KR20080017934A - 체세포배 세포 급속증식을 이용한 나리류의 자구 대량생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 나리류의 종구를 산업적으로 대량 생산하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 나리의 인편조직배양의 기법과 생물반응기(bioreactor) 배양기술을 응용하여 체세포배 세포를 급속 증식하여 단기간 동안 나리류의 종구를 대량 생산 하는 기법으로 경제성 있는 무병주 종구를 대량으로 생산할 수 있게 하는 방법에 관한 것이다.

나리, 백합, 생물반응기, 캘러스, 체세포배, 자구, 무병종구, 대량생산

Description

체세포배 세포 급속증식을 이용한 나리류의 자구 대량 생산방법 {Mass Production of bulblet via Somatic Embryogenic Cell culture in Lily}

본 발명은 나리류의 종구를 산업적으로 대량 생산하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 나리의 인편조직배양의 기법과 생물반응기(bioreactor) 배양기술을 응용하여 체세포배 세포를 급속 증식하여 단기간 동안 나리류의 종구를 대량 생산 하는 기법으로 경제성 있는 무병주 종구를 대량으로 생산할 수 있게 하는 방법에 관한 것이다.

나리류(Lilium sp.)는 인편을 통한 영양번식을 하는 식물로서, 구근은 전분 및 다른 여러 양분의 저장기관 역할을 하며 줄기가 생기는 생장점을 포함하고 있다. 한편, 구근은 식물병원균에 의해 발생되는 바이러스병에 쉽게 감염되어 수량 및 품질이 저하되므로 구근을 여러해 계속해서 사용할 수 없기 때문에 재배농가에서는 매년 새로운 구근을 구입하여 재배하고 있는 실정이다.

전세계 백합종구의 주 생산지인 네덜란드에서는 바이러스 검정을 거친 모구 의 인편을 조직배양의 방법으로 무균상태에서 대량 증식하여 토양에서 장기간의 순화와 양성구 과정을 거쳐 종구를 생산하여 전세계로 판매하고 있다. 우리나라에서도 몇 개의 연구기관에서 조직배양방법을 이용한 백합종구의 대량생산법을 연구하고는 있지만, 세균배양용 페트리 접시(petridish)나 병(bottle)을 이용하는 조직배양방법에 의존하고 있어, 산업적 생산을 위한 대량생산 시 종구생산단가에 인건비가 차지하는 비율이 높아 경제적인 종구 생산이 현실적으로 어려워 국가 보조 사업으로 일부 연구기관에서 시행중이나 농가의 수요량에 턱없이 부족한 상황이며 대부분의 농가에서는 수입에 의존하고 있다. 그리고, 현재 백합 절화생산 경비 중에서 종구비의 점유율이 68%에 이르며 수출용 백합 생산을 하는 농가에서는 품질저하 문제 때문에 대부분 수입 종구를 사용하고 있으며, 이로 인해 종구비 부담액이 증가하여 채산성이 날로 약화되고 있는 실정이다.

이에, 본 발명자들은 나리류의 종구를 산업적으로 대량 생산하는 방법을 제공하고자 예의 연구하였으며, 그 결과 기존의 인편배양을 이용한 조직배양으로의 종구생산에 한계가 있는 바 체세포배 세포 배양 기술을 이용하여 생물반응기(bioreactor) 배양에 적용하는 경우, 연속배양이 가능할 뿐만 아니라, 체세포배 세포를 배양 시 성장속도가 훨씬 빠르고, 단 기간동안 대량 증식할 수 있으며 소규모의 반응기를 이용하여 적은 시설 투자비로써 다품종 대량생산이 가능하며, 수확한 체세포배 세포는 장기간(5개월) 저장이 가능하여 생산량을 임의로 조절할 수 있으며, 체세포배 세포를 재분화 유도 시 소량의 체세포배 세포를 소수 인원의 작업으로 대량 생산이 가능하고 배양 용기 당 종구 분화수가 많아 균일한 종구 대량 생산이 가능함을 발견하고 하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 나리류의 종구생산 시 경제성 있는 대량 생산하는 방법을 제공함으로써 산업적인 종구생산을 통해 수출용 나리류의 종구 국내 자급화를 목적으로 하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 체세포배 유도를 위한 배양조건을 찾기 위하여 다양한 조건에서 조직배양을 실시하였으며, 생물반응기 배양 시 급속 증식에 적합한 배양조건을 찾기 위하여 다양한 조건에서 조직배양을 실시하였으며, 체세포배 세포의 재분화 유도조건 및 비대배양을 실시하였다. 조직배양에서와 동일 조건으로 생물반응기 배양을 실시하여 생산된 종구들이 일반 토양에 이식하여 그의 순화정도를 확인한 결과 조직배양에서와 유사한 정도의 생존율을 보임을 확인하였다.

