KR20040108052A

KR20040108052A - 형성층을 이용한 식물세포배양 방법

Info

Publication number: KR20040108052A
Application number: KR1020030038793A
Authority: KR
Inventors: 진영우
Original assignee: 진영우
Priority date: 2003-06-16
Filing date: 2003-06-16
Publication date: 2004-12-23
Also published as: KR100533120B1

Abstract

본 발명은 식물의 분열조직인 형성층을 이용한 식물세포배양 방법에 관한 것으로, 식물의 줄기를 무균처리 공정 후 형성층 채취단계 ; 캘러스 유도배지에서 상기 형성층으로부터 캘러스 유도단계 ; 및 세포 증식배지에서 상기 캘러스의 현탁 배양을 통한 세포 증식단계로 구성된다.

종래에는 식물세포배양시 종자배양 등을 하였으나, 본 발명은 분열조직인 형성층을 배양함으로서, 그 세포 배양시 급속대량생산이 가능하고, 유용이차대사산물생산에 있어서 자연생태계 및 환경파괴를 하지 않고 원료공급을 할 수 있으므로, 환경, 경제, 산업적 측면에서 크게 기여할 것이다.

Description

형성층을 이용한 식물세포배양 방법{METHOD OF PLANT CELL CULTURE FROM CAMBIUM}

본 발명은 식물세포를 급속하게 대량으로 생산하기 위한 식물 배양방법으로서, 더욱 상세하게는 일반적인 종자 배양이 아닌 형성층 배양을 통해 캘러스를 유도하는 식물세포배양 방법에 관한 것이다.

식물 세포 배양은 무균적으로 식물의 절편(세포, 조직, 기관 등)을 인공적으로 만든 배지(영양분을 공급하는 액체 혹은 액체를 한천과 같은 것으로 고형화한 것)에 놓고 인공광(光)으로 적정한 온도를 유지하며 배양하는 것이 일반적이다.

1904년에 Hanning이 무균상태 하에서 미숙배(未熟胚)를 배양하여 소식물체(plantlet)을 얻은 것을 시초로 하여 1920년 이후에는 난 종자의 발아, 캘러스 배양(callus culture), 기관배양 등이 이루어졌는데, 1945년 이후에는 이러한 다양한 형태를 한데 묶어 식물조직배양으로 부르게 되었다.

식물조직배양은 초기의 기술 영역에서 벗어나 광범위한 분야로 발전하고 있으며 특히 유전공학 기술과 결합하여 고등식물에서 유전공학 기술을 완성시키는데 필수적인 기술로 자리잡고 있다.

최근에는 분자생물학의 발전 및 연구 기자재의 개발에 따라 유전자 수준에서의 조직배양 관련 기작의 연구가 가능하리라고 보며 이와 더불어 발생학적인 면에서의 깊이 있는 연구도 시작될 것으로 본다. 이러한 연구들이 계속적으로 이루어질 때식물조직배양도 지금과는 달리 생물공학 분야 전반에 걸친 파급 효과를 가지며 특히 식물 관련 기초 및 응용 분야에서 확고한 자리를 차지하게 될 것으로 믿는다.

그러나, 식물세포 배양은 종종 필요성분의 함량이 낮고 생산성의 불안전 등 몇 가지 문제점에 접하게 된다.

이에 유전공학적인 방법을 채용한 식물 형질전환 방법으로 품종의 단점을 개선하여 상업적 가치를 높이는 방법이 채용되고 있으나, 형질전환의 부수적인 문제점으로는 유전적인 손상을 들 수 있으므로, 이 또한 완전한 대안이 될 수는 없다.

따라서, 특히, 식물에서 유효성분을 추출할 경우 유전적 손상이 없는 식물 세포의 급속한 대량 생산 방법이 요구되는 실정이다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위하여 발명된 것으로서,

본 발명의 목적은 세포의 대량 생산을 위한 식물세포의 배양 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 식물세포의 유효성분을 다량 추출을 위한 원료공급 방법을 제공하는 데에 있다.

