CN116724888B - 一种快速诱导桫椤丛生芽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速诱导桫椤丛生芽的方法，所述方法是先以桫椤孢子为外殖体消毒处理后进行萌发初代培养，再经过原叶体续代培养和配子体不完全培养，最后将桫椤孢子体丛生芽进行移栽。桫椤的匀浆组织再生，配子体的增殖率为100%，孢子体的分化率100%，形成大量的桫椤丛生芽。本发明实现了桫椤扩繁的高效增殖。
Description
技术领域
本发明属蕨类植物不完全组织培养领域，具体涉及一种快速诱导桫椤丛生芽的方法。
背景技术
桫椤(Alsophila spinulosa)，属桫椤科(Cyatheaceae)、桫椤属(Alsophila)，国家二级保护植物、现存唯一的木本蕨类植物。主要生长于温暖潮湿的热带及亚热带地区，我国主要分布于贵州、重庆、四川等地。外形上，桫椤树形高雅飘逸、青翠碧绿、特别是排列整齐的孢子囊群是自然界的奇特境观。桫椤茎、叶含有丰富的黄酮、多酚、多糖、有机酸等活性物质，具有较高的观赏价值和药用价值，运用及开发潜力大。
桫椤的生活史是孢子体世代占优势的异性交替，孢子体世代与配子体世代均可独立成活。桫椤繁殖是由孢子萌发、配子体增殖、分化出孢子体，最后成为绿色植株。不管是野外播种、还是实验室土壤播种，桫椤孢子萌发在土壤基质里进行，会受到土层基质的菌类、藻类、苔藓类等竞争及化感作用，导致萌发率低以及不萌发的现象。故直接将孢子体的部分结构以及孢子作为外植体进行植物组织培养是繁殖桫椤的常规方法。以孢子体作为外殖体，发现桫椤的营养叶、幼茎可能是分生细胞的不丰富，也有可能是桫椤内生菌的原因，导致其在组织培养技术中难以形成愈伤组织或者GGB、丛生芽等结构，构建组培体系困难。而以孢子作为外殖体，桫椤繁殖包括孢子萌发诱导配子体、配子体增殖、分化孢子体、孢子体生根等过程。孢子的萌发需要在低糖、低无机盐的培养条件下进行；在配子体时期，成熟精子器与颈卵器需水作为媒介才能发生受精作用，受精成功后才能分化出孢子体。
通常以孢子作为外植体，采用GGB途径的构建的繁殖体系，包括孢子萌发诱导配子体、配子体诱导GGB、GGB分化、孢子体生根、桫椤再生苗炼苗、移栽等。而在有限的组培容器内,原叶体增殖密度高,可能会分泌较高浓度的成精子囊素,会抑制颈卵器的发生；其次组培容器里的湿度，水环境有限，难以发生受精作用，也会抑制了孢子体的形成。并且此过程桫椤繁殖体系的构建过程中程序过多，工作量大，还要历经孢子体生根、炼苗移栽等过程。
目前，经过检索未发现有相关报道对桫椤孢子进行不完全组织培养。本发明通过对桫椤孢子不完全组织培养，在短时间内获得大量的桫椤再生植株，以解决桫椤孢子组织培养过程繁琐，组培苗炼苗移栽时间长、工作量大以及孢子繁殖中孢子易与菌类、藻类、苔藓类竞争养分而降低发芽率及生长速率等问题。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种快速诱导桫椤丛生芽的方法。该方法克服桫椤繁衍能力低，种群数量少，解决孢子繁殖周期长、效率低等技术问题。
本发明的技术方案：一种快速诱导桫椤丛生芽的方法，所述方法是先以桫椤孢子为外殖体消毒处理后进行萌发初代培养，再经过原叶体续代培养和配子体不完全培养，最后将桫椤孢子体丛生芽进行移栽。
前述方法包括以下步骤：
(1)桫椤孢子消毒处理：取成熟的桫椤孢子用10cm×10cm的滤纸完全包裹在蒸馏水浸泡10～15h，用灭菌后的烧杯在超净工作台上用30mL～60mL的75％酒精完全浸泡滤纸20～40s，无菌水清洗滤纸2～4次；再用30mL～60mL的5％NaClO溶液完全浸泡滤纸3～5min后，无菌水清洗8～12次，最后打开滤纸，加入15～35mL无菌水制成无菌孢子悬浮液，即得A品；
