KR101064519B1

KR101064519B1 - 동질화된 식물세포 배양을 통한 2차대사산물의 대량생산 안정화

Info

Publication number: KR101064519B1
Application number: KR1020107029921A
Authority: KR
Inventors: 진영우
Original assignee: 주식회사 운화
Priority date: 2005-10-31
Filing date: 2006-04-25
Publication date: 2011-09-19
Also published as: KR101020689B1; CN101297028B; EP1951863B1; JP5211296B2; RU2398874C2; ES2546108T3; EP1951863A1; EP2386626B1; KR20080029971A; PL1951863T3; BRPI0619656A2; AU2006309568B8; US20110033903A1; EP1951863A4; KR20110004922A; EP2386626A1; AU2006309568A1; RU2008121914A; CN101297028A; CA2627533C

Abstract

본 발명은 동질적인 세포군 개발을 통한 세포 증식과 생산능의 가변성을 감소시키는 방법으로 보다 상세하게는 식물로부터 형성층을 분리하고, 형성층으로부터 단세포 유래 세포군(single cell clone)을 유도증식하여 식물세포의 장기 배양 공정시 발생하는 세포생장 저하, 생산성 감소의 문제점을 해결함으로써 식물 유용물질 생산의 안정성을 증진하는 방법에 관한 것이다.

Description

동질화된 식물세포 배양을 통한 2차대사산물의 대량생산 안정화{STABILITY OF SECONDARY METABOLITE MASS PRODUCTION THROUGH SYNCHRONIZED PLANT CELL CULTURES}

식물은 오랫동안 식량 자원뿐만 아니라, 약제향료색소농약염료 등을 포함한 광범한 화학물질의 공급원으로 매우 중요하게 사용되어 왔다. 이들 식물에서 생산되는 유용성분의 대부분은 2차 대사 산물(secondary metabolites)이다. 알칼로이드(alkaloid), 알레르기 항원(allergen), 아미노산(amino acid), 안스라퀴논(anthraquinone), 항백혈병 물질(antileukaemic agent), 항생물질(antimicrobial agent), 항암물질(antitumor agent), 항바이러스 물질(antiviral agent), 효소(enzyme), 플라보노이드류(flavonoids), 살충제(insecticide), 진정제(opiate), 향료(perfume), 색소(pigment), 비타민(vitamin), 다당류(polysaccaride) 등이 있고 이들은 대부분 생리활성물질로 작용하기 때문에 관심이 커지고 있다. Zhong(2002)에 따르면, 현재까지 알려진 식물 2차대사산물이 약 100,000여가지, 실제로 사용되고 있는 의약품의 25％이상이 식물에서 유래된 물질로, 매년 새로운 2차 대사산물들이 계속적으로 발견되고 있다.

이들의 획득방법에는 최근 유기화학의 눈부신 발달에도 불구하고 화학적인 합성이 쉽지 않고, 개발과 환경오염으로 인한 자생지의 파괴와 계절장소기후 등의 재배조건에 따른 함량 변화생산비용 상승 등의 문제점들이 많이 있다. 따라서 외부 환경조건을 적절히 조절할 수 있고, 좁은 공간에서도 대량생산할 수 있는 이점이 있는 기내배양기술을 이용하여 2차 대사산물을 획득하려는 시도가 활발하게 진행되고 있다.

공개 특허 제 0130100에 따르면, 식물세포배양에 의한 유용물질 생산은 식물로부터 직접적인 추출에 의한 방법보다 많은 장점을 가지고 있다. 특히 기존의 추출법과 달리 환경의 영향을 받지 않고 지속적인 생산이 가능하고, 생태계 파괴와 같은 현안 문제들을 해결할 수 있는 최적의 방법으로 여겨진다.

그러나 Naill ＆ Roberts (2004)는 2차 대사산물을 생산하는 방법으로써 식물세포 배양의 사용은 일반적으로 배양물의 성장이 느리고 생산성이 낮다는 것을 제시한 바 있다. 이를 해결하기 위해 빠른 증식을 위한 배지 및 배양조건의 최적화, 생산성을 높이기 위한 엘리시테이션(elicitation / zhong, 2002), 과정의 최적화 등을 연구하고 있다. 국제 공개 특허 제 WO93/17121호에서는 배양배지의 구성성분 등을 변화시키면서 여러가지 택서스(주목,Taxus) 속 식물체를 세포배양한 후, 세포주의 성장 속도 및 파클리탁셀(Paclitaxel) 생산을 상승시키고, 그 결과에 의거해 다량의 파클리탁셀(Paclitaxel)을 생산하기 위한 엘리시테이션 조건을 제시하고 있다. 식물세포배양에 의한 가치있는 2차대사산물의 생산향상에도 불구하고 생산성의 변이는 택서스로부터 파클리탁셀(Paclitaxel) 생산 경우와 같은 다수의 식물 시스템에서 주요 문제점으로 여전히 남아있다.

대규모 식물세포 배양을 통한 2차 대사산물 생산은 장기 배양공정 동안 빠른 세포증식과 높은 대사물질 생산능이 안정되게 유지되어야만 상업화가 가능하다. 특수 성분 생성능을 가진 세포주(cell line)가 항상 안정된 상태로 존재하지 않고, 계대배양에 의하여 초기 생산성이 소실되는 경우가 많다. 이와 같은 문제점을 어떻게 극복하느냐에 따라 성패가 달라진다고 해도 지나친 말은 아닐 것이다.

식물세포를 배양할 때 한 개체에서 유래된 세포들이라 하더라도 각 세포들의 물질생산 능력이 다르고 불안정하므로 보다 수율(yield)이 높고, 유전적으로 안정한 세포주 획득이 무엇보다 절실하다.