도 1 은 종자로부터 분리된 배(embryo), 침상엽에서 채취한 엽육조직(mesophyll), 및 줄기에서 채취한 형성층(cambium)을 동시에 배양한 결과를 나타낸 사진으로, 상단에서 하단으로 엽육조직, 배, 형성층에 대한 결과이다.

도 2 는 잎의 엽육조직 및 줄기의 형성층 배양에 관한 결과를 나타낸 사진으로, 오른쪽 상단이 사진은 엽육조직에 관한 사진이고, 나머지 3개는 줄기에서 채취한 형성층이 세포 분열하여 캘러스를 형성하는 것을 보여주는 사진이다.

도 3 은 계절별로 채취한 외식편의 종류에 따른 캘러스 유도율을 도시한 그래프이다.

도 4 는 캘러스 유도에 적합한 첨가제인 피클로람(picloram)의 효과를 도시한 그래프이다.

도 5 는 캘러스 유도에 적합한 첨가제인 지베렐르산(gibberellic acid; GA₃)의 효과를 도시한 그래프이다.

도 6 은 다양한 배지에서 배양시 캘러스 유도율을 비교한 그래프이다.

도 7 은 첨가제에 따른 세포 증식을 비교한 그래프이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 단계로 구성된다.

식물의 줄기를 무균처리 공정 후 형성층 채취단계 ;

캘러스 유도배지에서 상기 형성층으로부터 캘러스 유도단계 ; 및

세포 증식배지에서 상기 캘러스의 현탁배양을 통한 세포증식 단계.

종래에는 식물세포 배양시 종자 배양 등을 하였으나, 본 발명자는 분열조직인 형성층을 배양함으로서 단시간내에 대량생산이 가능함을 발견하여 본 발명을 완성하기에 이른 것이다. 본 발명에서는 특히, 식물의 줄기에서 채취한 형성층을 이용함으로서 캘러스 유도율을 향상시켰다.

형성층이란, 부름켜라고도 하는 것으로 식물이 부피 생장할 수 있도록 하는 조직이다. 이 조직은 줄기나 뿌리의 목질부와 체관부 사이에 존재하며 활발히 분열하여 줄기나 뿌리가 굵어지게 한다. 세포분열이 가장 활발하게 일어나는 분열조직으로서 식물조직배양의 외식편으로 사용시 세포의 고속 및 다량생산이 가능하게 된 것이다.

또한, 캘러스(CALLUS)란 식물체에 상처를 낸다든지 접목을 할 경우 절단면에서 탈분화가 일어나 부정형의 세포덩어리가 형성되는데 이를 지칭하기도 하고 조직배양에서는 탈분화된 미분화세포조직을 말한다.

본 발명은 형성층을 채취하여 캘러스(CALLUS)를 유도한 후 이 캘러스를 현탁배양 함으로서 세포를 대량 생산하고자 하는 것이다.

하기 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다.

실시예 1

식물재료의 준비

주목의 종자(배), 침상엽(엽육조직), 줄기(형성층)를 계절별(겨울, 봄, 여름)로 각각 채취하였다. 재료들의 형태학적·생리학적 특성상 각기 다른 방법으로 표면살균을 수행하였다.

① 종자(배): 70% 에탄올에 1분간 표면살균 후, 1% 하이포아염소산나트륨 용액에 48시간 침적시킨 후 멸균수로 3-4회 세척하여 종자로부터 접합자배를 채취하여 실험재료로 사용하였다.

② 침상엽과 줄기: 1% 베노밀 ＋ 1% 스트렙토마이신 용액에 24시간 침적시켜 흐르는 물로 30분 세척 후 70% 에탄올에 1분간 표면살균 후, 1% 하이포아염소산나트륨용액에 30분 침적시킨 후 멸균수로 3-4회 세척하여 실험재료로 사용하였다. 줄기는 0.05cm 크기로 횡단하여 자른 후 디스크로 만들어 형성층의 횡단면이 배지면에 닿도록 하였다.

