KR102547722B1 - 포도 캘러스 배양액을 유효 성분으로 함유하는 피부 개선용 조성물 - Google Patents
포도 캘러스 배양액을 유효 성분으로 함유하는 피부 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
포도 캘러스 배양액을 유효 성분으로 함유하는 피부 개선용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 포도 캘러스 배양액은 우수한 피부 미백, 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 피부 재생, 피부 탄력 증진, 피부 보습, 자외선 차단, 자외선 또는 활성산소로 인한 피부 손상의 완화, 개선, 예방 또는 치료, 아토피 피부염의 개선, 예방 또는 치료, 발모 촉진 및 탈모 방지에 효과를 가지므로, 상기 포도 캘러스 배양액은 피부 개선용 조성물의 유효 성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 포도 캘러스 배양액을 유효 성분으로 함유하는 피부 개선용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 피부 미백, 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 피부 재생, 피부 탄력 증진, 피부 보습, 자외선 차단, 자외선 또는 활성산소로 인한 피부 손상의 완화, 개선, 예방 또는 치료, 아토피 피부염의 개선, 예방 또는 치료, 발모 촉진 및 탈모 방지에 효과를 나타내는 포도 캘러스 배양액을 유효 성분으로 함유하는 피부 개선용 조성물에 관한 것이다.
피부는 인체 표면을 감싸고 있는 가장 큰 조직으로 외부와 직접 접하고 있어서 온도, 습도, 세균, 공해물질, 자외선과 같은 자극으로부터 인체를 보호하는 역할을 한다. 그러나 나이가 들면서 피부를 구성하는 세포들이 손상되거나 기능을 상실하게 된다. 이러한 피부노화는 유전적, 환경적 요인 등에 기인한다. 내인성 노화(intrinsic aging)는 자연노화로써 유전정보에 따라 시간이 지나면서 일어나는 노화현상이며, 외인성 노화(extrinsic aging)는 외부환경 요인에 의해 일어나는 노화 현상을 말한다. 노화가 진행됨에 따라 진피층의 주요성분인 콜라겐(collagen)이 분해되고, 섬유아세포의 기능도 저하됨에 따라 피부는 점점 탄력을 잃고 주름이 증가한다. 또 강한 자외선, 스트레스, 호르몬의 불균형으로 멜라닌(melanin) 합성이 증가 되어서 기미와 같은 색소침착이 발생한다. 이러한 노화를 억제하고 피부상태를 개선하기 위하여, 기능성 화장료 개발에 관한 다양한 연구가 진행되고 있다.
식물은 과거 식량 자원의 의미였으나, 현재에는 약제, 향료, 색소, 농약, 염료 등을 포함한 광범위한 화학 물질의 공급원으로서 그 의미가 확대되고 있다. 특히, 식물 유래 유용 물질의 대부분은 항바이러스, 항박테리아, 항암, 항산화 능력 등의 생리 활성이 있어, 신규 효능 물질로서 발전 가능한 이상적인 자원으로 주목 받고 있으며, 식물을 유래로 하기 때문에 효능이 있으면서도 인체에 친화적이라는 장점 또한 가지고 있다.
그러나 식물은 성장속도가 매우 느리고, 식물 내 유용물질은 식물의 특정 기관 내에만 소량 존재하거나 품종에 따라 이차 대사물질들의 종류 및 함량이 달라지며, 같은 종 내에서도 계절, 장소, 지리적 기후, 재배조건, 식물체의 부위 등에 따라 생산성이 달라진다. 또한, 최근 급속한 산업화로 인한 생태계 오염 및 파괴로 인한 식물자원이 고갈되고 있는 실정이다.
이에 따라 식물 유래 다양한 유용 물질(예, 이차 대사산물)을 생물 공학적인 방법으로 생산하려는 많은 연구가 시도되었다. 그 중의 가장 효과적인 생산법이 식물세포 배양법이다. 이 방법은 배양배지와 배양환경 및 다양한 유도인자(elicitor) 처리 등을 통해 효과적으로 이차 대사산물을 생산할 수 있다. 또한, 재배 또는 자연 환경의 제약(고/맹독성 농약, 중금속 오염, 계절적 지배, 기후 조건 등)을 받지 않고도 식물 유래 유용 물질을 연속적으로 그리고 안정적으로 대량생산하는 것이 가능하므로 상업적으로 중요하다고 할 수 있다.