(2)萌发初代培养：将A品接种于萌发初代培养基上，培养时间为2个月，得到蝶形原叶体，即B品；
(3)原叶体续代培养：将B品接种在原叶体续代培养基中增殖为原叶体团，培养1个月，得到原叶体团，即C品；
(4)配子体不完全培养：配子体不完全培养：将C品放入小型电动搅碎机里，以1000r/min的搅拌速率搅拌20～40s，搅碎成匀浆组织，与无菌水混合直接接种在土壤基质1上，每2～4天喷施无菌水一次，培养2个月后，匀浆组织再生形成配子体，配子体增殖，进一步分化形成孢子体，最后生成孢子体丛生芽，即D品；
所述土壤基质1为：红壤：腐殖土：泥炭土＝1～2.5:0.5～1.5:0.5～1.5；
(5)桫椤孢子体丛生芽移栽：将D品分株移栽在土壤基质2，培养1个月后，移栽到大棚进行常态化管理；
所述土壤基质2为红壤：腐殖土：泥炭土＝0.5～1.5:0.5～1.5:0.5～1.5。
前述步骤(1)中，桫椤孢子消毒处理：取成熟的桫椤孢子用10cm×10cm的滤纸完全包裹在蒸馏水浸泡12h，用灭菌后的烧杯在超净工作台上用40mL～50mL的75％酒精完全浸泡滤纸30s，无菌水清洗滤纸3次；再用40mL～50mL的5％NaClO溶液完全浸泡滤纸4min后，无菌水清洗10次，最后打开滤纸，加入20～30mL无菌水制成无菌孢子悬浮液，即得A品。
前述步骤(2)中，培养条件为：温度为25±2℃，湿度为80±2％，光质为白光，光周期为12h/d，光照强度为3000Lux；
前述桫椤孢子萌发初代培养基为：1/8MS+0.5mg/L的6-BA+0.1mg/L的NAA+20g/L蔗糖+10g/L琼脂，使用1mol/L的NaoH和1mol/L的HCl调pH值至5.8。
具体的说，前述步骤(2)中，所述1/8MS的配比为大量元素:铁盐:微量元素:有机物＝0.125:1:1:1。
前述步骤(3)中，培养条件为：温度为25±2℃，湿度为80±2％，光质为白光，光周期为12h/d，光照强度为3000Lux；
前述原叶体续代培养基为：MS+20g/L蔗糖+6g/L琼脂，使用1mol/L的NaoH和1mol/L的HCl调pH值至5.8。
前述步骤(4)中，配子体不完全培养：将C品放入小型电动搅碎机里，以1000r/min的搅拌速率搅拌30s，搅碎成匀浆组织，与无菌水混合直接接种在土壤基质1上，每3天喷施无菌水一次，培养2个月后，匀浆组织再生形成配子体，配子体增殖，进一步分化形成孢子体，最后生成孢子体丛生芽，即D品。
前述步骤(4)中，培养条件为：温度为25±2℃，湿度为80±2％，光质为白光，光周期为12h/d，光照强度为3000Lux；
前述土壤基质1为：红壤：腐殖土：泥炭土＝2:1:1。
前述步骤(5)中，培养条件为：温度为25±2℃，湿度为80±2％，光质为白光，光周期为12h/d，光照强度为3000Lux；
前述土壤基质2为红壤：腐殖土：泥炭土＝1:1:1。
本发明与现有技术比较，具有以下优点：
1、增加桫椤繁殖方式以及提高桫椤的繁殖效率。桫椤的匀浆组织再生，配子体的增殖率为100％，孢子体的分化率100％，形成大量的桫椤丛生芽。本发明实现了桫椤扩繁的高效增殖。
2、相比与桫椤组培繁殖的建立，不完全组织培养建立桫椤繁殖，周期上大幅度缩短。加快了桫椤的产苗时间。在土壤基质生长的丛生芽在没有激素的调控下可以直接进行生根诱导。可以直接对其进行分株移栽。节约实验成本，缩短实验周期。
