KR20230043483A - 찔레 조직배양 묘 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 피부 미백 및 주름개선용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 찔레 조직배양 묘 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 피부 미백 및 주름개선용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 제조방법으로 제조된 찔레 조직배양 묘 추출물은 종래의 찔레꽃 추출물에 비해 DPPH 라디칼 소거활성이 우수하고, α-MSH에 의해 유도된 멜라닌 생성을 현저하게 감소시키며, MMP-1의 함량을 현저하게 감소시키는 효과가 있으므로, 항산화, 피부 미백 및 주름 개선용 화장품 또는 건강기능식품의 소재로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 찔레 조직배양 묘 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 피부 미백 및 주름개선용 조성물에 관한 것이다.
피부는 기본적인 신진대사 과정을 통하여 우리 몸의 항상성을 저해하는 다양한 외부 요인으로부터 위해를 막아주는 일차적인 기능을 담당하고 있다. 즉, 피부는 신체 가장 바깥쪽에 위치함으로써 물리적, 화학적, 생물학적 장벽기능을 통한 보호작용, 체온 조절작용, 감각작용, 분비 및 배설작용, 흡수작용, 저장작용, 재생작용 등의 다양한 역할을 수행하고 있지만, 지속적인 외부 스트레스가 가해지는 경우 손상을 가장 받기 쉽다.
이러한 외부 스트레스의 주요 원인으로는 자외선 노출, 배기가스, 황사, 환경오염물, 중금속, 온도변화, 미생물을 대표적인 예로 들 수 있다. 이들은 주로 산화적 스트레스(oxidative stress)를 통하여 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)을 생성함으로써, 항산화 방어체계를 붕괴시켜 세포 손상 및 사멸을 야기하게 된다. 따라서, 외부 스트레스로부터 피부 세포를 보호하고 노화를 예방하기 위해서는 활성산소로 인한 산화적 스트레스를 억제하고, 활성산소를 효율적으로 제거할 수 있는 항산화 방어 강화가 중요하며, 최근에는 인체에 무해하고 더욱 강력한 항산화력을 가진 천연 물질에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다.
콜라겐은 피부의 진피층에 존재하며 전체 피부 건조중량의 약 70%를 차지한다. 피부의 탄력은 이 콜라겐과 엘라스틴(elastin, 탄력섬유)에 의해서 유지되는 것으로 알려져 있다. 이러한 콜라겐은 자연 노화에 의한 세포 활성의 감소 및 콜라게나아제(collagenase)의 활성으로 인한 내적 요인 및 공해, 자외선, 스트레스 등의 외적 요인에 의한 활성산소 및 자유 라디칼의 증가로 인해 감소하게 된다. 콜라겐은 주름 형성과 관련이 있다.
멜라닌은 머리카락 및 피부의 색상을 결정하는 주요 인자로, 자외선으로부터 피부 세포를 보호하는 역할을 하지만 과도한 멜라닌의 축적은 주근깨 또는 기미 등과 같은 색소 과다 침착 현상을 유발한다. 표피층의 기저층(basal layer)에 존재하는 멜라닌 형성 세포는 멜라노솜이라고 불리는 특정한 구조로 되어 있으며, 이곳에서 멜라닌 형성 효소(melanogenic enzyme)의 작용으로 인해 멜라닌이 생성된다. 멜라닌은 검은색 및 갈색계열의 유멜라닌(eumelanin)과 노란색 및 붉은 계열의 페오멜라닌(pheomelanin)이 있으며, 멜라닌의 합성은 티로시나아제(tyrosinase)에 의해 티로신(tyrosine)이 도파(DOPA) 및 도파 퀴논(DOPA quinone)으로 전환되면서 시작된다.
한편, 찔레(Rosa multiflora)는 장미과의 낙엽 관목으로 전국의 산기슭이나 하천유역에 광범위하게 분포하는 식물이다. 한방에서는 열매를 영실이라는 약제로 사용하는데, 불면증, 건망증, 성기능 감퇴, 부종에 효과가 있다고 알려졌으며 이뇨제로도 사용된다.