이에 본 발명자들은 식물 유래 유용 물질을 대량으로 생산하는 방법을 구축하고, 이를 이용한 기능성 화장료, 건강기능식품 및 약학적 소재를 개발하기 위해 노력한 결과, 본 발명의 포도 캘러스 배양액을 피부 개선용 조성물의 유효 성분으로 유용하게 사용할 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 포도 캘러스, 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액 또는 캘러스 추출물을 유효 성분으로 함유하는 피부 개선용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 포도 캘러스, 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액 및 캘러스 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효 성분으로 함유하는, 피부 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 포도 캘러스, 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액 및 캘러스 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효 성분으로 함유하는, 피부 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 포도 캘러스, 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액 및 캘러스 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효 성분으로 함유하는, 피부 개선용 약학적 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 포도 조직으로부터 캘러스를 유도하는 단계;
2) 상기 유도된 포도 캘러스를 활성유도제 및 가용화제를 첨가하여 배양하는 단계; 및
3) 상기 배양한 포도 캘러스, 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액 및 캘러스 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 함유하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하는,
포도 캘러스, 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액 및 캘러스 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 함유하는 피부 개선용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 포도 캘러스 배양액은 우수한 피부 미백, 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 피부 재생, 피부 탄력 증진, 피부 보습, 자외선 차단, 자외선 또는 활성산소로 인한 피부 손상의 완화, 개선, 예방 또는 치료, 아토피 피부염의 개선, 예방 또는 치료, 발모 촉진 및 탈모 방지에 효과를 가지므로, 상기 포도 캘러스 배양액은 피부 개선용 조성물의 유효 성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 포도 캘러스 배양액의 버섯 티로시나아제(Tyrosinase) 효소 활성 억제 효과를 확인한 도이다.
도 2는 양성대조군인 Kojic acid 및 Ascorbic acid의 티로시나아제 효소 활성 억제 효과를 확인한 도이다.
도 3은 포도 캘러스 배양액의 세포독성 및 멜라닌 생성 저해량을 확인한 도이다.
도 2는 양성대조군인 Kojic acid 및 Ascorbic acid의 티로시나아제 효소 활성 억제 효과를 확인한 도이다.
도 3은 포도 캘러스 배양액의 세포독성 및 멜라닌 생성 저해량을 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 포도 캘러스, 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액 및 캘러스 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효 성분으로 함유하는, 피부 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 캘러스는 정상적인 기관형성이나 조직분화를 일으키는 능력을 잃은 무정형의 조직 또는 세포 덩어리로서 대부분 유세포로 되어 있으며, 식물체에서 잘라낸 조직을 생장조절제를 함유한 조직배양용 배지에서 배양하거나, 식물체에 상처를 내거나 또는 식물체의 상구에 생장조절제를 처리하였을 때 생기는 특수한 조직 또는 세포덩어리를 말한다.
본 발명에서, 상기 파쇄물은 세포를 일반적인 detergent 등을 이용하여 화학적인 방법 또는 프렌치 프레스(French Press) 등을 이용한 물리적인 방법 등으로 파쇄하여 얻은 세포 용해물을 의미하고, 그 방법은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 그 방법은 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 배양액은 당업계에 공지된 통상적인 방법으로 세포를 배양하는 과정을 거친 후 원심분리(centrifugation), 거름망 여과 등의 물리적인 방법을 이용하여 펠렛을 제거한 나머지 배양액(컨디션드 배지)을 의미하고, 그 방법은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 그 방법은 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 추출물은 캘러스 자체 또는 캘러스 분말, 캘러스 파쇄물, 또는 캘러스 배양액을 당업계에 알려진 통상의 방법에 의하여 추출한 것을 의미하고, 그 방법은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 그 방법은 특별히 제한되지 않는다. 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 열수 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다. 추출 용매로는 일반적으로 사용될 수 있는 용매를 사용할 수 있으며, 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3-부틸렌 글리콜 등을 사용할 수 있다.
본 발명에서, 상기 피부 개선은 피부 상태의 모든 형태의 호전 및 양호화를 의미하며, 바람직하게는 피부 미백, 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 피부 재생, 피부 탄력 증진, 피부 보습, 자외선 차단, 자외선 또는 활성산소로 인한 피부 손상의 완화, 개선, 예방 또는 치료, 아토피 피부염의 개선, 예방 또는 치료, 발모 촉진 또는 탈모 방지를 의미한다.
본 발명에서, 상기 포도 캘러스는 포도의 꽃, 잎, 줄기, 가지, 열매 및 뿌리로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 부위로부터 유도된 캘러스일 수 있고, 보다 구체적으로 포도의 꽃을 절취하여 유도된 캘러스일 수 있다.