단세포 ＆ 여러세포 유래 세포군

단세포에서 유래된 식물세포군의 유용물질 생산능력의 변이는 여러 세포에서 유래된 세포군보다 변이가 적어 수율이 높다. 선행 발명들에서는 식물세포군 유도에 바람직한 절편(explant)으로 줄기(stem), 뿌리(root), 종자(seed) 및 잎(needle, leaf)을 사용하였다. 이들 줄기, 뿌리, 종자, 잎은 특수기능을 가진 다양한 형태의 세포군으로 이루어진 조직들이다. 따라서 이들로부터 유래된 식물 세포군, 즉 캘러스(callus)는 한 종류의 세포가 아니라 여러 종류의 세포들로 구성되어진다. 종래의 여러 종류의 세포로 구성된 조직에서 캘러스를 유도하는 방법으로는 생산성의 변이(variation)를 축소시키는데에는 한계가 있다.

세포 응집 ( cell aggregation )

식물세포배양의 뚜렷한 특징 중의 하나가 세포응집(cell aggregation)이다.

공개 특허 제0364478에 따르면, 식물세포는 지름이 30∼300㎛로 동물세포와 비교하여 약 30배가량 크고 식물세포벽은 자연적으로 응집하려는 성질이 강해, 현탁액의 경우 완벽하게 단세포(single cell) 상태로의 배양이 불가능하다. 선행 배양기술에서 설명된 현탁액에는 직경이 수십㎛ 인 응집크기의 범위(단일세포 또는 몇 개의 응집된 세포)에서 수천개의 세포로 이루어진 직경이 수 mm 인 것으로 응집된 범위의 응집크기까지 존재한다. 배양 과정 중에 몇몇 과정을 통해 세포를 분리하고자 하고 있으나, 아직 완벽하게 분리하기가 어렵고, 점점 응집크기가 확대된다. Naill ＆ Roberts(2004)에 의하면, 세포응집은 내부와 외부세포 사이에 local environment 차이를 유발하고, 종국에는 생장, 물질대사의 변화를 가져온다.

액체현탁배양은 순수한 단세포를 얻는 것을 목적으로 한다. 이를 위한 방법으로 여과기(filteration), 효소(enzyme)를 이용한 해리법(maceration)과 원형질체(protoplast)로 분리하는 법등을 사용한다. 그러나, 여과와 해리법으로는 모든 세포들을 단세포 상태로 얻을 수 없으며, 세포벽을 제거한 원형질체를 이용하는 방법이 모든 세포를 단세포로 만들 수 있는 가장 확실한 방법이나 원형질체 배양에 사용되는 분해효소에 의해 세포벽이 손상을 입거나 붕괴가 될 수 있고 세포의 생리기능(cell physiology)에 변화를 줄 수 있다. 더욱이 파클리탁셀(Paclitaxel)과 같이 불용성(hydrophobic)인 2차 대사산물들은 세포벽에 저장되어질 수 있으므로 세포벽(cell wall)의 변화는 생산성과 밀접한 관련성이 있다.

또한 세포응집은 수적 개념의 세포생장(cell growth)측정과 세포의 생화학적 분석에 중요 방해원인이 되어왔다. Naill ＆ Roberts(2004)에 따르면, 분석에 있어서의 단세포 배양이 가능하면 배양구성물들 사이에서의 세포단위의 행동양상(behavior) 즉, 2차 대사산물의 생합성(biosynthesis), 저장(storage), 분해(degradation)등에 대한 빠른 정보를 수집할 수 있다.

탈분화 ( dedifferentiation )

식물조직을 탈분화시켜 얻은 세포군 즉, 캘러스는 염색체 변이(somaclonal variation)로 인한 유전적 변이가 야기되고 이로 인해 유용물질 생산 능력의 변이가 크다. 특수기능을 가진 다양한 형태의 세포군으로 이루어진 영구조직의 잎, 줄기, 뿌리, 종자 유래 캘러스는 탈분화로 생겨난 2기 분열조직이어서 미세환경에도 크게 영향을 받는다. 때문에 Hirasuna et al.(1996)는 세포 밀도, 계대배양 주기, 온도 등의 최적조건들을 규명하고 이를 정확히 유지시키려는 연구를 했다.

규모의 확대( Scale - up )

식물세포배양을 통하여 원하는 2차대사산물을 상업적인 규모로 대량생산하기 위해서는 규모의 확대 단계가 필수적이다. 세포배양에 의한 유용물질 생산에 대한 성공적인 실험실 규모의 연구결과가 많은 특허와 논문으로 발표된 후, 대량생산을 위한 생물반응기(bioreactor)의 적용이 이루어지고 있다. 공개 특허 제 0290004에 따르면, 반응기에서 대량배양을 하게 되면 실험실 규모의 플라스크 배양과 매우 다른 배양 환경을 제공하게 되며 이로 인해 일반적으로 생장속도가 느려지고 생산성이 감소하며, 생산물의 조성 등에 변화가 생긴다. 이렇게 대량생산을 위한 생물반응기 적용시 발생하는 생장률, 생산성 및 조성의 변화는 세포배양에 의한 유용물질 상업화 과정에서 문제점으로 제기되고 있다. 식물세포의 대규모 배양 시 통기(aeration)와 혼합(mixing)의 효율성을 고려하여 외부 동력에 의하여 공기를 주입하거나 임펠러(impeller)를 장착한 생물반응기(bioreator)를 선호한다. 그러나 식물세포는 전단(shear)에 예민하기 때문에 세포 생존율(cell viability)이 급격히 감소하여 전단을 느리게 하기 위한 방법 모색이 필요하다. 식물세포 전단 감수성(shear senstivity)의 원인을 큰 사이즈(large size), 단단한 세포벽(rigid cell wall), 응집(aggregation), 광범위한 액포(extensive vacuole)로 설명하고 있다 (Yokoi et al ., 1993). 기존 해결책으로는 임펠러의 타입을 변형하거나 교반 속도를 조절할 수 있는 새로운 타입, 즉 전단을 줄이는(low shear) 배양기를 고안하였다. 그러나 여전히 미세한 환경요소(microenviornment)들의 차이를 극복하지 못해 부정적인 결과를 낳고 있다.