3、突破了桫椤配子体受精、孢子体诱导、孢子体生根、再生植株炼苗的困难，显著提高桫椤的出苗率。对实现珍稀濒危蕨类植物桫椤扩繁、种质资源离体保存具有重要意义，为规模生产及应用奠定基础。
附图说明
图1：桫椤孢子；
图2：匀浆组织；
图3：匀浆组织再生出配子体；
图4：出现无拳卷的叶、叶脉呈二叉状分枝；
图5：配子体分化；
图6：孢子体丛生芽；
图7：单株孢子体丛生芽；
图8：孢子体丛生芽移栽；
图9：红壤：腐殖土：泥炭土(2：1：1)基质生根的孢子体丛生芽；
图10：孢子体丛生芽的根。
具体的实施方式：
实施例1：
(1)取成熟的桫椤孢子用10cm×10cm的滤纸完全包裹在蒸馏水浸泡12h，用灭菌后的烧杯在超净工作台上用45mL的75％酒精完全浸泡滤纸30s，无菌水清洗滤纸3次；再用45mL的5％NaClO溶液完全浸泡滤纸4min后，无菌水清洗10次，最后打开滤纸，加入25mL无菌水制成无菌孢子悬浮液；
(2)配制萌发初代培养基：1/8MS+6-BA(0.5mg/L)+NAA(0.1mg/L)+蔗糖20g/L+琼脂10g/L，1/8MS的配比为大量元素:铁盐:微量元素:有机物＝0.125:1:1:1，使用1mol/L的NaoH和1mol/L的HCl调pH值至5.8；
(3)萌发初代培养：将无菌孢子悬浮液接种于萌发初代培养基上，在温度为25±2℃、湿度为80±2％、光质为白光、光周期为12h/d和光照强度为3000Lux的条件下培养2个月，得到蝶形原叶体；
(4)配制原叶体续代培养基：MS+蔗糖20g/L+琼脂6g/L，使用1mol/LNaoH和1mol/LHCl调pH值至5.8；
(5)原叶体续代培养：将蝶形原叶体接种在原叶体续代培养基中增殖为原叶体团，在温度为25±2℃、湿度为80±2％、光质为白光、光周期为12h/d和光照强度为3000Lux的条件下培养1个月，得到原叶体团；
(6)配子体不完全培养：将原叶体团放入小型电动搅碎机里，以1000r/min的搅拌速率搅拌30s，搅碎成匀浆组织，与无菌水混合直接接种在土壤基质1上，再温度为25±2℃，湿度为80±2％，光质为白光，光周期为12h/d，光照强度为3000Lux的条件下培养，每3天喷施无菌水一次，培养2个月后，匀浆组织再生形成配子体，配子体增殖，进一步分化形成孢子体，最后生成孢子体丛生芽；
土壤基质1为：红壤:腐殖土:泥炭土＝2:1:1；
(7)桫椤孢子体丛生芽移栽：将生成孢子体丛生芽分株移栽在土壤基质2，在温度为25±2℃、湿度为80±2％、光质为白光、光周期为12h/d和光照强度为3000Lux的条件下培养1个月后，移栽到大棚进行常态化管理；
土壤基质2为：红壤腐:殖土:泥炭土＝1:1:1。
实施例2：
(1)桫椤孢子消毒处理：取成熟的桫椤孢子用10cm×10cm的滤纸完全包裹在蒸馏水浸泡10h，用灭菌后的烧杯在超净工作台上用30mLmL的75％酒精完全浸泡滤纸20s，无菌水清洗滤纸2次；再用30mLmL的5％NaClO溶液完全浸泡滤纸3min后，无菌水清洗8次，最后打开滤纸，加入15mL无菌水制成无菌孢子悬浮液；
(2)配制萌发初代培养基：1/8MS+6-BA(0.5mg/L)+NAA(0.1mg/L)+蔗糖20g/L+琼脂10g/L，1/8MS的配比为大量元素:铁盐:微量元素:有机物＝0.125:1:1:1，使用1mol/LNaoH和1mol/LHCl调pH值至5.8；
(3)萌发初代培养：将无菌孢子悬浮液接种于萌发初代培养基上，在温度为25±2℃、湿度为80±2％、光质为白光、光周期为12h/d和光照强度为3000Lux的条件下培养2个月，得到蝶形原叶体；