실시예 2

캘러스의 유도에 있어서 외식편의 영향

실시예 1 에서 주목의 종자와 주목나무의 침상엽에서 채취한 엽육조직 및 줄기에서 채취한 형성층에서 캘러스를 유도하기 위하여 각각 다른 식물생장조절물질 {2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid), NAA(α-naphtalene acetic acid), IAA(Indole-3-acetic acid), IBA(3-Indolebutyric acid), Dicamba, Picloram}과 0.4% 겔라이트(gelrite), 3% 자당(sucrose)이 첨가된 MS, B5, 변형된 B5, 그리고 SH 배지에 첨가하여 배지를 제조하였다.

배지는 겔라이트(gelrite) 첨가 전에 pH 5.8로 조정하여 121℃, 1.2기압에서 15분간 고압 멸균하였다. 또한 실험목적상 첨가가 요구되는지베렐르산(gibberellic acid; GA₃)은 멸균된 배지에 무균적으로 첨가하였다.

멸균된 배지는 약 25 mL씩 페트리디쉬(petridish)에 분주하여, 표면살균 과정을 거친 각각의 외식편을 치상하였다. 실험재료의 배양은 25±1℃의 암조건하에서 수행하였다.

B5 배지란 식물배양에서 사용되는 주요 배지 중의 하나로 Gamborg 등이 1968년에 콩 조직의 배양용으로 고안한 무기염류와 유기물에 배합이다. 그 후로 실험 목적이나 내용에 따라 무기염류와 유기물의 조성 및 비율에 변화가 가능하고 이를 변형된 B5 배지라 칭한다. 본 실험에서는 캘러스를 최대로 유도하기 위하여 원래의 B5 배지조성에서 KNO₃의 양을 2배 늘리고, 유기물질인 비타민량을 2배로 늘려 변형한 변형된 B5 배지를 사용하였다.

B5배지 및 본 발명에서 사용된 변형된 B5 배지의 조성은 하기 표 1과 같다.

조성	B5 배지	변형된 B5 배지
Macronutrients(㎎/L)	KNO₃	2500	5000
	CaCl₂·2H₂O	150	150
	MgSO₄·7H₂O	250	250
	NaH₂PO₄·H₂O	150	150
	(NH₄)₂SO₄	134	134
Micronutrients(㎎/L)	MnSO₄·4H₂O	13.2	13.2
	ZnSO₄·7H2O	2	2
	H₃BO₃	3	3
	KI	0.75	0.75
	CuSO₄·5H₂O	0.025	0.025
	Na₂MoO₄·2H₂O	0.25	0.25
	CoCl₂·6H₂O	0.025	0.025
Vitamin(㎎/L)	Inositol	100	200
	Thiamine HCl	10	20
	Nicotinic acid	1	2
	Pyridoxine	1	2

상기한 실험의 결과는 하기와 같다.

도 1에 도시된 바와 같이, 배양 10일째부터 형성층에서 연노랑의 캘러스가 유도되기 시작하여 배양 20일째는 상당량의 캘러스가 형성되었다. 반면에 배양 20일째 종자에서는 캘러스의 형성이 전혀 관찰되지 않았으며, 침상엽의 엽육조직에서는 캘러스 유도를 보였으나 그 양은 극히 미비하였다. 줄기의 형성층으로부터 유도된 캘러스의 생중량은 침상엽의 엽육조직으로부터 유도된 캘러스 보다 약 10배의 높은 증식율을 나타내었다. 이와 같이 각각의 외식편으로부터 캘러스 유도는 줄기의 형성층이 가장 효과적이었다.

도 2 는 잎에서 채취한 엽육조직과 줄기에서 채취한 형성층 배양에 관한 도면으로서, 부풀어 오르면서 세포분열을 시작하여 캘러스가 유도되는 과정을 도시한 도면이다.

동시 배양 시 줄기에서 채취한 형성층과는 달리, 잎에서 채취한 엽육조직은 세포분열을 하기 위한 세포 확대 단계에 그치는 것을 확인할 수 있다.

또한, 계절별로 채취한 줄기의 형성층 중, 특히 겨울에 채취한 형성층으로부터 외식편 당 78.56mg 으로 가장 높은 캘러스 유도율을 보였으며, 채취시기의 온도가 증가할수록 캘러스의 유도율은 감소하여 봄, 여름 순으로 나타났다. 이와 같이 캘러스 유도율은 채취시기에 따라, 외식편의 종류에 따라 현저하게 차이가 있어 최고의 캘러스 유도율은 겨울에 채취한 줄기의 형성층으로부터 얻을 수 있었다. 이는 도 3 과 같다.