동결보존 ( cryopreservation )

동결보존은 극저온 상태에서 세포의 거의 모든 대사활동을 중단시킨 상태로 장기간 유지시키고 이어서 유전적인 변화, 특성 및 생합성 활성의 변화없이 세포를 회수하는 것을 의미한다. 식물세포를 동결보존하여 오염으로 인한 손실을 배제시키고, 연속 세포주에서의 유전적 변화를 최소화할 수 있다. cGMP관점에서 보면 세포주의 장기보관기술은 원료의 안정적인 공급을 위하여 필수적이다. 동물조직배양세포는 통상적으로 수 년동안 동결보존되지만, 식물세포에 대한 유사한 동결보존기술은 훨씬 더 어려운 것으로 증명되었다. 임의의 배양액 내 존재하는 식물세포는 이질성(heterogeniety)으로 생리 및 형태적 다양성을 나타낸다. 때문에 식물 현탁 세포는 동결보존에 있어서 여러 가지 과정을 필요로 하고 더욱이 동결보존을 부적절하게 실시하는 경우, 변이가 발생할 수 있다.

조절인자들( Conditioning factors )

Kim et al.(2000)에 따르면 세포 분열력을 상실한 세포주가 담긴 배양액에 세포 현탁 배양시 배양세포들이 가장 활발하게 세포분열이 일어날 당시의 배양액을 소량 채취하여 첨가해 주면 세포분열이 가능하다. 장미현탁배양(Rose suspension culture)로부터 안토시아닌(anthocyanin) 생산에 있어 딸기현탁배양(strawberry suspension culture)으로부터 배지 일부를 채취하여 첨가한 결과 생산력이 향상되었다. 이처럼 배양세포로부터 생산분비되어 세포생장 및 2차 대사 산물 생성을 촉진하는 인자들을 가리켜 조절인자들이라 칭한다. 아직 이들 조절인자들은 구체적으로 밝혀지지는 않았고, 생장 및 산물생산을 위한 화학적 신호가 있음으로 이해하고 오직 인산염(phosphate), 칼모둘린(calmodulin)과 같은 가능성 있는 몇몇 물질에 대한 보고들이 있을 뿐이다. 조절인자들은 조절배지(conditioned medium) 또는 도움세포들(helper cells)로써 공급되어질 수 있다.

관류식 배양 ( perfusion cultivation )

세포를 배양하는 방법에는 초기에 한번 배양액과 세포를 넣고 더 이상의 영양물질의 공급이나 회수가 없는 회분식 배양(batch cultivation)과 배양기 안에 배양액을 넣고 세포를 배양하는 데 있어 외부에서 새로운 배양액을 일정한 속도로 유입시킴과 동시에 같은 속도로 배양 생성물들이 포함된 오래된 배양액을 회수하여 세포들이 영양의 고갈없이 계속 배양되도록 유지시키는 연속배양(continuous cultivation)이 있다.

회분식 배양은 배양생성물의 낮은 생산성으로 인하여 산업화가 어려워, 최근에는 연속식 배양방법 중, 세포를 배양기 안에 머무르게 하고, 생성물을 포함하고 있는 배지를 연속적으로 회수함과 동시에 새로운 배지를 공급하는 관류식 배양 (perfusion cultivation)이 주목받고 있다.

Zhang et al.(2000)에 따르면, 세포배양에서 2차 대사 산물의 생성을 촉진하는 가장 효과적인 방법 중의 하나가 엘리시테이션이다. 엘리시터(Elicitor)의 첨가는 2차대사산물 합성을 촉진은 하나 세포 생장(cell growth)의 저해와 세포 생존율(cell viability)의 급속한 감소를 유발한다. 따라서 엘리시터에 의한 2차대사산물의 합성은 짧은 시간 동안만 유지되고 매우 제한적이다. Wang et al.(2001. a)의해 제시된 바와 같이, 이러한 엘리시터에 대한 부정적인 효과를 최소화하고 생산 수율을 최대화하기 위한 전략이 관류식 배양(perfusion cultivation)이다.

Wang et al.(2001. b)과 Wu ＆ Lin(2003)은 다음과 같은 내용을 보고하고 있다. 엘리시테이션에 의해 생산된 2차 대사 산물은 세포 내 (액포 또는 세포벽) 저장되거나 세포 외(배지)에 분비되어 있다. 배양 과정 동안 2차 대사 산물의 세포에서 배지로의 분비와 배지내로부터의 제거는 정제의 수월성 뿐만 아니라 그들의 생합성(biosynthesis)의 피드백 억제(feedback inhibition)와 생산물의 퇴화(degradation)와 전환(conversion)을 감소시킬 수 있다. 따라서 기존배지 제거 및 새로운 배지 보충으로 세포 내외 생성물을 배출하는 것은 세포의 생존성과 생합성을 연장시킬 수 있고 그에 따라 생산 수율을 현저히 증가시킬 수 있다

2차 대사 산물의 저장과 분비는 세포주(cell line)에 따라 큰 차이가 있다. 텍서스 메디아 세포주(Taxus media cell line / wickremesinhe and Arteca 1994)는 전혀 배출되지 않았다. 따라서 분비능이 뛰어난 세포주의 확보가 요구되어진다.

형성층 배양 ( Cambium culture )

유관속 형성층(cambium)은 식물체 측부에 위치하는 측재 분열조직이다(Lateral meristem). 나자식물과 목본성 쌍자엽 식물에서는 형성층의 계속적인 활동에 의한 비대 생장이 일어나며, 그 결과 11,000년 이상의 연륜을 가진 거대 식물체가 존재하게 된다. 발생학적으로 분열조직은 1기 분열조직과 2기 분열조직으로 구분 지을 수 있으며 이들의 구별 기준은, 1기 분열조직은 배발생 과정 중에 생겨나서 종자 발아 후의 식물 생장에 관여하는 분열조직을 의미하며, 2기 분열조직은 식물체 내의 기존 영구조직이 탈분화하여 생겨난 분열조직을 의미한다. 이와 같은 관점에서 보면 형성층은 중간에 영구조직의 개입 없이 1기분열조직인 전형성층으로부터 유래되어 분열조직적 연속성을 가진 1기 분열조직이다.