상기 포도의 품종은 청수, 홍단, 탐나라, 홍이슬, 흑구슬, 흑보석, 수옥, 두누리, 탐금추, 홍아람, 나르샤, 홍소담, 알덴 (Alden), 캠벨얼리(Campbell Early), 델라웨어(Delaware), 더체스(Ductchess), 골든머스캇(Golden Muscat), 힘로드 시드레스 (Himrod Seedless), 쉴러(Schuyler), 홍이두(Beniizu), 거봉 (Kyoho), 피오네(Pione), 슈퍼함부르그(Super Hamburg), 타노레드(Tano Red), 머스캇함부르그 (Muscat Hamburg) 및 시벨 9110 (Seibel 9110)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 캘러스의 유도는 당업계에 공지된 통상의 방법을 통해 수행될 수 있다. 보다 구체적으로 캘러스의 유도는 식물체의 조직 또는 이의 절편체를 조직배양용 배지에서 배양하여 이루어진다. 상기 조직배양용 배지로는 MS(Murashige and Skoog, 1962) 배지, N6(Chu et al., 1975), B5(Gamborg et al., 1968), NN(Nitsch and Nitsch, 1967) 배지, WHITE 배지 등 다양한 식물의 기본 배지를 사용할 수 있다. 또한, 상기 조직배양용 배지는 식물 생장조절제가 첨가된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 식물 생장조절제는 당업계에 공지된 물질을 이용할 수 있으나, 바람직하게는 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 2,4,5-T(2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid), Dicamba(2-methoxy-3,6-dichlorobenzoic acid), IAA(indole-3-acetic acid),IBA(indole-3-butyric acid), MCPA(2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid), NAA(1-naphthylacetic acid), NOA(2-naphthyloxyacetic acid), Picloram(4-amino-2,5,6-trichloropicolinic acid) 등의 옥신(Auxin)류; BAP(6-benzylaminopurine), 2iP(N6-(2-isopentyl)adenine), Kinetin(6-furfurylaminopurine), Thidiazuron(1-phenyl-3-(1,2,3-thiadiazol-5-yl)urea), Zeatin(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenylaminopurine) 등의 사이토키닌(Cytokinin)류 및 이의 유도체를 포함할 수 있다. 이외에도 조직배양용 배지에는 세포의 분화 및 증식에 작용하는 알카로이드류, 테르페노이드류, 카로테노이드류, 페놀류 화합물 및 천연 추출물 등을 추가로 첨가할 수 있다. 보다 바람직하게는 IAA, NAA, 2,4-D 및 키네틴을 첨가할 수 있고, 보다 더 바람직하게는 0.05~0.2 mg/L IAA, 0.05~0.2 mg/L NAA, 1~2 mg/L 2,4-D 및 0.2~0.3 mg/L 키네틴을 첨가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 캘러스는 활성유도제 및 가용화제를 첨가한 배지에서 배양할 수 있다. 상기 활성유도제는 메틸 자스몬산(methyl jasmonate), SA(salicylic acid) 또는 플라젤린 22(Flg22)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 메틸 자스몬산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 가용화제는 스테비오사이드(stevioside)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 메틸 자스몬산 및 스테비오사이드는 바람직하게는 각각 50~350 μM 및 40~60 mM의 농도로 첨가할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 각각 100 μM 및 50 mM의 농도로 첨가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 상기 조성물은 유효 성분인 포도 캘러스, 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액 또는 캘러스 추출물을 전체 조성물의 중량을 기준으로 0.00005 내지 25.0 중량%, 바람직하게는 0.0001 내지 15.0 중량%, 보다 바람직하게는 0.001 내지 10 중량%로 포함할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 포도 캘러스 배양액의 미백활성을 확인하기 위하여 버섯 티로시나아제(Tyrosinase) 효소 활성 억제 효과를 확인한 결과, 본 발명의 포도 캘러스 배양액은 포도 캘러스 배양액 추출물 및 델타-비니페린 고함유군(시료 C) 뿐만 아니라 양성대조군인 Kojic acid 또는 Ascorbic acid 보다 현저한 티로시나아제 효소활성을 나타냄을 확인하였다(도 1, 도 2 및 표 1 참조).
또한, 본 발명자들은 포도 캘러스 배양액의 세포 독성 및 멜라닌 생성 억제효과를 확인한 결과, 세포 독성이 없는 농도에서 포도 캘러스 배양액은 현저한 멜라닌 생성 억제효과를 갖는 것을 확인하였다(도 3 참조).