(4)配制原叶体续代培养基：MS+蔗糖20g/L+琼脂6g/L，使用1mol/LNaoH和1mol/LHCl调pH值至5.8；
(5)原叶体续代培养：将蝶形原叶体接种在原叶体续代培养基中增殖为原叶体团，在温度为25±2℃、湿度为80±2％、光质为白光、光周期为12h/d和光照强度为3000Lux的条件下培养1个月，得到原叶体团；
(6)配子体不完全培养：将原叶体团放入小型电动搅碎机里，以1000r/min的搅拌速率搅拌20s，搅碎成匀浆组织，与无菌水混合直接接种在土壤基质1上，在温度为25±2℃、湿度为80±2％、光质为白光、光周期为12h/d和光照强度为3000Lux的条件下培养，每2天喷施无菌水一次，培养2个月后，匀浆组织再生形成配子体，配子体增殖，进一步分化形成孢子体，最后生成孢子体丛生芽；
土壤基质1为：红壤：腐殖土：泥炭土＝1:0.5:0.5；
(7)桫椤孢子体丛生芽移栽：将生成孢子体丛生芽分株移栽在土壤基质2，在温度为25±2℃、湿度为80±2％、光质为白光、光周期为12h/d和光照强度为3000Lux的条件下培养1个月后，移栽到大棚进行常态化管理；
土壤基质1为：红壤：腐殖土：泥炭土＝1:0.5:0.5。
实施例3：
(1)桫椤孢子消毒处理：取成熟的桫椤孢子用10cm×10cm的滤纸完全包裹在蒸馏水浸泡15h，用灭菌后的烧杯在超净工作台上用60mL的75％酒精完全浸泡滤纸40s，无菌水清洗滤纸4次；再用60mL的5％NaClO溶液完全浸泡滤纸5min后，无菌水清洗12次，最后打开滤纸，加入35mL无菌水制成无菌孢子悬浮液；
(2)配制萌发初代培养基：1/8MS+6-BA(0.5mg/L)+NAA(0.1mg/L)+蔗糖20g/L+琼脂10g/L，1/8MS的配比为大量元素:铁盐:微量元素:有机物＝0.125:1:1:1，使用1mol/LNaoH和1mol/LHCl调pH值至5.8；
(3)萌发初代培养：将无菌孢子悬浮液接种于萌发初代培养基上，在温度为25±2℃、湿度为80±2％、光质为白光、光周期为12h/d和光照强度为3000Lux的条件下培养2个月，得到蝶形原叶体；
(4)配制原叶体续代培养基：MS+蔗糖20g/L+琼脂6g/L，使用1mol/LNaoH和1mol/LHCl调pH值至5.8；
(5)原叶体续代培养：将蝶形原叶体接种在原叶体续代培养基中增殖为原叶体团，在温度为25±2℃、湿度为80±2％、光质为白光、光周期为12h/d和光照强度为3000Lux的条件下培养1个月，得到原叶体团；
(6)配子体不完全培养：将原叶体团放入小型电动搅碎机里，以1000r/min的搅拌速率搅拌40s，搅碎成匀浆组织，与无菌水混合直接接种在土壤基质1上，在温度为25±2℃、湿度为80±2％、光质为白光、光周期为12h/d和光照强度为3000Lux的条件下培养，每4天喷施无菌水一次，培养2个月后，匀浆组织再生形成配子体，配子体增殖，进一步分化形成孢子体，最后生成孢子体丛生芽，即D品；
土壤基质1为：红壤：腐殖土：泥炭土＝2.5:1.5:1.5；
(7)桫椤孢子体丛生芽移栽：将生成孢子体丛生芽分株移栽在土壤基质2，在温度为25±2℃、湿度为80±2％、光质为白光、光周期为12h/d和光照强度为3000Lux的条件下培养1个月后，移栽到大棚进行常态化管理；
土壤基质1为：红壤：腐殖土：泥炭土＝2.5:1.5:1.5。
实施例4：