1기 분열조직에 의한 성장은 무한정(Indeterminate)이고, 조건만 주어지면 계속해서 이루어질 수 있다. 따라서 신속한 세포 대량 증식을 목적으로 형성층 배양이 이용되어 왔다.

선행 연구들에서 형성층 절편은 다음과 같은 방법으로 준비된다: 먼저 나무껍질을 벗긴 후다음, 목부에 닿도록 약 1mm 깊이로, 5mm의 간격으로 두 차례 세로로 자른다. 이 절편을 '형성층'이라고 부르며, 이것은 사부, 형성층 및 목부의 각각의 일부분들이 포함되어 있다.(cambium explants were prepared as follows : after the bark was peeled off, two longitudinal cuts, approximately 1mm deep in order to reach the xylem, were made into the woody stem at an interval of 5mm. They called this explant 'cambium', which was constituted of part of the phloem, cambium, and a small chip of xylem. / Jouira et al., 1998) 상기 방법에 의해 유도된 세포들은 형성층 단독 기원이 아니라 발생 해부학적으로 엄연히 구별되는 여러 세포 즉, 사부(phloem), 형성층(cambium), 목부(xylem) 기원으로 보아야 타당할 것이다. 따라서 상기 방법은 줄기를 구성하는 여러조직들 사이에서 정교하게 형성층만을 분리해내는 이상적인 방법이 아님을 지적할 수 있다. 줄기 여러조직들로부터 형성층만을 분리해낼 수 있는 독창적인 방법의 제공이 요망되어 왔다.

발명의 목적은 나무의 어린 줄기에서 형성층만을 분리해 내어 이로부터 단일세포 기원 세포주(single cell clone)를 제작하는 방법을 제공하는 것이다.

보다 구체적으로, 본 발명의 목적은 기존 스칼펠(scalpel, 외과용 메스)을 이용한 물리적인 분리방법에 세포생리화학적인 분리방법을 더하여 순수하게 형성층만을 분리 배양함으로써 식물세포배양의 변이성을 해결하고 안정적인 식물 유용물질 생산 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 주목 줄기로부터 형성층만을 분리 적출하여 배양함으로써 안정적인 세포증식과 파클리탁셀(Paclitaxel) 생산 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 식물 형성층에서 유래된 단일세포 유래 세포주(plant cambium-derived signle cell clone)의 분리방법을 제공한다: (a) 식물의 조직을 준비하여 살균하는 단계; (b) 상기 살균된 식물의 조직으로부터 형성층 함유 조직을 수득하는 단계; (c) 상기 수득된 형성층 함유 조직을 배양하여 형성층으로부터 증식되는 형성층의 층(cambium layer)과 상기 형성층 이외의 부분으로부터 무정형으로 증식되는 캘러스 층을 유도하는 단계; 및 (d) 상기 캘러스 층으로부터 형성층의 층(cambium layer)을 분리하여 단일세포 유래 세포주(single cell clone)를 수득하는 단계.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 (c)단계는 옥신(auxin)을 포함하는 배지에서 배양하는 것을 특징으로 한다. 또한, 더 바람직하게는 상기 배지는 1~3㎎/ℓ의 옥신을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 식물의 형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 단일세포 유래 세포주(single cell clone)를 제공한다: (a) 현탁배양 시 90%이상이 단세포 상태로 존재함; (b) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄; (c) 동일 식물 기원(the same plant origin)의, 형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 장기간 안정하게 배양됨; (d) 생물반응기에서 전단 스트레스(shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐; 및 (e) 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 식물은 주목 (the genus Taxus)인 것을 특징으로 한다. 또한 더 바람직하게는, 상기 주목의 형성층에서 유래된 단일세포 유래 세포주는 동일 식물 기원의 형성층 이외 조직에서 유래된 세포주에 비하여 270~720배 증가된 파클리탁셀(paclitaxel) 분비능을 갖는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 유래 생물학적 유용물질의 제조방법을 제공한다: (a) 상기 단일세포 유래 세포주를 배양하여 유용물질을 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 유용물질을 회수하는 단계. 이때 바람직하게는, 상기 (a)단계의 배양은 상기 단일세포 유래 세포주의 배양에 사용된 배지를 제거하고 새로운 배지를 공급하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 단일세포 유래 세포주는 주목(the genus Taxus)의 형성층에서 유래된 단일세포 유래 세포주(single cell clone)이고, 유용물질은 파클리탁셀(paclitaxel)인 것을 특징으로 한다. 이 경우, 상기 배지는 메틸자스몬산(methyl jasmonate), 페닐알라닌(phenylalanine) 및 키토산(chitosan)으로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 물질을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 분리된 식물의 형성층에서 유래된 단일세포 유래 세포주를 동결하는 것을 특징으로 하는 식물세포주의 보존방법을 제공한다.

본 발명의 방법에 따르면, 목본류 줄기의 여러 조직으로부터 순수하게 형성층만을 분리해내어 배양함으로써 탈분화 과정없이 분열조직적 연속성을 가진 1기 분열조직적 단세포 기원 세포주(single cell clone) 배양이 가능하다. 상기 배양 세포주는 장기 배양 공정에서 세포의 생장율, 생장패턴의 변화가 적어 유용물질을 안정적으로 생산할 수 있고, 기존 기술 대비 응집면에서 작고, 다중액포(multiple vacuole)을 가져서 생물반응기내 전단 민감성이 적어 산업적 수준의 대량생산에 이상적이다. 상기 배양 세포주에 조절인자를 사용하여 대사활성을 꾀할 수 있고, 관류식 배양(Perfusion cultivation) 방법을 통하여 상당량의 생성물을 세포외 배지로 분비시켜 세포 생존 및 생합성을 연장시킬수 있다. 이와 더불어 상기 배양 세포주의 동질성(homogeneity)과 분열능으로 인해 동결 보존 후 회수율이 높아 세포은행 구축을 도모할 수 있다. 본 발명을 통하여 배양물의 동질성(homogenity)과 2차대사의 변이(variation) 사이에 밀접한 관계가 있다는 것이 확인되었으며, 본 발명의 방법은 향후 각종 유용물질 생산의 변이를 조절하고, 감소시키는 산업 전략으로 발전시킬 수 있으리라 기대된다.