한편, 한국공개특허 제2018-0137151호에는 강황잎 및 황촉규(Hibiscus manihot)의 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 광노화 억제용 화장료 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1178594호에 하수오 추출물, 대추 추출물 및 황촉규(Hibiscus manihot) 추출물을 함유하는 피부 보습용 화장료 조성물이 개시되어 있지만, 본 발명의 찔레 조직배양 묘 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 피부 미백 및 주름개선용 조성물에 관해 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로, 찔레 조직배양 묘 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 피부 미백 및 주름개선용 조성물을 제공하고, 상기 찔레 조직배양 묘 추출물의 항산화, 미백 및 주름개선효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 찔레 조직배양 묘 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 피부 미백 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 찔레 조직배양 묘 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 피부 미백 및 주름개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 찔레 조직배양 묘 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 피부 미백 및 주름개선용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 제조방법으로 제조된 찔레 조직배양 묘 추출물은 종래의 찔레꽃 추출물에 비해 DPPH 라디칼 소거활성이 우수하고, α-MSH에 의해 유도된 멜라닌 생성을 현저하게 감소시키며, MMP-1의 함량을 현저하게 감소시키는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 찔레 조직배양 묘 추출물(RME)의 DPPH 라디칼 소거활성을 확인한 결과이다. 비타민 C(vitC)는 양성대조군이다.
도 2는 마우스 멜라노마 세포주(B16F10) 세포에서, 본 발명의 찔레 조직배양 묘 추출물(A) 및 찔레꽃 추출물(B)의 세포독성을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 찔레 조직배양 묘 추출물 및 찔레꽃 추출물 처리에 따른 멜라닌 함량 변화를 확인한 결과이다. α-MSH는 멜라닌 생성 유도 물질이고, 알부틴(Arbutin)은 양성대조군이다. 도면 내 문자 a~g는 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미한다.
도 4는 섬유아세포주(Human Dermal Fibroblasts, HDFa) 세포에서, 본 발명의 찔레 조직배양 묘 추출물(A) 및 찔레꽃 추출물(B)의 세포독성을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 찔레 조직배양 묘 추출물 및 찔레꽃 추출물 처리에 따른 MMP-1 함량 변화를 확인한 결과이다. TGF-β1은 양성대조군이다. 도면 내 문자 a~d는 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미한다.
도 2는 마우스 멜라노마 세포주(B16F10) 세포에서, 본 발명의 찔레 조직배양 묘 추출물(A) 및 찔레꽃 추출물(B)의 세포독성을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 찔레 조직배양 묘 추출물 및 찔레꽃 추출물 처리에 따른 멜라닌 함량 변화를 확인한 결과이다. α-MSH는 멜라닌 생성 유도 물질이고, 알부틴(Arbutin)은 양성대조군이다. 도면 내 문자 a~g는 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미한다.