실시예 3

줄기로부터 채취된 형성층의 캘러스 유도를 위한 옥신의 확인

줄기의 형성층으로부터 캘러스 유도에 있어서 효과적인 옥신을 알아보고자 2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid), NAA(α-naphtalene acetic acid), IAA(Indole-3-acetic acid), IBA(3-Indolebutyric acid), Dicamba, Picloram을 변형된 B5배지에 첨가하였다.

식물생장조절물질의 적절한 농도를 알아보고자 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2, 4, 8 (mg/L)의 저농도 그룹과 10, 20, 30, 40, 50 (mg/L)의 고농도 그룹으로 나누어 실험한 결과, 저농도 그룹에서는 고농도의 그룹에 비해 캘러스 유도율이 미비하였으며 일부는 계대배양 과정중에 괴사하였다.

사용한 옥신에 있어서 NAA(α-naphtalene acetic acid), IAA(Indole-3-acetic acid), IBA(3-Indolebutyric acid)는 캘러스 유도가 관찰되지 않았으며, dicamba에서는 일부 유도되었으나 미비하였다. 또한 2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) 처리에 있어서도 캘러스가 일부 유도되었으나 배양중에 갈변되어 괴사하였다. 따라서 캘러스 유도는 옥신 계열인 picloram이 효과적이었으며, 도 4에 도시된 바와 같이, 최적농도는 30 mg/L picloram 임을 알 수 있다.

실시예 4

캘러스 유도에 지베렐르산(gibberellic acid; GA₃)의 효과

조직의 발달에 있어서 형성층 분열에 관여하는 것으로 알려진 지베렐르산 (gibberellic acid; GA₃)을 배지에 첨가하여 캘러스 유도에 긍정적인 효과를 얻을 수 있었다.

0.5 mg/L 지베렐르산 (gibberellic acid; GA₃)의 첨가로 인해 첨가되지 않은 대조구와 비교하여 2배의 캘러스 유도율을 나타냈다.

이는 도 5에 도시된 바와 같다.

실시예 5

캘러스 유도를 위한 배지의 선정

배지를 조성하는 염류와 유기물 조성에 따른 캘러스 유도를 알아보고자 각각의 배지를 사용하였던 바, 많은 차이를 나타내었으며, 캘러스 유도는 B5 배지나, MS, SH 배지에 비하여 변형된 B5 배지의 염류와 유기물 조성에서 가장 효과적이었으며, MS 배지에서 가장 저조하였다. 이는 도 6에 도시된 바와 같다.

상기 실시예에서 실험 결과 주목나무의 형성층으로부터 캘러스 유도배지의 최적 조성은 표 2와 같음을 확인할 수 있었다.

캘러스 유도 최적 배지
^※B5 major salts2X B5 vitaminsActivated charcoalGA₃SucrosePiclorampHGelrite	2X KNO₃0.01%0.5 mg/L3%30 mg/L5.80.4%

^※Gamborg B5 medium : Gamborg et al., Exp. Cell Res., (1968)

실시예 6

세포 증식을 위한 첨가제의 선정

캘러스 유도배지에서 약 20일간 배양 후 외식편으로부터 형성된 캘러스로부터 상태가 양호한 세포주를 선발하였다. 세포주는 picloram과 NAA(α-naphtalene acetic acid)가 단독 및 조합처리된 변형된 B5 배지를 사용하여 진탕배양기에서 110 rpm 속도로 배양증식하였다. 세포증식은 단독처리보다는 조합처리된 조건에서 양호하였으며, 5 mg/L picloram과 2 mg/L NAA(α-naphtalene acetic acid)가 첨가된 변형된 B5 배지에서 가장 효과적이였다. 농도와 무관하게 2,4-D(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid)와 NAA(α-naphtalene acetic acid) 단독배지에서는 picloram 첨가배지보다 낮은 세포 증식율을 보였다. 세포 증식에 있어서 가장 효과적인 옥신류는 picloram이고, 이에 NAA(α-naphtalene acetic acid)의 첨가는 상승효과를 유도함을 알 수 있었다. 이는 도 7에 도시된 바와 같다.