결론적으로, 본 발명의 포도 캘러스 배양액은 우수한 피부 미백, 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 피부 재생, 피부 탄력 증진, 피부 보습, 자외선 차단, 자외선 또는 활성산소로 인한 피부손 상의 완화, 개선, 예방 또는 치료, 아토피 피부염의 개선, 예방 또는 치료, 발모 촉진 및 탈모 방지에 효과를 가지므로, 상기 포도 캘러스 배양액은 피부 개선용 조성물의 유효 성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 유효 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예컨대, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 항료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림 등의 제형으로 제조될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 포도 캘러스, 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액 및 캘러스 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효 성분으로 함유하는, 피부 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 포도 캘러스, 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액 및 캘러스 추출물, 피부개선에 대해서는 상기 화장료 조성물에 대한 설명과 동일한 바, 구체적인 설명은 상기 내용을 원용하고, 이하에서는 건강기능식품 조성물에 특유한 구성에 대해서만 설명하도록 한다.
본 발명에 따른 건강기능식품 조성물은 유효 성분 이외에 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 다이사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제[타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)]를 사용할 수 있다.
유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강 식품 중의 상기 유효 성분의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량으로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효 성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물이 건강 음료 조성물로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효 성분 이외에 구연산, 액상 과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
또한, 상기 식품 조성물은 상술한 성분 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스, 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 포도 캘러스, 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액 및 캘러스 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효 성분으로 함유하는, 피부개선용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 포도 캘러스, 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액 및 캘러스 추출물, 피부개선에 대해서는 상기 화장료 조성물에 대한 설명과 동일한바, 구체적인 설명은 상기 내용을 원용하고, 이하에서는 약학적 조성물에 특유한 구성에 대해서만 설명하도록 한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효 성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물(예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름(예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 이때, 비경구 경로로는 경피 투여가 바람직하며, 그 중에서도 도포에 의한 국부 투여(topical application)가 가장 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 경구 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg(체중) 범위 내이다. 또한 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1.0 내지 3.0 ㎖의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속할 수 있다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위로 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
아울러, 본 발명은
1) 포도 조직으로부터 캘러스를 유도하는 단계;
2) 상기 유도된 포도 캘러스를 활성유도제 및 가용화제를 첨가하여 배양하는 단계; 및
3) 상기 배양한 포도 캘러스, 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액 및 캘러스 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 함유하는 조성물을 제조하는 단계를 포함하는,
포도 캘러스, 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액 및 캘러스 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 함유하는 피부 개선용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 1)에서 캘러스는 포도 조직 절편체를 캘러스 유도 배지에 치상하여 캘러스를 유도할 수 있고, 상기 캘러스 유도 배지는 생장조절제로 IAA, NAA, 2,4-D 및 키네틴이 첨가된 배지일 수 있고, 바람직하게는 0.05~0.2 mg/L IAA, 0.05~0.2 mg/L NAA, 1~2 mg/L 2,4-D 및 0.2~0.3 mg/L 키네틴이 첨가된 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 단계 2)에서 활성유도제는 메틸 자스몬산, SA 또는 플라젤린 22일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 메틸 자스몬산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 가용화제는 사이클로덱스트린, 메틸사이클로덱스트린 또는 스테비오사이드(stevioside)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 스테비오사이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 메틸 자스몬산 및 스테비오사이드는 바람직하게는 각각 50~350 μM 및 40~60 mM의 농도로 첨가할 수 있으며, 보다 바람직하게는 각각 100 μM 및 50 mM의 농도로 첨가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예, 실험예 및 제조예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 실험예 및 제조예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1> 포도
캘러스
배양액의 제조
<1-1> 포도
캘러스
유도
포도 품종으로 켐벨( Vitis vinifera L. cv Campbell Early)을 이용하여 포도 조직으로부터 캘러스를 유도한 후 증식하였다.
구체적으로, 포도의 꽃을 절취하여 흐르는 물로 세척한 다음 70% 에탄올 용액에 1분간 침지하여 표면살균을 실시하였다. 표면살균은 무균작업대 내에서 포도 꽃 조직을 유리병에 담고 상업용 락스(약 1% sodium hypochlorite) 용액으로 15분간 실시하였으며 멸균 증류수로 3회 세척하였다. 표면살균이 완료된 조직은 멸균 여과지를 이용하여 남은 습기를 제거하고 배양에 사용하였다. 표면살균이 완료된 포도의 꽃 조직을 메스를 이용하여 절취한 다음 각각의 조직(꽃잎, 꽃밥, 수술대)을 배양배지에 치상하였다. 포도 캘러스 유도에 사용된 배지는 [표 1]에 나타내었으며, 생장조절제로 0.1 mg/L IAA, 0.1 mg/L NAA, 1.5 mg/L 2,4-D 그리고 0.25 mg/L 키네틴이 첨가된 배지를 사용하였다. 배양조건은 25℃ 항온기에서 암배양을 실시하였다. 배양 후 형성된 백색의 캘러스는 동일조성의 고체배지에 약 4주 간격으로 계대배양을 실시하였다.