(1)桫椤孢子消毒处理：取成熟的桫椤孢子用10cm×10cm的滤纸完全包裹在蒸馏水浸泡13h，用灭菌后的烧杯在超净工作台上用40mL的75％酒精完全浸泡滤纸35s，无菌水清洗滤纸4次；再用60mL的5％NaClO溶液完全浸泡滤纸3min后，无菌水清洗10次，最后打开滤纸，加入25mL无菌水制成无菌孢子悬浮液；
(2)配制萌发初代培养基：1/8MS+6-BA(0.5mg/L)+NAA(0.1mg/L)+蔗糖20g/L+琼脂10g/L，1/8MS的配比为大量元素:铁盐:微量元素:有机物＝0.125:1:1:1，使用1mol/LNaoH和1mol/LHCl调pH值至5.8；
(3)萌发初代培养：将无菌孢子悬浮液接种于萌发初代培养基上，在温度为25±2℃、湿度为80±2％、光质为白光、光周期为12h/d和光照强度为3000Lux的条件下培养2个月，得到蝶形原叶体；
(4)配制原叶体续代培养基：MS+蔗糖20g/L+琼脂6g/L，使用1mol/LNaoH和1mol/LHCl调pH值至5.8；
(5)原叶体续代培养：将蝶形原叶体接种在原叶体续代培养基中增殖为原叶体团，在温度为25±2℃、湿度为80±2％、光质为白光、光周期为12h/d和光照强度为3000Lux的条件下培养1个月，得到原叶体团；
(6)配子体不完全培养：将原叶体团放入小型电动搅碎机里，以1000r/min的搅拌速率搅拌25s，搅碎成匀浆组织，与无菌水混合直接接种在土壤基质1上，在温度为25±2℃、湿度为80±2％、光质为白光、光周期为12h/d和光照强度为3000Lux的条件下培养，每4天喷施无菌水一次，培养2个月后，匀浆组织再生形成配子体，配子体增殖，进一步分化形成孢子体，最后生成孢子体丛生芽；
土壤基质1为：红壤：腐殖土：泥炭土＝1.5:0.5:1；
(5)桫椤孢子体丛生芽移栽：将生成孢子体丛生芽分株移栽在土壤基质2，在温度为25±2℃、湿度为80±2％、光质为白光、光周期为12h/d和光照强度为3000Lux的条件下培养1个月后，移栽到大棚进行常态化管理；
土壤基质1为：红壤：腐殖土：泥炭土＝1:1.5:1。
实施例5：
(1)桫椤孢子消毒处理：取成熟的桫椤孢子用10cm×10cm的滤纸完全包裹在蒸馏水浸泡14h，用灭菌后的烧杯在超净工作台上用50mL的75％酒精完全浸泡滤纸35s，无菌水清洗滤纸3次；再用45mL的5％NaClO溶液完全浸泡滤纸4min后，无菌水清洗11次，最后打开滤纸，加入25mL无菌水制成无菌孢子悬浮液；
(2)配制萌发初代培养基：1/8MS+6-BA(0.5mg/L)+NAA(0.1mg/L)+蔗糖20g/L+琼脂10g/L，1/8MS的配比为大量元素:铁盐:微量元素:有机物＝0.125:1:1:1，使用1mol/LNaoH和1mol/LHCl调pH值至5.8；
(3)萌发初代培养：将无菌孢子悬浮液接种于萌发初代培养基上，在温度为25±2℃、湿度为80±2％、光质为白光、光周期为12h/d和光照强度为3000Lux的条件下培养2个月，得到蝶形原叶体；
(4)配制原叶体续代培养基：MS+蔗糖20g/L+琼脂6g/L，使用1mol/LNaoH和1mol/LHCl调pH值至5.8；
(5)原叶体续代培养：将蝶形原叶体接种在原叶体续代培养基中增殖为原叶体团，在温度为25±2℃、湿度为80±2％、光质为白光、光周期为12h/d和光照强度为3000Lux的条件下培养1个月，得到原叶体团；
(6)配子体不完全培养：将原叶体团放入小型电动搅碎机里，以1000r/min的搅拌速率搅拌30s，搅碎成匀浆组织，与无菌水混合直接接种在土壤基质1上，在温度为25±2℃、湿度为80±2％、光质为白光、光周期为12h/d和光照强度为3000Lux的条件下培养，每3天喷施无菌水一次，培养2个月后，匀浆组织再生形成配子体，配子体增殖，进一步分化形成孢子体，最后生成孢子体丛生芽；