도1은 형성층으로부터 단세포 유래 세포군 유도과정에서 분리된 각 부분
도2는 형성층, 배, 잎으로 부터 각각 유래된 3가지 다른 주목세포배양들의 총 생물량 생산에 의한 생장률
도3은 배나 잎 또는 형성층 유래 주목세포배양의 세포응집형태
도4는 주목현탁배양시 파클리탁셀(Paclitaxel) 생산에 미치는 엘리시터의 효과
도5는 주목현탁배양시 파클리탁셀(Paclitaxel) 생산에 미치는 첨가된 조절인자들의 효과

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하고자 한다. 이들 형성층으로부터 단세포 유래세포군 유도 및 증식방법은 본 명세서에 설명된 파클리탁셀(Paclitaxel) 생산시스템 뿐 아니라 모든 식물 2차 대사 산물 생산시스템에 사용 가능하다는 것을 이해해야 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.

＜실시예 1＞ 식물재료의 준비 및 형성층 분리단계

주목의 종자(seed), 잎(needle), 줄기(stem)를 각각 채취하였다. 재료 채취 후 즉시 항산화제100mg/L 아스코르브산(L-ascorbic acid, DUCHEFA, The Netherlands)용액에 침적하여 운송·보관하였다. 재료들의 형태·생리학적 특성을 고려하여 각기 다른 방법으로 표면살균을 수행하였다.

①종자(seed): 70％ 에탄올에 1분간 표면살균 후, 1％ clorox 용액에 48시간 침적시킨 후 멸균수로 3∼4회 세척하였다. 이어서 0.5％ PVP(polyvinyl pyrrolidone, DUCHEFA, The Netherlands)와 50mg/L 아스코르브산(L-ascorbic acid, DUCHEFA, The Netherlands), 70mg/L 시트르산(citric acid, DUCHEFA, The Netherlands)이 첨가된 용액 속에서 종자(seed)로부터 배(embryo)를 분리해내어 캘러스 유도배지에 치상하였다.

② 잎(needle)과 줄기(stem): 1％ 베노밀(benomyl, Dongbu Hannong Chemical, Korea) + 1％ 다코닐(daconil, Dongbu Hannong Chemical, Korea), + 1％ 스트렙토마이신(sterptomycin sulphate, DUCHEFA, The Netherlands) + 0.1％ 세포탁심(cefotaxime sodium DUCHEFA, The Netherlands) 용액에 24시간 전처리 후 페놀 화합물(phenolic compound)과 잔존 화학물질을 제거하기 위하여 수돗물(tap water)상에서 30분 세척하였다. 70％ 에탄올(ethanol, DC Chemical, Korea)에 1분, 30％ 과산화수소(hydrogen peroxide, LG Chemical, Korea) 15분, 1％ CLOROX 용액에 15분, 3％ CLOROX용액에 5분 표면 살균 후 3∼4회 세척하였다. 산화를 막기 위해 0.5％ PVP, 50mg/L 아스코르브산, 70mg/L 시트르산이 첨가된 용액 속에서 잎(needle)을 양쪽 끝부분을 절단해낸 다음 캘러스 유도 배지에 치상하였다.

③ 줄기로부터 형성층 분리(cambium preparation from stem): 줄기의 중앙부위인 목부를 핀셋으로 잡고 형성층이 포함된 사부(phloem), 피층(cortex) 및 표피(epidermis) 조직을 벗겨냈다. 벗겨낸 형성층 포함 조직은 형성층이 배지면에 닿도록 배양하였다.

＜실시예 2＞ 분리된 형성층에서 단일세포 기원 세포주 유도단계

초기 배양 4∼7일째 형성층으로부터 세포 분열이 육안상으로 관찰되고, 배양 15일 이후에 형성층 윗부분인 사부피층 및 표피로 이루어진 층으로부터 캘러스가 유도되기 시작하며, 배양 30일 경과 후 정확하게 형성층과 사부를 포함한 윗층으로 분리되기 시작하면, 두 층이 자연스럽게 분리될 때까지 기다렸다가 완벽한 분리가 이루어지면 각기 다른 페트리디쉬(petridish)에 분리 배양하였다 (도1).

세포(cell) 및 캘러스(callus) 유도 목적을 위하여 공지의 식물조직 배양용 배지를 사용할 수 있으며, 예를 들면 mB5(modified Gamberg's B5 medium), MS(Murashige ＆ Skoog medium), WPM(Lloyed ＆ McCown), SM(schenk ＆ Hildebrand medium), LP(Quoirin ＆ Lepiovre) 배지를 예시할 수 있다. 이들 배지 모두 사용가능하며 필요에 따라 각종 첨가제를 가하거나 성분 중 일부를 축소 또는 제거하여 사용 가능하다. 이중에서 특히 바람직한 것은 mB5이고, 그 성분과 함량은 다음 표1과 같다.

배지에 생장 조절제로써의 옥신(Auxin)의 농도를 1-3mg/L 첨가하였다. 배양은 25±1℃로 조절된 암실에서 실시되었다.