| (mg/L) | |
| KNO3 | 2,500 |
| (NH4)2SO4 | 134 |
| MgSO4·7H2O | 250 |
| MnSO4·1H2O | 10 |
| ZnSO4·7H2O | 2 |
| CuSO4·5H2O | 0.025 |
| NH4H2PO4 | 150 |
| NaH2PO4 | 150 |
| KCl | 300 |
| KI | 0.75 |
| CoCl2·6H2O | 0.025 |
| CaCl2·2H2O | 150 |
| H3BO3 | 3 |
| Na2MoO4·2H2O | 0.25 |
| FeSO4·7H2O | 27.85 |
| Na2-EDTA | 37.25 |
| Thiamine HCl | 10 |
| Nicotinic acid | 1 |
| Pyridoxine HCl | 1 |
| myo-inositol | 100 |
| IAA | 0.1 |
| NAA | 0.1 |
| 2,4-D | 1.5 |
| Kinetin | 0.25 |
| Sucrose | 20,000 |
| Gelrite | 4,000 |
| pH = 5.8. sterilized at 121˚C for 15 minutes |
|
<1-2> 포도
캘러스
배양액 회수
상기 실시예 <1-1>에서 유도되어 안정화된 포도 캘러스를 배양하여 포도 캘러스 배양액을 회수하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>에서 유도되어 안정화된 포도 캘러스를 1 mg/L 2,4-D가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지를 칭하는 MS1D(MS 4.4g, 수크로스 30 g, MES 0.5 g, 미오-이노시톨 0.1 g, 티아민 HCl 0.4 mg, 2,4-D 1 mg/L) 액체배지 100 ㎖에 10 g씩 3개 플라스크에 각각 접종한 후 25℃, 90rpm으로 14일간 배양하였다. 14일간 배양하여 증식한 캘러스를 미리 멸균하여 건조한 3L 바이오리액터에 모두 계대한 후 1.2L의 MS1D 액체배지를 추가하였다. 7일간 배양 후 100 μM MeJA(methyl jasmonate)와 50 mM 스테비오사이드를 함께 처리하였으며, 이후 배양 5일째 시료를 거름망에 걸러 캘러스와 캘러스 배양액으로 분리함으로써, 포도 캘러스 배양액을 획득하였다.
아울러, 상기 제조한 포도 캘러스 배양액 내 존재하는 epsilon-Viniferin, delta-Viniferin 및 resveratrol의 함량을 측정한 결과, 포도 캘러스 배양액 (시료명 A로 명명) ㎖ 당 epsilon-Viniferin은 362.28 ㎍, resveratrol은 45.92 ㎍이 함유되어 있는 것을 확인하였다.
한편, 상기 실시예 <1-2>에서 획득한 포도 캘러스 배양액(시료 A) 20 ㎖에 같은 부피의 에틸아세테이트를 넣고 잘 섞은 후 에틸아세테이트 층을 회수하고 증발기를 이용하여 에틸아세테이트를 제거하였다. 최종적으로 에탄올 1㎖에 녹인 다음 적당량으로 희석하여 HPLC로 엡실론-비니페린, 델타-비니페린, 레스베라트롤 각각의 함량을 분석하였다.
<1-3> 포도
캘러스
배양액의 추출물의 제조
상기 실시예 <1-2>에서 획득한 포도 캘러스 배양액(시료명 A)을 에틸아세테이트로 추출하여 캘러스 배양액의 추출물(시료명 a)을 제조하였다.
구체적으로 상기 실시예 <1-2>에서 획득한 포도 캘러스 배양액 (시료명 A) 20㎖에 같은 부피의 에틸아세테이트를 넣고 잘 섞은 후 에틸아세테이트 층을 회수하고 증발기를 이용하여 에틸아세테이트를 제거하였다. 최종적으로 에탄올 1㎖에 녹여서 캘러스 배양액의 추출물(시료명 a로 명명)을 제조하였다.
[참조]
<1-4> 시료 C의 제조
상기 실시예 <1-2>에서 플라스크에 접종하여 14일간 배양하여 증식한 캘러스를 바이오리액터 대신에 미리 멸균하여 건조한 플라스크에 계대한 후 300㎖의 MS1D 액체배지를 추가하였다. 7일간 배양 후 100 μM MeJA(methyl jasmonate)와 50 mM 스테비오사이드를 함께 처리하였으며 이후 배양 5일 째 시료를 거름망에 걸러 캘러스와 캘러스 배양액을 분리함으로써 포도 캘러스 배양액(시료명 C로 명명)을 획득하였다.
