ除去
、スペース要件の低減化および容器設計の至適化などを
図るための試みがこれまで様々に行われている。極く最
近に到って、既存の下水プラントに仕込むことのできる
、特別の下水のだめの微生物学的スターター培養物が調
製されている。既知の方法および培養物を用いても、大
きな工業的規模で極めて実質的な好気的または嫌気的分
解が得られる。しかじなから下水流が分解し難い有機物
質、例えば塩素化芳香族化合物を含有する場合には浄化
水中に残留ＣＯＤ　（ＣＯＤ　＝化学的酸素要求量）が
残り、またこれをＢＯＤ　（生化学的酸素要求量）とし
て測定しえない。１９７６年５月４日付ＥＥＣ指令の要
件で特に注目されるこのタイプの化合物は工業廃水中に
極〈低濃度でしか存在しないので化学的贅たは吸着によ
る除去は不経済である。

そこで、工業プラント内での極めて実質的な　ゞ′１ 除去後に下水流中に放出されるような難分解性の有機物
質の生物学的除去を行うことが課粗となっていた。

欧州特許出願（公開番号９９０２０号）明細書には同一
でない置換分で多重的に置換された炭化水素を正荷電を
有する担体材料に付着した微生物を用いて分解できるこ
とが開示されている。

これら微生物は唯一の炭素源として多重的に置換された
芳香族炭化水素を用いて増殖させることができるが、こ
れにはまずそれら微生物をただ１つの置換分または分解
すべき物質よりも数少い置換分を有する芳香族化合物を
唯一炭素源として含有する様々な個々の培養物中で適応
化させる。その後の段階ではじめて、合一した初期培養
物は分解すべき物質に適応化される。この方法はいささ
かこみいっている。これは殊に置換分のより少い物質の
みを分解しうる多くの培養物も単離され、選択されそし
て適応されるからである。

今般、特別な細菌培養物が難分解性芳香族例えば塩素お
よび窒素を含有するものでさえも下水から除去できるこ
とが見出された。本発明による細菌培養物は、１５〜４
０　’Ｃ１好ましくは２０〜３５°Ｃ１特に２０〜３０
”Ｃ（０７ｇ度範囲で、トルイジン類、クロロメチルア
ニリン類、クロロニトロアニリン類およびクロロニトロ
ベンゼン類よりなる群からの１種または数種の難分解性
異性体を唯一炭素源として含む無機質培地中で微生物含
有試料からの細菌を好気的に培養しかつその際芳香族化
合物を分解する培養物をｏＩ）５ｅｏン０．５の細胞苦
度となるまで増殖させそして数次にわたりその都度新鮮
培地に移すことによって得ることができる。

この文脈において、「唯一炭素源」なる用語は、培養物
により易分解性の化合物、特に置換度のより低い芳香族
化合物（塩素含有芳香族化合物の場合には例えば塩素を
含まない相当化合物）を添加する可能性を排除するもの
ではない。

実際にはかかる化合物の添加は多くの場合に有利である
。何故々らば、これによって培養物の増殖が一段と速凍
りしかもこのように、前述の既知方法とは対照的に本発
明によれば分解すべき比較的置換度の高い芳香族化合物
に直接適応させることにより比較的置換度の低い芳香族
化合物を分解しうる培養物を与えるにすぎない作業段階
が節約される。このこともまた成功の確率を相当に高め
る。すなわちクロロメチルアニリンの場合にはアニリン
、トルエンおよびクロロベンゼンで増殖させた個別培養
物は混合後でさえも成功に到らなかったのに対し温くべ
きと′ｌ）　とに、クロロメチルアニリン含有培地を用
いたいくつかのパッチは亘ちに適切な培養物の発見につ
ながることを見出した。

適当な微生物を含む試料は特に天然の場所で難分解性成
分を既に含有しているもの、例えば針状葉が一部腐朽し
た針葉樹林からの土壌、古い針葉樹皮および材木切削屑
、オイル汚染土壌、下水汚泥、アスファルト道路端から
の土壌、汚染された沿岸地域からの海水および沈泥でふ
さがれた砂などである。しかしガからこのタイプの微生
物を富化させるために馬糞、発酵糞塊からの物質、庭園
土壌あるいは深さ５〜１０ｃｒｎの河川縁部からの様々
な耕作土壌または泥状物を用いることも可能である。