형성층은 동질적(homogeneity) 세포들 구성으로 세포들 간의 분열이 균일하여 일정한 판의 형태로 증식되는 반면 사부(phloem), 피층 및 (cortex) 표피(epidermis) 포함 조직은 여러 종류의 세포들로 구성되어 이들 간의 분열의 차이로 부정형의 형태로 증식되었다. 따라서 형성층과 사부포함조직으로 층 자체의 균열이 자연스럽게 이루어졌다(도1). 형성층은 동질적(homogeneity)이고 사부(phloem)를 포함한 조직은 이질적(heterogeneity)세포로 구성되어져 분열속도의 차이로 인한 분리로 보여 진다.

이질적(heterogeneity) 세포로 구성된 배(embryo)와 잎(needle) 절편체는 배양 15일 후 탈분화에 의한 세포분열이 일어나기 시작했고, 이 세포들은 사부포함조직과 같이 여러세포들 간의 분열 속도의 차이로 부정형의 캘러스를 이루었다(도1).

＜실시예 3＞ 장기배양확립

캘러스 중 생장률이 좋은 희고 무른 부분을 매 21일째 새로운 배지로 계대하였다. 초기배양에서 배(embryo)와 잎(needle)로부터 유도된 캘러스는 생장률이 매우 불안전하며, 쉽게 갈변되는 경향을 보이는 반면 형성층 유래 세포는 생장속도가 빠르고, 색상의 변화가 없어 안정적인 세포 선발이 가능하였다.

배양 6개월 후 대부분의 배 및 잎 유래 캘러스(callus)는 황색 또는 밝은 ㄱ갈색(llow or light brown)을 띠고, 응집되고, 형성층 유래 세포들은 백황색(white-yellow)을 띠고, 단일 세포 내지는 몇 개의 세포 덩어리 형태로 유지되었다. 갈변(browning) 및 응집(aggregation)되어진 캘러스는 자신이 분비하는 페놀 화합물에 의해 생장이 둔해지다가 종국에는 괴사하였다.

본 발명자에 의하면 6개월 후부터 배(embryo)와 잎(needle)으로부터 유도된 캘러스들은 유지 및 대량배양이 어려운 반면 형성층 유래 세포는 20개월 이상 장기 배양시 세포의 생장률, 생장 패턴, 응집 정도에 변이 없이 안정적으로 유지되어 대량배양이 가능했다(도2). 즉 초기 식물 재료의 동＆이질성(homogeneity ＆ heterogeneity) 여부에 따라 생장 패턴에 가변성이 나타났다.

＜실시예 4＞ 세포현탁배양체 확립

배 및 잎 유래 캘러스(callus)와 형성층 유래 세포들을 각각 액상배지(표2)가 함유된 플라스크에서 배양하였다.

암조건에서 25±1℃에서 100rpm의 회전 교반기(shaker)에서 배양하였다. 계대배양 주기는 2주일로 고정함으로써 배양세포가 항상 대수생장기 상태에서 높은 활력을 유지할 수 있도록 하였다.

세포 생산능 변이의 주요 원인인 응집 정도를 측정하였다. 세포 응집정도 파악(cell aggregate quantification)은 광학 현미경(biological microscope CX31, Olympus, Japan) 하에서 측정을 하였고 상기한 실험의 결과로는 표 3과 같다.

배(embryo)와 잎(needle) 유래 현탁배양물의 경우에는 1.5mm 이상의 세포응집체가 60％ 이상인데 반해 형성층(cambium) 유래 현탁배양물의 90％가 단일세포(single cell) 상태로 배양되고 있음을 확인하였다.

＜실시예 5＞ 생산규모의 확대

3L의 내용적을 갖는 공기 부양식 생물반응기(airlift bioreactor, 성원사이텍, Korea)에서 배(embryo)잎(needle) 유래 캘러스와 형성층 유래 세포를 배양하였다. 배지는 액상배지를 이용하였고, 암조건에서 25±1℃로 일정하게 유지하였다.

배(embryo)잎(needles) 유래 배양물의 경우 플라스크 배양과 비교하여 크기와 모양에 큰 변이가 있었다. 세포 응집체의 지름이 2-3mm까지 커져 배양기 내 흐름을 저해하여 혼합정체영역이 발생하였다. 배양기 내부 벽에 세포가 달라붙어 생장하는 생장고리(growth ring)가 형성되고, 배양 20일 이후부터 원활한 배지의 공급을 받지 못하여 생장고리 중앙이 고사하고, 궁극적으로는 고사 세포로부터 유해물질이 분비되어 배양되는 모든 세포의 활력을 저하시키는 것을 확인하였다. 이와 달리 형성층 유래 배양물의 경우는 크기가 작아 배양기 내 공기순환이 원활히 이루어져 공기 공급량을 분당 200ml에서 150ml로 감소시킬 수 있었고, 이로 인해 배지 표면에 발생 기포의 양도 현격히 줄일 수 있었다.

배(embryo)잎(needles) 유래 배양물의 배가시간(doubling time)은 플라스크에서는 12일인데 반해 반응기(reactor)에서는 21일로 길어졌다. 이것은 반응기 내에서의 생장고리 생성과 배양중의 식물 배양체 응집성과 세포벽이 단단하여 절단에 대한 민감성으로 세포 생존율(cell viability)이 급격히 감소한 것이 원인인 것으로 사료된다. 형성층 유래 배양물의 배가시간은 4-5일로 플라스크와 반응기 사이에 차이가 없거나 오히려 단축되었다(표4). 형성층 유래 배양물은 생물반응기내의 생장고리 면적을 아주 작게 형성하고, 배양기에 간단한 자극을 주어 배지를 움직여주면 내벽의 ring이 간단하게 해소되었다. 또한 응집이 작고, 많은 vacuole를 가지고 있어(도3) 전단에 대한 민감성이 약하여 세포 생존율(cell viability)의 감소를 가져오지 않았다.