土壤基质1为：红壤：腐殖土：泥炭土＝2:1.5:0.5；
(5)桫椤孢子体丛生芽移栽：将生成孢子体丛生芽分株移栽在土壤基质2，在温度为25±2℃、湿度为80±2％、光质为白光、光周期为12h/d和光照强度为3000Lux的条件下培养1个月后，移栽到大棚进行常态化管理；
所述土壤基质1为：红壤：腐殖土：泥炭土＝1.5:1:1.5。
发明人为验证本发明的效果进行了以下实验：
1.1试药试剂
(1)培养基：MS、1/8MS。
大量元素：硝酸铵(NH4NO3)、硝酸钾(KNO3)、氯化钙(CaCl2·2H2O)、硫酸镁(MgSO4·7H2O)、磷酸二氢钾(KH2PO4)。
铁盐：硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)、乙二胺四乙酸二钠(Na2-EDTA·2H2O)；
微量元素：由碘化钾(KI)、硼酸(H3BO3)、硫酸锰(MnSO4·4H2O)、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、硫酸铜(CuSO4·5H2O)、氯化钴(CoCl2·6H2O。
有机物：肌醇、VB5烟酸、盐酸吡哆醇(维生素VB6)、盐酸硫胺素(维生素VB1)、甘氨酸。
(2)植物激素：
6-苄氨基嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、。
(3)药品：氢氧化钠(NaOH)、盐酸(HCl)、蔗糖、琼脂等。
1.2仪器
苏州净化超净工作台、上海博讯立式高压蒸汽灭菌锅、雷磁PHS-3C台式酸度计、艾德姆衡器分析天平、4℃冰箱、小型电动搅碎机、移液枪等仪器。
1.3培养基的配置
1/8MS培养基的配置：由0.125份大量元素、1份铁盐、1份微量元素和1份有机物制成。按MS培养基中要求，大量元素母液使用无菌水配制成1650mg/L硝酸铵+1900mg/L硝酸钾+440mg/L氯化钙+370mg/L硫酸镁+170mg/L磷酸二氢钾的母液。铁盐使用无菌水配制成28.7mg/L硫酸亚铁+37.25mg/L乙二胺四乙酸二钠的母液。微量元素使用无菌水配制成0.83mg/L碘化钾+6.2mg/L硼酸+22.3mg/L硫酸锰+8.6mg/L硫酸锌+0.25mg/L钼酸钠+0.025mg/L硫酸铜+0.025mg/L氯化钴的母液。有机物使用无菌水配制成100mg/L肌醇+0.5mg/L烟酸+0.5mg/L盐酸吡哆醇+0.1mg/L盐酸硫胺素+2mg/L甘氨酸的母液。
MS培养基的制备方法为常规方法即按培养基配方所述各组分及其含量混匀后pH计(雷磁PHS-3C)测定溶液pH值，使用1mol/L NaoH和1mol/L HCl调至5.8，倒入240ml组培瓶中(每瓶约35mL)。
1.4不完全组织培养过程
(1)桫椤孢子萌发初代培养
成熟的桫椤孢子用10cm×10cm的滤纸完全包裹在蒸馏水浸泡12，用灭菌后的烧杯在超净工作台上用40mL-50mL的75％酒精完全浸泡滤纸30s，无菌水清洗滤纸3次；再用40mL-50mL的5％NaClO溶液完全浸泡滤纸4min后无菌水清洗10次。最后打开滤纸，加入20-30mL无菌水制成无菌孢子悬浮液。用灭菌后的移液枪头吹打混匀无菌孢子悬浮液后吸取400μL接种在表1的培养基上，每组接2皿，每皿400μL，重复3次。培养条件为：温度：25±2℃，湿度：80±2％，光质：白光，光周期：12h/d，光照强度为3000Lux。每10天观察一次，30后记录孢子萌发率。在OLYMPUS SZ61解剖镜下任取10个视野记录观察孢子萌发。