<
실험예
1> 포도
캘러스
배양액의
미백활성
확인
포도 캘러스 배양액의 미백활성을 확인하기 위하여 버섯 티로시나아제(Tyrosinase) 효소 활성 억제 효과를 확인하였다. 티로시나아제 효소활성 저해 검정은 Vanni 등 (1990)에 의한 방법으로 수행하였다.
구체적으로, 0.1 ㎎/㎖의 L-티로신(tyrosine)을 포함하는 0.05 mM 소듐 포스페이트 완충액(sodium phosphate buffer, pH 6.8) 0.5mL에 농도별(엡실론 비니페린을 기준으로 0 ~ 100 ㎍/㎖)로 조제된 포도 캘러스 배양액 0.5 ㎖를 첨가하였다. 여기에 다시 0.5 mL의 버섯 티로시나아제(mushroom tyrosinase, 70 units/0.5 ㎖)을 첨가하여 조제된 혼합물을 37℃에서 10분간 반응시킨 후 47 5nm(UV-1200; Shimadzu, Kyoto, Japan)에서 흡광도를 측정하였다.
또한, 상기 실시예 <1-3> 및 <1-4>에서 제조한 포도 캘러스 배양액 추출물, 및 시료 C를 상기 동일한 방법으로 티로시나아제 효소 활성 억제 효과를 확인하였으며, 양성 대조군으로는 Kojic acid 및 Ascorbic acid를 사용하였다. 아울러, 티로시나아제 효소활성 저해율은 하기 [수학식 1]에 의하여 산출하였다.
상기 식에서, A는 시료를 첨가하지 않았을 때의 흡광도이고, 상기 B는 시료를 첨가하였을 때 흡광도를 나타낸다.
그 결과, 도 1, 도 2 및 표 1에 나타낸 바와 같이 본 발명의 포도 캘러스 배양액과 포도 캘러스 배양액 추출물 및 시료 C의 티로시나아제 활성 억제 효과를 확인하기 위하여, IC50 값을 확인한 결과, 포도 캘러스 배양액(시료명 A)은 epsilon-Viniferin 35 uM 및 resveratrol 8.82 uM이고, 포도 캘러스 배양액 추출액(시료명 a)은 epsilon-Viniferin 100 uM 및 resveratrol 8 uM이며, 델타 비니페린 고함유 배양액군(시료명 C)는 epsilon-Viniferin 11.04 uM, resveratrol 10.44 uM 및 delta-Viniferin 1.04이고, 양성대조군인 kojic acid 는 124 uM, Ascorbic acid는 1.835 mM인 것을 확인하였다(도 1, 도 2 및 표 2).
따라서, 본 발명의 포도 캘러스 배양액은 포도 캘러스 배양액 추출물 및 시료 C 뿐만 아니라 양성대조군보다 현저한 티로시나아제 효소활성을 나타냄을 확인하였다.
<
실험예
2> 세포 독성 확인
사람의 멜라닌 세포(Human melanoma cell: MNT-1 cell)를 Dulbecco's modified eagle's media (DMEM), fetal bovine serum (FBS), Non-essential amino acid, 1 mM Sodium pyrubate, Penicilline-streptomycin 배지에서 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양시켰다. 그런 다음, 포도 캘러스 배양액 및 델타 비니페린 고함유 배양액군(시료명 C)를 농도별로 배지에 첨가한 후, 세포생존율을 MTT assay로 측정하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 포도 캘러스 배양액의 경우 epsilon-Viniferin 20 ug/ml, resveratrol 2.53 ug/ml까지 세포독성이 없는 것을 확인하였으며, 델타 비니페린 고함유 배양액군(시료명 C)의 경우에는 epsilon-Viniferin 0.2 ㎍/㎖, resveratrol 0.1 ㎍/㎖, delta-Viniferin 19.1 ㎍/㎖ 까지 세포독성이 없는 것을 확인하였다(도 3).