＜실시예 6＞ 엘리시터(Elicitor)

엘리시터는 식물세포에서 분자신호(molecular signal)를 조절하여 이차대사에 작용하는 것으로 이차대사산물의 생산 효율의 증가에 널리 사용되고 있다. 본 발명자들은 메틸 자스모네이트(Methyl Jasmonate)외 10여종을 처리한 결과 메틸 자스모네이트가 파클리탁셀(paclitaxel) 생산에 효과를 보였으며, 메틸 자스모네이트와 다른 엘리시터를 조합하여 처리함으로써 상대적으로 높은 물질 생산성을 얻을 수 있었다. 특히 파클리탁셀(paclitaxel)은 메틸 자스모테이트와 키토산(chitosan), 페닐라닌(phenylanine)이 처리된 배양체에서 가장 효과적이었다(도4).

＜실시예 7＞ 조절 인자들(Conditioning factors)

식물체 유래의 2차 대사산물은 세포가 생장할 때 생성되는 경우와 세포의 생장이 멈추는 시기에 생성되는 경우가 있다. 따라서 파클리탁셀(paclitaxel)과 같이 세포의 생장과 산물생성이 분리된 경우에는 첫 단계 배양에서 세포의 생장을 최적화하여 짧은 시간에 산물을 생산할 수 있는 세포들을 대량 증식시킨 후 다음 단계에서 배양환경을 산물생산에 적합한 조건으로 바꾸어 주는 두 단계(two stage) 배양이 적절하다.

2차 대사산물의 높은 생산력을 가지는 세포는 낮은 생산력의 세포에 비해 더 느리게 생장하고 더 급속하게 괴사한다. 따라서 대량 증식이 어렵고, 이에 따라 대사산물의 대량생산이 불가능하다.

본 발명에서는 이러한 증식력은 낮으나 생산력이 높은 세포주, 산물을 생산할 수 있는 대상 세포로써 대량 증식하는 것이 아니라 이차대사산물 생산을 위한 조절인자들을 가지는 도움세포로써 이용하였다. 도움세포 첨가 후 파클리탁셀(paclitaxel) 생성을 조사하였고 그 결과를 도면 5에 요약하였다.

＜실시예 8＞ 관류식 배양(Perfusion culture)

배 및 잎 유래 캘러스(callus)와 형성층 유래 세포들의 배양 14일째 엘리시터를 처리하였다. 엘리시테이션 시점부터 매 5일마다 각 플라스크에서 오래된 배지(spent medium)를 피펫을 이용하여 무균적으로 회수하고 동시에 같은 양의 새 배지를 공급하였다. 이 방법으로 45일 동안 연장 배양한 후 파클리탁셀(paclitaxel) 생성을 세포와 배지에서 조사하였고, 결과를 표5에 요약하였다.

세포로부터 배지(medium)로의 파클리탁셀(paclitaxel)의 분비가 세포주에 따라 차이가 있었다. 형성층세포주의 분비능력이 기존 선행 배양의 절편세포주(explant cell line)보다 월등함을 확인하였다. 덧붙여 관류식 배양이 추가됨에 따라 2차대사산물의 생산량 증가뿐 아니라 배지내 분비를 촉진하였다. 형성층(Cambium) 유래 단일세포 기원 세포주와 주기적인 배지교환에 의한 2차대사 산물의 세포외 배지로의 분비 향상은 연속적으로 바이오매스를 재사용하고 이후의 정제를 간단히 할 수 있다는 점에서 매우 중요한 의미를 갖는다.

즉 형성층 유래 단일세포 기원 세포주를 주기적으로 배지를 교환해줌으로써 세포내 산물이 축적됨에 따라 발생하는 생합성 저해 현상과 배지내 대사산물의 변성현상을 방지할 수 있어, 가치있는 산물을 장기적?안정적으로 생산해 낼 수 있는 방법이라 할 수 있다.

＜실시예 9＞ 동결보존

배양 6일에서 7일 된 현탁 배양물을 실온에서 0.16M의 마니톨(mannitol)이 첨가된 배지에 3일간 예비배양한 후 4℃에서 3시간 동안 저온처리시켰다. 저온처리된 세포를 수거한 다음, 40％ 에틸렌 글리콜(ethylene glycol /Sigma, USA)과 30％ 솔비톨(sorbitol / DUCHEFA, The Netherlands)이 포함된 배지를 4ml cryovial(Duran, USA)에 옮겨 4℃에서 3분간 배양하였다. 동결보존제가 처리된 배양세포는 액체질소에 침지시켜 냉동시켰다. 해빙을 위해 액체질소에 10분 이상 유지된 배양세포를 꺼내어 40℃ 수조에 넣고 1∼2분간 해동시켰다. 세포 재생장을 위해, 세포를 포함하는 여과물을 0.5M 솔비톨이 첨가된 반고형 생장배지(표1)상에 적용시키고, 30분 동안 실온에서 안정화시킨 다음 이런 방식으로 0.1M sorbitol을 포함하는 반고형생장배지에 24시간, 솔비톨을 포함하지 않은 반고형 생장배지에 24시간, 다시 솔비톨을 포함하지 않은 신선한 반고형 생장배지에 24시간동안 배양 후 세포 생존율을 관찰하였다.

＜실시예 10＞ 파클리탁셀(paclitaxel) 함량 분석

수거한 샘플을 세포와 배지로 분리시킨 후 각각의 파클리탁셀(paclitaxel) 함량을 분석하였다. 세포는 진공건조(vacuum desicator, Sam Shin Glass, Korea)로 완전히 말린 후 질량을 측정하였다. 건조중량 100mg 이하의 세포에 메탄올(Sigma, USA), 메틸렌클로라이드(Sigma, USA) 혼합액 (1:1, v/v) 4ml을 섞은 후 실온에서 1시간씩 3차례에 걸쳐 초음파(ultrasonic cleaner, Branson, USA)를 이용하여 추출하였다. 진공으로 완전히 건조시키고 다시 4ml의 메틸렌클로라이드를 넣고 수차례에 걸쳐 분리하였다. 분리된 유기용매층은 진공 건조시킨 후 남아있는 추출물을 1ml의 메탄올에 다시 녹였다. 녹인 추출물은 초음파로 균등하게 교반이 되도록 하였고 원심분리(8,000g×5분)를 이용하여 고상물을 제거하였다.