次の２つの方法は多重的に置換された芳香族化合物を分
解する微生物の増菌、選択および適合に特によく適して
いる。

１、広大な好気水面をシミュレートする液体培養： １００〜ｓｏｏｐｐｍの１種またはそれ以上の多重的に
置換された化合物および２〜２００２、好ましくは３０
〜ＢＯｆの試料物質を炭素源を含まない適当な無機質培
地５００ｄを充填した培養容器に添加する。培養物を攪
拌器でゆるやかに攪拌するかまたは振盪器上で極めて低
速で（例えば直径２．５　ｃｍの振盪器を用いて４０〜
６ｏｒｐｍで）振盪する。望ましい細菌培養物の増菌に
は激しい通気は必要でもなければ有利でも力い。

何故ならば試料物質中に十分な炭素基質を見出す他の細
菌が優先的に増殖する可能性があるからである。

２、天然の場所の土壌の上層をシミュレートする土壌培
養： 十分な試料物質が利用可能ならば小型クレイ製植木針に
土壌試料を直接入れるかまたはそれをまず庭園土壌、耕
作土壌、クレイ断片または粗粒砂と混合した上でこの混
合物をクレイ製植木鉢に入れる。その鉢に前述の多重的
に置換された芳香族化合物（１種または複数種）を含有
する無機質培地で水まきし試料を規則的に湿潤状態に保
つ。

前述の２種類の方法によシ得られた培養物は約１５〜４
０°Ｃ１好ましくは２０〜３５°Ｃ１特に２２〜３０°
Ｃの温度で使用物質の分解を検出しうるまでインキュベ
ートされる。これは例えばり００ニトロベンゼン類など
の場合には１４日以内でありうるが、数ケ月かかること
もありうる。

しかしガからいずれの場合であっても分解が検出しうる
まであるいは数次にわたる継代の後も成功しない場合に
はすべての細菌が希釈しきるまで、８〜１２週間後の液
体培養物の５〜１０チよりなる接種物で新たな培養が開
始される。

成功確率を高めるために前述の２種類の方法を並行的に
開始することもできる。それら方法により得られた培養
物の単離は通常の微生物学的方法により行われる。これ
によって同じ分解能を示す純粋培養物が得られる場合に
は、それは更に純粋培養物として用いられる。単離され
′た純粋培養物の分解能が不完全であるかまたはその活
性が富化培養物のそれよシも低い場合には、分解に必要
な菌株は混合物として残し、そして混合培養物として更
に用いられる。各種細菌の分解活性は相補的なので、そ
れらは、分解すべき物質が唯一炭素源である選択的条件
下において安定な混合培養物を形成する。

・、）　供試物質を分解ｆ、Ｂ培養物１規貝“ｊ的７継
代（トランスファー）後でさえも同じ条件下において１
年以上も安定であり、またそれらは濃度を増加させて選
択することにより改良できる、すなわち、分解速度およ
び増殖が高まる。

試験されたすべての芳香族化合物を分解する培養物は１
８ケ月間の間に見出された。このことは本発明によれば
難分解性物質を生物分解する培養物を首尾よく得る確率
が高いことを示している。

驚くべきことに、本発明による混合培養物はそれらから
単離された純粋培養物よりも通常極めで生産性が高くか
つ安定であることを見出した（後者は純粋培養物が最初
から分解体として単離された場合は別としてわずか５０
〜７０％の分解速度に達するにすぎない）。

富化培養物は１〜１．５ｔの容量の研究室用発酵槽ｆ　
！　、ｂ　−？　ニア−Ｋ−通シゞ１゛Ｕ攪４１”゛６
培１１するのが有利である。よく増殖する培養物−エア
ーリフト（ａｉｒ−１ｉｆｔ　）原理により操作される
２［ｌＬのループ反応器で培養される。炭素供給を改善
するために難分解性化合物（１５０ｐｐｍ　）のみなら
ずより易分解性の、例えば置換度の低いアナログ（５０
０ｐｐｍ　）をこれらのパッチに添加しそして消費され
れば補給する。