즉, 상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 백합 나리류의 종구를 대량으로 생산하는 방법은, 인편으로부터 체세포배 세포를 유도하고 체세포 배 세포를 반응기에 멸균공기를 주입하고 반응기 바닥에 많은 공기구멍이 형성되어 있는 생물반응기를 이용하여 급속 증식하고 체세포배를 재분화 배지에 치상하여 재분화를 유 도하고 비대용 배지를 넣어줌으로써 단기간에 무병 종구를 대량 생산하는 것을 특징으로 하며, (1) 무라시게-스툭배지(Murashige Skoog 배지, 이하 MS배지라 한다)에 4-아미노-3,5,6-트리클로로피콜리닉산(4-Amino-3,5,6-Trichloropicolinic acid, 이하 PICLORAM이라 한다.) 또는 3,6-디클로로-오-아니식산(3,6-Dichloro-O-Anisic acid, 이하 DICAMBA라 한다.)를 첨가한 고체배지에서, pH 5.6~5.8, 온도 25℃, 암상태의 조건에서 배양하여 인편에서 체세포배 세포를 유도하는 단계;

(2) 상기 동일한 액체 배지에서 생물반응기를 이용한 체세포배 세포를 급속 증식하는 단계; (3) 체세포배 세포를 호르몬이 배제된 MS고체 배지로 전량 교체하여, pH 5.6~5.8, 온도 20~25℃, 빛을 차단한 암상태의 조건에서 배양하여 자구의 재분화 유도하는 단계; 및

(4) 자구의 비대를 위하여 MS 배지의 염농도를 반으로 줄인 액체 배지를 첨가하여 자구의 비대를 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 1단계 배양은 배양초기에 인편에서 재분화가 잘되는 체세포배 세포를 유도하기 위한 것으로, 배지에 생장조절 호르몬인 오옥신계의 PICLORAM 또는 DICAMBA를 첨가한 배지에서 배양한다. 호르몬의 첨가량은 PICLORAM 1.0~6.0㎎/ℓ 및 DIACMBA 1.0~6.0㎎/ℓ의 범위로 하는 것이 적당하며, 바람직하게는 PICLORAM 3.0㎎/ℓ 및 DICAMBA 3.0㎎/ℓ을 첨가하는 것이 좋다. 2단계 배양은 1단계에서 유도 된 체세포배 세포를 동일한 배양기내에서 균일한 상태의 세포를 단기간에 대량 급속 증식하여, 재분화시 유도 시 균일한 상태의 소자구를 생산하기 위한 것으로 호르몬의 량을 절반이하로 첨가된 MS배지만으로 배양을 실시한다. 또한, 생물반응기 배양은 PICLORAM 1.0㎎/ℓ 및 DICAMBA 1.0㎎/ℓ을 첨가한 배지에서 1주 간격으로 계대배양하는 것이 체세포배 세포의 급속 증식에 가장 양호한 결과를 얻을 수 있으며, 이는 후술하는 실시예에서 확인할 수 있다. 3단계 배양은 2단계에서 급속 증식된 체세포배 세포를 잘게 썰어 생장호르몬이 배제되고 6%의 설탕과 0.5%의 배지고형제(GELITE, Duchefa Co.)를 첨가한 MS고체배지에 치상하여 자구 재분화를 유도하는 것이다. 배양용기는 4단계 배양에서 자구 비대용 배지를 넣어 줄 수 있는 구멍을 뚫고 재분화된 자구의 호흡을 위해 통기성 있는 테이프로 밀봉한 용기를 이용함으로써 기내 자구의 원활한 발달을 돕는 역할을 하며, 한번 재분화 된 자구는 계대배양을 통하지 않고 동일한 배양용기에서 자구 비대배양을 동시에 수행함으로써 계대배양에 따른 번거로운 작업을 피할 수 있게 한다.

4단계 배양은 3단계에서 재분화 된 소자구를 비대 배양하는 것으로써 기존 재분화 배지에서 자구 비대용 배지로 추가적인 계대배양을 하지 않고 배양용기의 환기구멍을 통해 자구 비대용 배지를 첨가함으로써 자구 비대용 배지로의 계대배양에 따른 비 효율적인 배양시간을 단축함으로써 작업 효율을 높일 수 있다.