세포에서 분리된 배지(1∼5ml)는 동일한 부피의 메틸렌클로라이드와 혼합하여 충분한 교반을 통하여 추출하는 과정을 3차례 반복하였다. 유기용매를 진공 하에서 완전히 건조시킨 후 남아있는 추출물을 0.5ml의 메탄올로 다시 용해시켰다.

HPLC(High Performanse Liquid Chromatography, Shiseido, Japan)를 이용하여 함량을 분석하였으며 파클리탁셀(paclitaxel) 표준물질은 시그마(Sigma) 제품을 사용하였다. 역상 칼럼(Capcell pak, C18, MGⅡ, 5um, 3.0mm×250mm, Shiseido, Japan)을 오븐을 이용하여 40℃로 유지시켰고 이동상은 물과 아세토나이트릴(Burdick ＆ Jackson, USA)(50:50, v/v)을 혼합하여 일정하게 0.5ml/분의 속도로 흘려주었고 검출기는 자외선검출기(UV-VIS detector 227nm, Shiseido, Japan)를 이용하였다.

본 발명에 의하면, 어린 줄기로부터 정확하게 형성층만을 분리배양해 내어 탈분화 과정없이 분열조직적 연속성을 가진 1기 분열조직적 단세포 유래 세포군(single cell clone)을 성공적으로 획득함으로써 기존 기술의 세포 대비 배가시간(doubling time)이 짧아서 생산 효율이 높고, 장기 배양 과정에서 세포 생장률, 생장 패턴의 변화가 적어 생산성이 안정적이고, 세포 응집력(aggregation)이 작고, 다수의 액포(multiple vacuole)를 가져 생물 반응기내 생산규모의 확대가 가능하고, 동결 보존 후 유전적 변이 없이 회수가 가능한 세포주를 얻을 수 있다.

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부호 없음

Claims

식물로부터 분리된 선천적으로 미분화된 세포들을 함유하는 식물 유래 세포주로써, 상기 세포주는 식물의 형성층 조직으로부터 분리되고, 캘러스로의 탈분화과정을 거치치 아니한 1기 분열조직의 분열조직적 연속성을 가지는 것을 특징으로 하는 식물 유래 세포주.
제1항에 있어서, 상기 세포주는 다음 중 적어도 하나의 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 식물 유래 세포주 :
(i) 식물의 탈분화된 캘러스로부터 유래된 세포에 비하여 낮은 응집율을 가짐;
(ii) 식물의 탈분화된 캘러스로부터 유래된 세포에 비하여 작은 사이즈의 세포 집합체를 형성함;
(iii) 식물의 탈분화된 캘러스로부터 유래된 세포에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스에 대해 낮은 민감성을 가짐;
(iv) 식물의 탈분화된 캘러스로부터 유래된 세포에 비하여 생장 속도가 빠름; 및
(v) 식물의 탈분화된 캘러스로부터 유래된 세포에 비하여 안정하게 오랫동안 생장할 수 있음.
제1항에 있어서, 상기 세포주는 동질적인 것을 특징으로 하는 식물 유래 세포주.
제2항에 있어서, 상기 세포주는 다수개의 액포를 가지는 것을 특징으로 하는 식물 유래 세포주.
제2항에 있어서, 상기 (iv) 또는 (v)단계에서의 생장은 현탁 배양물 내에서 인 것을 특징으로 하는 식물 유래 세포주.
제3항에 있어서, 상기 식물은 주목 속(the genus Taxus) 것을 특징으로 하는 식물 유래 세포주.
삭제
제6항에 있어서, 상기 세포주는 1.5mm 이상의 세포응집체는 형성하지 않는 것을 특징으로 하는 식물 유래 세포주.
제6항에 있어서, 상기 세포주는 1.0mm 이상의 세포응집체는 형성하지 않는 것을 특징으로 하는 식물 유래 세포주.
제6항에 있어서, 상기 세포주는 적어도 20개월동안 배양시에 안정적으로 생장하는 것을 특징으로 하는 식물 유래 세포주.
제6항에 있어서, 상기 세포주는 배가 시간이 반응기에서는 21일 이내이거나, 플라스크에서는 11.5일 이내인 것을 특징으로 하는 식물 유래 세포주.
제11항에 있어서, 상기 세포주는 배가 시간이 반응기에서 4일이거나 플라스크 내에서 5일인 것을 특징으로 하는 식물 유래 세포주.
제1항에 있어서, 상기 세포주는 생물학적 유용 물질을 생산하는 것을 특징으로 하는 식물 유래 세포주.
제13항에 있어서, 상기 생물학적 유용 물질은 2차 대사산물인 것을 특징으로 하는 식물 유래 세포주.
제14항에 있어서, 상기 생물학적 유용 물질은 식물의 탈분화된 캘러스로부터 유래 세포들에서 생산된 것에 비해 더 많은 것을 특징으로 하는 식물 유래 세포주.
제15항에 있어서, 상기 생물학적 유용 물질은 알칼로이드, 알레르기 항원, 아미노산, 안스라퀴논, 항백혈병 물질, 항생물질, 항암물질, 항바이러스 물질, 효소, 플라보노이드류, 살충제, 진정제, 향로, 색소, 비타민, 다당류 및 이들의 조합으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 식물 유래 세포주.
제15항에 있어서, 상기 식물을 주목 속이고, 상기 생물학적 유용 물질은 파클리탁셀인 것을 특징으로 하는 식물 유래 세포주.
제17항에 있어서, 상기 세포주는 주목의 탈분화된 캘러스로부터 유래된 세포들 보다 270-720배 증가된 파클리탁셀 분비능을 가지는 것을 특징으로 하는 식물 유래 세포주.
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