本発明による方法のもう一つの格別な長所は微生物培養
物に比較的易分解性炭素基質を添加することにより細胞
増殖が相当に向上する点である。次のものが適している
。すなわち、グリセロール、マンニトール、ソルビトー
ル、／々シラフィン類各１８個以下の炭素原子を有する
脂肪族アルコールおよびカルボン酸、芳香環に少＜　、
！：　モ１　個のヒドロキシル第１たは１個または２個
のカルホキフル基を有する芳香族化合物、および適切な
場合には、分解すべき芳香族化合物の前述の置換度のよ
シ低いアナログ、例えば塩素を含まない類似化合物。グ
リセロール、マンニトール、ソルビトールまたは低級ア
ルカノール、例えばメタノールおよび特にエタノールの
添加が特に好ましい。最適の基質はその都度予備試赦に
より見出される。これらの添加物の量は培地１ｔあたり
１〜５２とするのが好ましい。添加物が分解すべき物質
を溶解しうる場合、例えばエタノールである場合には、
分解すべき物質は相当する溶液の形で添加するのが有利
であり、これによって培地中の分布が向上する。

これらの比較的易分解性炭素基質の添加により達せられ
る効果は驚くべきものである。何故ならばグルコース−
６−ホスフェートを経由して代謝される基質は置換芳香
族化合物の分解性を低下させることが比較試験により示
されるからである。連続培養においてはこの結果分解活
性が失われる。

連続培養において置換芳香族化合物を分解する培養物の
滞留時間は約２０時間〜５０時間である。前述の比較的
易分解性の炭素基質を添加する場合には、滞留時間を５
〜１０時間に短縮でき、同時に菌体密度は５倍以下に増
加する（　ｓ　ｓ　ｏ　ｎｍでの吸光度は２〜５の範囲
であるのに対しこれらの添加があると０．４〜１となる
）。

本発明の有利な態様においては、細菌培養物は固定化菌
体として用いられる。（特にビーズ状の）固定化生物触
媒は既知であり、そして例えば西独特許出願公開２．３
４３．６３３号（米国特許第４．０７０．３４８号）お
よび２．８０５．６０７号明細書に記載されている。特
に有利な方法は西独特許出願公開第３．２３７．３４１
号明細書に記載されている。それらは極めて実質的に生
物学的活１、　性を保持する一方、これらの固定化菌体
により処理すべき下水との相当に改善された混合、およ
び処理済み下水からのバイオ触媒の取出しおよび戻しの
相当力容易化が可能となる。

西独特許出願公開第３．２３７．３４１号明細書に記載
の方法は培養物の固定化に好ましく、これによればビー
ズ状のバイオ触媒がアクリルアミドおよびメチレンビス
アクリルアミドを高度に弗素化された炭素化合物を添加
した水性懸濁液中でラジカル重合することにより得られ
る。この目的には、微生物は湿潤菌体集塊、有利には、
遠心分離により除去され、洗浄されそして生理学的食塩
水で取り上げた菌体集塊として用いられる。単量体であ
るアクリルアミドおよびメチレンビスアクリルアミドは
前記の高度に弗素化された炭素化合物中に懸濁された懸
濁液に激しく攪拌しながら添加され、そして重合が開始
される。ビーズ状で得られたバイオ触媒は極めて１：ｉ 良好な空時収率を与えまた高い安定性と活性を有してい
る。そのためにそれは広範にわたる様様なタイプの反応
器にすべて使用できる。

本発明による細菌培養物の使用に際しては、処理すべき
大荏量そしてこのことからくる混合問題を考慮に入れる
必要がある。

すなわち、担体に固定された好ましい培養物を用いるに
せよ、装填された担体材料の高い局部的剪断力および緻
密化が避けられるよう注意すべきである。更にまた分解
されるべき物質のおよびそれらの分解段階（それらの一
部は反応性が高い）の濃度勾配が確実に低く保たれる必
要があり、また同時にバイオ触媒材料全体と分解される
べき媒体とが十分混合されることが必要である。加える
に、酸素含量、−、イオン濃度、基質濃度、温度および
中間体濃度というコントロール変数をいつでもそして反
応混合物のあらゆる位置で測定できるようにすることが
必要である。更に、増殖速度を低くして分解速度を高め
るようにするために、固定化された培養物を反応系内に
保持する必要がある。