(2)原叶体续代培养
将步骤(1)中萌发的原叶体接种在初代培养基：MS+蔗糖20g/L+琼脂6g/L，pH为5.80中增殖为原叶体团。每瓶接种4，接种20瓶，重复3次。培养条件与(1)相同，培养时间1个月。
(3)配子体不完全培养
将步骤(2)的原叶体团，在超净工作台上用小型电动搅碎机里1000r/min，30s搅碎成匀浆组织，接种在无菌水浸润的灭菌后土壤基质上(表2)，培养条件与(1)相同，每组接3皿，每皿20个匀浆组织团，重复3次。每3天浇水一次，培养时间2个月。记录匀浆组织的再生情况，配子体出现时间、增殖率，孢子体出现时间，配子体分化时间、丛生芽的茎叶数、茎叶长、根数、根长。
(4)桫椤孢子体丛生芽移栽
将步骤(3)的丛生芽分株移栽在土壤基质，红壤：腐殖土：泥炭土(1：1：1)。培养条件与(1)相同，培养2个月后移栽到大棚进行常态化管理。
(5)数据统计和分析
Excel 2021统计数据，SPSS分析数据。数据以平均值±标准误差表示，采用单因素检验进行方差分析，显著性水平P<0.05。
孢子萌发率＝(视野里萌发的孢子数/视野里总的孢子数)×100％。
配子体增殖率＝(增殖的配子数/接种的匀浆组织)×100％。
配子体分化率＝(分化的配子体数/总配子体数)×100％。
1.5孢子萌发初代培养试验：
表1不同浓度组合对桫椤孢子萌发的影响
将桫椤的无菌悬浮液接种在L1-L12的培养基上，以不添加激素为空白对照。以观察到培养基表面有绿色小点即孢子开始萌发，萌发情况(表1)，结果分析：不同植物激素组合及浓度对孢子萌发率、萌发时间差异显著(P＜0.05)(表1)。同一NAA浓度下，孢子萌发随6-BA浓度升高逐渐下降，萌发时间延长；同一6-BA浓度下，孢子萌发率随NAA浓度整体上呈先升高后降低的趋势，在高浓度6-BA中萌发时间延长，然而，在L2中萌发率最高(64.6％)，萌发时间最少(23d)，均与CK差异显著(P＜0.05)。故1/8MS+6-BA(0.5mg/L)+NAA(0.1mg/L)+蔗糖20g/L+琼脂10g/L是桫椤孢子萌发初代培养最适的组合。
1.6原叶体续代培养试验
萌发的桫椤原叶体在MS+蔗糖20g/L+琼脂6g/L培养基中增殖为原叶体团。
1.7配子体不完全培养实验
表2不同土壤基质对桫椤匀浆组织再生成配子体的影响
将匀浆组织接种在C1-C9的土壤基质上，以红壤为空白对照。以观察到完整的绿色原叶体，表示配子体开始增殖。生长出无拳卷的叶、叶脉呈二叉状分枝表示配子体开始分化。通过结果分析表明：不同的土壤基质及不同的配比下桫椤匀浆组织再生成配子体时间、孢子体时间有显著差异(P＜0.05)(表2)；配子体增殖率没有显著差异(P＞0.05)，配子体分化率有显著差异(P＜0.05)。其中包含红壤基质，配子体的再生时间较短，孢子体也首先出现；增殖率、分化率也高。而土壤基质为红壤：腐殖土：泥炭土(2：1：1)是桫椤匀浆组织再生构建最适的条件，配子体增殖率、分化率都为最高。
表3不同土壤基质对桫椤孢子体丛生芽的生长情况的影响
匀浆组织的再生构建中，随着配子体的不断分化，孢子体的增加会形成丛生芽，丛生芽可以在土壤基质里直接生根。结果分析表明：
不同土壤基质及不同比例生长的丛生芽的分化茎叶数、株高、生根数、根长均有显著差异(P＜0.05)(表3)。其中当红壤：腐殖土：泥炭土(2：1：1)是桫椤丛生芽生长状况最好的土壤基质，丛生芽的茎叶数、株高、根数、根长都为最佳。