<
실험예
3> 멜라닌 생성 저해량 확인
멜라닌 생성량 측정은 DMEM으로 계대배양 된 MNT-1 cell 세포주를 100 mm 배양접시(culture dish)에 2 × 105 개의 농도로 넣어준 후 1일 뒤 포도 캘러스 배양액 및 델타 비니페린 고함유 배양액군(시료명 C)을 농도별로 처리하였다. 3일째에 세포를 인산완충액(pH 7.4)으로 세척하고 0.25 M trypsin-EDTA 용액으로 세포를 바닥에서 떼어준 후, DMEM으로 trypsin-EDTA의 작용을 중화시켰다. 10분 동안 2,500 rpm, 4℃ 조건에서 원심분리하여 세포를 수확하였다. 혈구계수기(hematocytometer)로 MNT-1 세포를 세어서 1 × 106 세포 수 당 1 mL의 5% TCA로 처리 교반하였다. 2,500rpm으로 2회 원심분리한 후 분리된 멜라닌을 인산완충액으로 세척하였다. 에테르와 에탄올을 1:3 비율로하여 2회 원심분리한 후 에테르 1 mL로 세척 건조시켰다. 건조된 멜라닌에 1N NaOH를 가하여 1시간 동안 56℃ 항온조에서 반응시킨 후 분광광도계로 475nm에서 흡광도를 측정하고 멜라닌 양은 합성 멜라닌을 사용하여 작성된 표준 검량식에서 구하였고, 시료 처리군의 멜라닌 양은 대조군의 멜라닌량에 대한 백분율로 계산하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 세포 독성이 없는 농도에서 포도 캘러스 배양액의 경우 epsilon-Viniferin 20 ㎍/㎖, resveratrol 2.53 ㎍/㎖에서 13.37%, 델타 비니페린 고함유 배양액군(시료명 C)의 경우 epsilon-Viniferin 0.2 ㎍/㎖, resveratrol 0.1 ㎍/㎖, delta-Viniferin 19.1 ㎍/㎖에서 8.18% 멜라닌 합성을 저해함을 확인하였다(도 3).
<
제조예
1> 화장품의 제조
<1-1> 유연화장수(
스킨
)
본 발명의 포도 캘러스 배양액을 포함하는 유연화장수를 제조하기 위해 하기 [표 3]에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조할 수 있다.
| 성분 | 함량(중량%) |
| 본 발명의 포도 캘러스 배양액 | 0.1 ~ 30 % |
| 1,3-부틸렌 글리콜 | 3.0 |
| 글리세린 | 5.0 |
| 폴리옥시에틸렌(60) 경화피마자유 | 0.2 |
| 에탄올 | 8.0 |
| 구연산 | 0.02 |
| 구연산나트륨 | 0.06 |
| 방부제 | 미량 |
| 향료 | 미량 |
| 정제수 | To 100 |
<1-2> 영양화장수(로션)
본 발명의 포도 캘러스 배양액을 포함하는 영양화장수를 제조하기 위해 하기 [표 4]에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조할 수 있다.
| 성분 | 함량(중량%) |
| 본 발명의 포도 캘러스 배양액 | 0.1 ~ 30 % |
| 1,3-부틸렌 글리콜 | 8.0 |
| 글리세린 | 5.0 |
| 스쿠알란 | 10.0 |
| 모노올레인산폴리옥시에틸렌소르비탄 | 2.0 |
| 유창목오일 | 0.1 ~ 30 % |
| 글리세린 | 5.0 |
| 폴리옥시에틸렌(60) 경화피마자유 | 0.2 |
| 에탄올 | 8.0 |
| 구연산 | 0.02 |
| 구연산나트륨 | 0.06 |
| 방부제 | 미량 |
| 향료 | 미량 |
| 정제수 | To 100 |
<1-3> 에센스
본 발명의 포도 캘러스 배양액을 포함하는 에센스를 제조하기 위해 하기 [표 5]에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조할 수 있다.
| 성분 | 함량(중량%) |
| 본 발명의 포도 캘러스 배양액 | 0.1 ~ 30 % |
| 시토스테롤 | 1.7 |
| 플리글리세릴2-올레이트 | 1.5 |
| 세라마이드 | 0.7 |
| 세테아레스-4 | 1.2 |
| 콜레스테롤 | 1.5 |
| 디세틸포스페이트 | 0.4 |
| 농글리세린 | 5.0 |
| 카르복시비닐폴리머 | 0.2 |
| 잔탄검 | 0.2 |
| 방부제 | 미량 |
| 향료 | 미량 |
| 정제수 | To 100 |
<1-4> 세안제(
클렌징폼
)
본 발명의 포도 캘러스 배양액을 포함하는 세안제(클렌징폼)를 제조하기 위해 하기 [표 6]에 기재된 것처럼 배합하여 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조할 수 있다.