これらの要件は（先に公表されたものではない）西独特
許出願公開第５．２４７．２１４号明細書において提案
されている、ループ原理で操作される反応器で反応を行
うことよりなる固定化バイオ触媒を用いた酵素反応の実
施方法によって特に有利に充足される。その際処理すべ
き下水は固定化培養物を充填した通気されたループ反応
器に連続的に供給されまた基質および中間体の遊離濃度
はゼロに保たれる。この目的のために、貫流時間および
流入物中の基質濃度は、得られるべき分解速度に適する
ように調節される。

基質濃度が高い場合には、既に分解済みの培地の一部を
リサイクルすることによって該培地により予め希釈して
おくことができる。そのプロセスの間中、バイオリアク
ター中での最適な変換に必要なｐＨ１温度、酸素濃度、
無機分および他の栄養素が設定されそして一定に維持さ
れる。

循環および混合強度および例えば二酸化炭素などの気体
生成物の除去はループ反応器の上昇部の基部で反応器に
通気することによって制御される。このだめの通気速度
は、混合および循環がゆるやかではあるが一様となるよ
うに設定される。

バイオ触媒は出口の上流にある沈降の行われる沈降帯域
に止められる。その沈降物は、反応室に戻され、一方透
明な清澄化された上清は自由溢流としてこの目的のため
に設けられた以後の処理段階（主排液路）へと排液され
る。その設計は、例えば欧州特許第６５４７号および第
３、５４８号（米国特許第４’、２５１，３７１号）明
細′）書に記載されているような、沈降段階を反応段階
と組み合わせたようなものでもあるいは例えば西独特許
出願公告第２．９３８．３３９号明細書または米国特許
第４．３４６．１１３号明細書に開示されているような
それらを別々に配したよりなものであってもよい。

本発明を次の実施例によって詳述する。

実施例　１ ａ）培養物の単離 一部腐朽したとうひ（５ｐｒｕｃｅ　）針葉およびとう
ひおよびオークの材木切削屑および樹皮片の混合物１０
ｆを各々５００１の無機質培地を含む４個の攪拌容器の
各々に添加した。これらの容器のうちの２個の培地は付
加的に１００１）１）ｍの３−クロロ−２−メチルアニ
リンを含有し、また他の２個の容器の培地は４００　ｐ
ｌ）ｍの２−メチルアニリンを含有した。それら混合物
を付加的に通気すること力く４週間室温で攪拌した。　
ゝ次に各々より５１を採取して５００罰ずつの新しくけ
あるが同一の混合物に添加した。この手順を６回繰り返
し次いで１４日問おきにさらに３ケ月間繰り返した。こ
の後は、もとの土壌試料は完全に希釈されていたがそれ
でもフラスコはＩｖＩＩｌ菌増殖のために若干の曇りを
みせた。

対照試験は炭素源は７日後には１００チ分解されている
ことを示した。細菌を接種していないブランク用バッチ
はわずか約５係という蒸発損失を示すにすぎなかった。

それら単離培養物に対する交叉試験は２−メチルアニリ
ンを分解する生物は３−クロロ−２−メチルアニリンを
も分解することを示した。

それら４個の増菌容器における培養物の埜動は実質的に
同一であり、それらを合一して以後の試験のだめの接種
材料として用いた。

ｂ）培養物の改良 ５ｄの培養物を５００　ｐｐｍの２−メチルアニリンお
よび１５０１）ｌ）ｍの３−クロロ−２−メチルアニリ
ンを含有する無機質培地５００−に移した。５日間増殖
させた後、同じ量のそれら芳香族化合物を添加した。更
に５日間経過後、培養物はｏＩ）５ａｏン１．５に達し
、次いで同じ培地を含む２０１工アーリフト発酵槽に移
した。このエアーリフト発酵槽の培養条件の方がよいの
で増殖は一段と速くなりそのため５〜５日後にそれら芳
香族化合物を（その都度同じ１ｓｔ）補給することが可
能であった。培養物は０Ｄ３ｅｏン２．６の密度に達し
、そして試験物質を７日間で完全に分解した。