1.8桫椤孢子体丛生芽移栽
将生根后的丛生芽分株移栽到红壤：腐殖土：泥炭土(1：1：1)中，成活率为98.89％，2个月后移栽到到大棚进行常态化管理。
2结论
本发明公开一种快速诱导桫椤丛生芽的不完全组织培养方法。该方法包括桫椤孢子萌发初代培养、原叶体续代培养、丛生芽生成培养、桫椤丛生芽移栽。桫椤孢子在1/8MS+6-BA(0.5mg/L)+NAA(0.1mg/L)+蔗糖20g/L+琼脂10g/L成功萌发。原叶体续代培养在MS+蔗糖20g/L+琼脂6g/L培养基中增殖为原叶体团制成匀浆组织，继续在红壤：腐殖土：泥炭土(2：1：1)基质上进行了配子体的再生构建，配子体的增殖率为100％、分化率为100％形成孢子体，最后生成桫椤孢子体丛生芽。孢子体丛生芽在红壤：腐殖土：泥炭土(1：1：1)成活率98.89％后移栽至大棚常态化管理。桫椤的配子体不完全组织培养，缩短了繁殖体系构建的时间，短时间能够获得大量幼苗，提供了一个合适的体外生长条件，可进行规模化生产桫椤。
Claims (1)
1.一种快速诱导桫椤丛生芽的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
（1）桫椤孢子消毒处理：取成熟的桫椤孢子用10cm×10cm的滤纸完全包裹在蒸馏水浸泡12h，用灭菌后的烧杯在超净工作台上用40mL~50mL的75%酒精完全浸泡滤纸30s，无菌水清洗滤纸3次；再用40mL~50mL的5% NaClO溶液完全浸泡滤纸4min后，无菌水清洗10次，最后打开滤纸，加入20~30mL无菌水制成无菌孢子悬浮液，即得A品；
（2）萌发初代培养：将A品接种于萌发初代培养基上，培养时间为2个月，得到蝶形原叶体，即B品；
培养条件为：温度为25±2℃，湿度为80±2%，光质为白光，光周期为12h/d，光照强度为3000Lux；
所述桫椤孢子萌发初代培养基为：1/8MS+0.5mg/L的6-BA+0.1mg/L的NAA+20g/L蔗糖+10g/L琼脂，使用1mol/L的NaOH和1mol/L的HCl调pH值至5.8;
所述1/8MS的配比为大量元素:铁盐:微量元素:有机物=0.125:1:1:1;
（3）原叶体续代培养：将B品接种在原叶体续代培养基中增殖为原叶体团，培养1个月，得到原叶体团，即C品；
培养条件为：温度为25±2℃，湿度为80±2%，光质为白光，光周期为12h/d，光照强度为3000Lux；
所述原叶体续代培养基为：MS+20g/L蔗糖+6g/L琼脂，使用1mol/L的NaOH和1mol/L的HCl调pH值至5.8；
（4）配子体不完全培养：将C品放入小型电动搅碎机里，以1000r/min的搅拌速率搅拌30s，搅碎成匀浆组织，与无菌水混合直接接种在土壤基质1上，每3天喷施无菌水一次，培养2个月后，匀浆组织再生形成配子体，配子体增殖，进一步分化形成孢子体，最后生成孢子体丛生芽，即D品；
培养条件为：温度为25±2℃，湿度为80±2%，光质为白光，光周期为12h/d，光照强度为3000Lux；
所述土壤基质1为红壤:腐殖土:泥炭土=2:1:1；
（5）桫椤孢子体丛生芽移栽：将D品分株移栽在土壤基质2，培养1个月后，移栽到大棚进行常态化管理；
培养条件为：温度为25±2℃，湿度为80±2%，光质为白光，光周期为12h/d，光照强度为3000Lux；
所述土壤基质2为红壤:腐殖土:泥炭土=1:1:1。
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