도면에서 부호는 하기와 같다.:

P2.5N1는 변형된 B5배지에 2.5mg/L picloram과 1mg/L NAA(α-naphtalene acetic acid)의 첨가;

P5N2: 5mg/L picloram과 2mg/L NAA(α-naphtalene acetic acid)의 첨가;

P10N4: 10mg/L picloram과 4mg/L NAA(α-naphtalene acetic acid)의 첨가;

P20N8: 20mg/L picloram과 8mg/L NAA(α-naphtalene acetic acid)의 첨가;

P40N16: 40mg/L picloram과 16mg/L NAA(α-naphtalene acetic acid)의 첨가된 배지이다.

상기 실시예에서 캘러스로부터 유도된 세포 증식 배지의 최적 조성은 표 3과 같음을 확인할 수 있었다.

세포 증식 최적 배지
^※B5 major salts2X B5 vitaminsGA₃SucrosePicloramNAA(α-naphtalene acetic acid)pH	2X KNO₃0.5 mg/L3%5 mg/L2 mg/L5.8

^※Gamborg B5 medium : Gamborg et al., Exp. Cell Res., (1968)

이상에서 살펴본 바와 같이, 형성층 배양 특히, 변형된 B5 배지에서 줄기 형성층 배양은 세포생장 및 증식을 최적화하여 유용이차대사산물을 생산하는 세포들을 짧은 시간내 대량 증식시킬 수 있는 효과를 갖는다.

특히, 캘러스 유도에 효과적인 배지는 picloram 30 mg/L이 첨가된 변형된 B5배지였으며, 세포증식은 5 mg/L picloram과 2 mg/L NAA(α-naphtalene acetic acid) 가 첨가된 변형된 B5 배지에서 가장 효과적임을 확인 할 수 있다.

본 발명의 배양 방법은 배양이 어려운 유효성분이 있는 다양한 목본식물 에도 적용될 것이며, 유용이차대사산물 생산에 있어서 환경파괴를 하지 않은 원료공급원 뿐만 아니라, 이로 파생되는 환경, 경제, 산업적 측면에서 크게 기여할 것이다.

Claims

하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물 세포배양 방법

식물의 줄기를 무균처리 공정 후 형성층 채취단계 ;

캘러스 유도배지에서 상기 형성층으로부터 캘러스 유도단계 ; 및

세포 증식배지에서 상기 캘러스의 현탁 배양을 통한 세포증식 단계.
제 1항에 있어서, 줄기는 겨울에 채취한 것임을 특징으로 하는 식물 세포배양 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 캘러스 유도배지에 피클로람(picloram)을 첨가하는 것을 특징으로 하는 식물세포 배양 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 캘러스 유도배지에 형성층 분열에 관여하는 지베렐르산(gibberellic acid; GA₃)을 첨가하는 것을 특징으로 하는 식물세포 배양 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 캘러스 유도배지는 B5배지에서 KNO₃및 비타민을 2배로 증가시킨 변형된 B5 배지인 것을 특징으로 하는 식물세포 배양 방법.
제 3항에 있어서, 피클로람(picloram)의 농도는 30mg/L인 것을 특징으로 하는 식물세포 배양 방법.
제 4항에 있어서, 지베렐르산(gibberellic acid; GA₃)의 농도는 0.5mg/L 인 것을 특징으로 하는 식물세포 배양 방법.
제 1항 또는 제 2항에 있어서, 세포증식 배지로서 피클로람(picloram) 및 NAA(α-naphtalene acetic acid)이 첨가된 변형된 B5배지를 사용하는 것을 특징으로 하는 식물세포 배양방법.
제 8항에 있어서, 피크로람(picloram) 및 NAA(α-naphtalene acetic acid)의 농도는 각각 5mg/L와 2mg/L인 것을 특징으로 하는 식물세포 배양 방법.