| 성분 | 함량(중량%) |
| 본 발명의 포도 캘러스 배양액 | 0.1 ~ 30 % |
| N-아실글루타민산나트륨 | 20.0 |
| 글리세린 | 10.0 |
| PEG-400 | 15.0 |
| 프로필렌 글리콜 | 10.0 |
| POE(15) 올레일알코올에테르 | 3.0 |
| 라우린유도체 | 2.0 |
| 메틸파라벤 | 0.2 |
| EDTA-4Na | 0.03 |
| 향료 | 0.2 |
| 정제수 | To 100 |
<1-5> 영양크림
본 발명의 포도 캘러스 배양액을 포함하는 영양크림을 제조하기 위해 하기 [표 7]에 기재된 것처럼 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조한다.
| 배합성분 | 함량(중량%) |
| 본 발명의 포도 캘러스 배양액 | 0.1 ~ 30 % |
| 바셀린 | 7.0 |
| 유동파라핀 | 10.0 |
| 밀납 | 2.0 |
| 폴리솔베이트60 | 2.5 |
| 솔비탄세스퀴올레이트 | 1.5 |
| 스쿠알란 | 3.0 |
| 프로필렌 글리콜 | 6.0 |
| 글리세린 | 4.0 |
| 트리에탄올아민 | 0.5 |
| 잔탄검 | 0.5 |
| 토코페닐아세테이트 | 0.1 |
| 향, 방부제 | 미량 |
| 정제수 | To 100 |
<1-6> 마사지크림
본 발명의 포도 캘러스 배양액을 포함하는 마사지크림을 제조하기 위해 하기 [표 8]에 기재된 것처럼 통상적인 화장품 분야에서의 제조방법에 따라 제조한다.
| 배합성분 | 함량(중량%) |
| 본 발명의 포도 캘러스 배양액 | 0.1 ~ 30 % |
| 프로필렌 글리콜 | 6.0 |
| 글리세린 | 4.0 |
| 트리에탄올아민 | 0.5 |
| 밀납 | 2.0 |
| 토코페닐아세테이트 | 0.1 |
| 폴리솔베이트60 | 3.0 |
| 솔비탄세스퀴올레이트 | 2.5 |
| 세테아릴알코올 | 2.0 |
| 유동파라핀 | 30.0 |
| 잔탄검 | 0.5 |
| 향, 방부제 | 미량 |
| 정제수 | To 100 |
<2-7> 팩
본 발명의 포도 캘러스 배양액을 포함하는 팩을 제조하기 위해 하기 [표 9]에 기재된 것처럼 통상적인 화장품 분야에서의 제조 방법에 따라 제조한다.
| 배합성분 | 함량(중량%) |
| 본 발명의 포도 캘러스 배양액 | 0.1 ~ 30 % |
| 프로필렌 글리콜 | 2.0 |
| 글리세린 | 4.0 |
| 폴리비닐알코올 | 10.0 |
| 에탄올 | 7.0 |
| 파이지-40 히드로게비이티드캐스터오일 | 0.8 |
| 트리에탄올아민 | 0.3 |
| 향, 방부제 | 미량 |
| 정제수 | To 100 |
Claims (10)
- 이차 대사산물로 입실론-비니페린(epsilon-viniferin) 및 레스베라트롤(resveratrol)을 함유하는 포도 캘러스 배양액을 유효 성분으로 함유하는, 피부 미백용 화장료 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 포도 캘러스는 포도의 꽃, 잎, 줄기, 가지, 열매 및 뿌리로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 부위로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 포도 캘러스 배양액을 전체 조성물 중량에 대하여 0.0001 내지 25.0 중량% 포함되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 포도 캘러스는 활성유도제 및 가용화제를 첨가한 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 활성유도제 및 가용화제는 각각 메틸 자스몬산(methyl jasmonate) 및 스테비오사이드(stevioside)인 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 메틸 자스몬산 및 스테비오사이드는 각각 50~350 uM 및 40~60 mM의 농도로 첨가하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 이차 대사산물로 입실론-비니페린(epsilon-viniferin) 및 레스베라트롤(resveratrol)을 함유하는 포도 캘러스 배양액을 유효 성분으로 함유하는, 피부 미백용 건강기능식품 조성물.
- 삭제
- 삭제
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|---|---|---|---|
| KR1020180077206A KR102547722B1 (ko) | 2018-07-03 | 2018-07-03 | 포도 캘러스 배양액을 유효 성분으로 함유하는 피부 개선용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
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| KR1020180077206A KR102547722B1 (ko) | 2018-07-03 | 2018-07-03 | 포도 캘러스 배양액을 유효 성분으로 함유하는 피부 개선용 조성물 |
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