菌体集塊をその培養物から遠心分離により取り出しそし
て以後の試験に用いた。

Ｃ）菌体の固定化およびループ反応器への使用遠心分離
により取り出された湿潤菌体集塊は西独特許出願公開第
５．２３７．３４１号明細書の実施例１に記載に従って
、難分解性芳香族化合物含有下水を生物分解を受けさせ
る西独特許出願公開第３．２４７．２１４号明細軒によ
るループ反応器に使用しうるビーズ状バイオ触媒に転化
することができる。

実施例　２ １５０２の耕作土壌および０．２５５’の〇−トルイジ
ンの混合物を植木鉢に入れそして湿った状態で３０°Ｃ
に保った。そのＯ−）ルイジンの分解後（薄層クロマト
グラフィにより測定）、約１２の土壌を０．４ｆｊ’／
ｌの０−トルイジンを含有する無機質培地に移した。分
解が完了したら培地変えを繰り返しそして数回培地変え
を行った後に純粋な細菌培養物が得られそしてロドコッ
カス−Ｃｌドクラ、Ｘ　（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｒ
ｈｏｄｏｃｈ−９・・・・）として同定された。

このようにして得られた培養物は４ＧＯｍｆ／ｌのＯ−
）ルイリンを５日後には完全に分解していた。唯一炭素
源がｍ−トルイジンまたはアニリンのときでも増殖が行
われる。唯一炭素源としてＯ−）ルイジンを用いて得ら
れた培養物はｍ−）ルイジンおよびアニリンのみならず
６−クロロ−２−メチルアニリンも分解した。

実施例　３ 庭園土壌試料を０．２ｆ／ｌのｐ−トルイジンを含有す
る無機質培地に移し、次いで５０”Ｃでインキュベート
した。数回にわたって新鮮培地に移した後、純粋な細菌
培養物が得られそしてシュードモナス・テストステロニ
（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｉ　
）として同定された。得られた培養物は８時間の間に０
．３’！”／ｌのｐ−）ルイジンを分解した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）１５〜４０°Ｃの温度範囲で、トルイジン類、クロ
   ロメチルアニリン類、クロロニトロアニリン類およびク
   ロロニトロベンゼン類よりなる群からの１種または数種
   の難分解性異性体を唯一炭素源として含む無機質培地中
   で微生物含有試料からの細菌を好気的に培養しかつその
   際０Ｄｓｓｏン０．５の密度となるまで増殖させそして
   数次にわたりその都度新鮮培地に移すことによって得ら
   れる細−菌培養物。 ２）１５〜４０°Ｃの温度で、唯一炭素源として芳香族
   化合物を含む無機質培地中で好気的に培養しその除核芳
   香族化合物としてトルイジン類、クロロメチルアニリン
   類、クロロニトロアニリン類およびクロロニトロベンゼ
   ン類より彦る群からの１種または数種の難分解性異性体
   を用いそして当該芳香族化合物に対する適応化を行うこ
   とよりなる細菌培養物の調製方法。 ６）培養が２０〜３５°Ｃで行われる特許請求の範囲第
   ２項記載の方法。 ４）培養が２２〜６０°Ｃで行われる特許請求の範囲第
   ２または第５項記載の方法。 ５）より易分解性の化合物が付加的炭素源として培地に
   添加される特許請求の範囲第、２項ないし第４項のいず
   れかに記載の方法。 ６）特許請求の範囲第１項記載の細菌培養物のまたは特
   許請求の範囲第２項ないし第５項のいずれかに記載の方
   法により得られる混合培養物の、難分解性芳香族化合物
   の分解のための用途。 ７）固定化菌体の形での特許請求の範囲第６項記載の細
   菌培養物の用途。 ８）ループ反応器への特許請求の範囲第６項または第７
   項記載の細菌培養物の用途。