이러한 4단계의 체세포배 세포를 이용한 자구의 급속 대량 생산 배양을 통해 소수의 인원으로 많은 양의 종구를 생산할 수 있는 생산체계가 완성됨으로써 기존 의 대량생산시스템에 비하여 시설비투자에 부담을 줄이고 효율적인 배양 시스템을 구축함으로써 경제적으로 균일한 품질의 종구를 산업적으로 대량 공급할 수 있으며, 생성된 종구는 토양에서의 정밀 양구를 통하여 농가의 수요에 맞춘 다품종 대량생산에 적합하다고 할 수 있다. 이하, 여러 실시예를 통하여 체세포배 세포 급속 증식을 이용한 나리류 자구 대량 생산은 체세포배 세포 유도배양에 적합한 배양조건을 찾기 위하여 다양한 조건에서의 조직배양, 이를 이용한 생물반응기 배양 시 급속 증식조건, 재분화 조건 및 효율적인 기내 자구의 비대 배양 시스템을 찾기 위한 다양한 조건에서의 조직배양에 대하여 구체적으로 설명한다. 그러나 본 발명이 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 이러한 2단계의 생물반응기 배양을 통하여 체세포배 발생 세포의 성장속도가 훨씬 빠르고, 급속 증식된 많은 체세포 배발생 세포는 자구 형성용 재분화 배지에 치상함으로써

균일한 우량종구를 대량생산함으로써 단기간에 자구를 대량으로 공급할 수 있으며, 신품종 나리의 조기 대량공급을 실시 할 수 있으며,

배양용기당 자구 형성을 최대한 으로 를 양의 종구를 동일 배양기에서 동일한 조건으로 배양할 수 있기 때문에 균일한 품질의 종구를 대량으로 공급할 수 있으며, 생성된 종구는 토양에서의 양성기간을 최대한 단축시킴으로써 실질적으로 개화촉진과 생산비 절감효과를 기대할 수 있다. 또한, 반응기의 크기를 조절함으로써 생산량을 임의로 조절할 수 있으며, 연속배양이 가능하여 산업적 생산을 위한 대량 생산에 보다 적합하다고 할 수 있다.

Claims (1)

1. 백합 나리류의 종구의 대량 생산방법에 있어서, 반응기 중간에 교반기(impeller)가 장착되어 있으며, 멸균공기를 주입할 수 있도록 반응기 바닥에 많은 공기구멍이 형성되어 있는 생물반응기를 이용하며, (1) 무라시게-스툭배지(Murashige Skoog 배지, 이하 MS배지라 한다)에 4-아미노-3,5,6-트리클로로피콜리닉산(4-Amino-3,5,6-Trichloropicolinic acid, 이하 PICLORAM이라 한다.) 또는 3,6-디클로로-오-아니식산(3,6-Dichloro-O-Anisic acid, 이하 DICAMBA라 한다.)를 첨가한 고체배지에서, pH 5.6~5.8, 온도 25℃, 암상태의 조건에서 배양하여 인편에서 체세포배 세포를 유도하는 단계 ; 및 (2) 배지를 호르몬이 배제된 MS배지로 전량 교체하여, pH 5.6~5.8, 온도 20~25℃, 빛을 차단한 암상태의 조건에서 배양하여 자구의 비대를 유도하는 단계 를 포함하는 것을 특징으로 하는 백합 나리류의 종구의 대량 생산방법.

   청구항2

   제 1항에 있어서, 1단계 배양 배지에서, PICLORAM는 0.1~10㎎/ℓ의 양으로, DICAMBA는 0.1~10㎎/ℓ의 양으로 첨가되는 것을 특징으로 하는 백합 나리류의 체세포배 종구의 대량 생산방법.

   청구항3

   제 2항에 있어서, 1단계 배양 배지에서, NAA는 0.3㎎/ℓ, BA는 1.0㎎/ℓ 첨가되는 것을 특징으로 하는 백합 나리류의 종구의 대량 생산방법.

   청구항4

   제 1항에 있어서, 1단계 및 2단계 배양은 용존산소농도 40ppm, 교반기의 회전속도 100rpm의 조건에서 실시하는 것을 특징으로 하는 백합 나리류의 종구의 대량 생산방법.