도 4는 섬유아세포주(Human Dermal Fibroblasts, HDFa) 세포에서, 본 발명의 찔레 조직배양 묘 추출물(A) 및 찔레꽃 추출물(B)의 세포독성을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 찔레 조직배양 묘 추출물 및 찔레꽃 추출물 처리에 따른 MMP-1 함량 변화를 확인한 결과이다. TGF-β1은 양성대조군이다. 도면 내 문자 a~d는 서로 통계적으로 유의미한 차이가 있다는 것을 의미한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 찔레 조직배양 묘 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 피부 미백 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 추출물의 용매는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 에탄올을 용매로 이용하는 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 찔레 조직배양 묘는
1) 채취한 찔레 마디를 소독한 후 찔레 마디 절편을 배지에 치상하는 단계;
2) 상기 단계 1) 이후에, 상기 찔레 마디 절편으로부터 캘러스를 유기하는 단계;
3) 상기 단계 2) 이후에, 상기 유기된 캘러스로부터 신초를 유도하는 단계;
4) 상기 단계 3) 이후에, 상기 신초를 증식시키는 단계; 및
5) 상기 단계 4) 이후에, 상기 증식시킨 신초에 뿌리를 유도하는 단계;를 포함하는 조직배양 방법으로부터 획득된 것일 수 있고,
바람직하게는
1) 채취한 찔레 마디를 소독한 후, 소독된 찔레 마디 절편을 MS 배지에 치상하여 3~7일 동안 배양하는 단계;
2) 상기 단계 1) 이후에, BAP(6-Benzylaminopurine) 및 NAA(naphthaleneacetic acid)가 포함된 캘러스 생성용 MS 배지에 상기 찔레 마디 절편을 치상하여 3~5주 동안 캘러스 생성을 유도하는 단계;
3) 상기 단계 2) 이후에, BAP 및 NAA가 포함된 신초 형성용 MS 배지에서 상기 단계 2)에서 생성된 캘러스를 3~5주 동안 배양하여 신초를 형성하는 단계;
4) 상기 단계 3) 이후에, BAP가 포함된 신초 증식용 WPM 배지에서 상기 단계 3)에서 형성된 신초를 5~7주 동안 증식시키는 단계; 및
5) 상기 단계 4) 이후에, IBA(3-indole butyric acid)가 포함된 발근 유기 MS 배지에서 상기 단계 4)에서 증식시킨 신초를 3~5주 동안 배양하여 뿌리를 유도하는 단계;를 포함하는 조직배양 방법으로부터 획득된 것일 수 있고,
더 바람직하게는
1) 채취한 찔레 마디를 소독한 후, 소독된 찔레 마디 절편을 MS 배지에 치상하여 3~7일 동안 배양하는 단계;
2) 상기 단계 1) 이후에, 0.3~0.8mg/L BAP 및 1~3mg/L NAA가 포함된 캘러스 생성용 MS 배지에 찔레 마디 절편을 치상하여 3~5주 동안 배양하며 캘러스 생성을 유도하는 단계;
3) 상기 단계 2) 이후에, 0.6~1.5mg/L BAP 및 0.05~0.3mg/L NAA가 포함된 신초 형성용 MS 배지에서 상기 단계 2)에서 생성된 캘러스를 3~5주 동안 배양하여 신초를 형성하는 단계;
4) 상기 단계 3) 이후에, 0.5~1.5mg/L BAP가 포함된 신초 증식용 WPM 배지에서 상기 단계 3)에서 형성된 신초를 5~7주 동안 증식시키는 단계; 및
5) 상기 단계 4) 이후에, 0.3~0.8mg/L IBA(3-indole butyric acid)가 포함된 발근 유기 MS 배지에서 상기 단계 4)에서 증식시킨 신초를 3~5주 동안 배양하여 뿌리를 유도하는 단계;를 포함하는 조직배양 방법으로부터 획득된 것일 수 있으며,
가장 바람직하게는
1) 채취한 찔레 마디를 소독한 후, 소독된 찔레 마디 절편을 MS 배지에 치상하여 5일 동안 배양하는 단계;
2) 상기 단계 1) 이후에, 0.5mg/L BAP 및 2mg/L NAA가 포함된 캘러스 생성용 MS 배지에 찔레 마디 절편을 치상하여 4주 동안 배양하며 캘러스 생성을 유도하는 단계;
3) 상기 단계 2) 이후에, 1mg/L BAP 및 0.1mg/L NAA가 포함된 신초 형성용 MS 배지에서 상기 단계 2)에서 생성된 캘러스를 4주 동안 배양하여 신초를 형성하는 단계;
4) 상기 단계 3) 이후에, 1mg/L BAP가 포함된 신초 증식용 WPM 배지에서 상기 단계 3)에서 형성된 신초를 6주 동안 증식시키는 단계; 및
5) 상기 단계 4) 이후에, 0.5mg/L IBA(3-indole butyric acid)가 포함된 발근 유기 MS 배지에서 상기 단계 4)에서 증식시킨 신초를 4주 동안 배양하여 뿌리를 유도하는 단계;를 포함하는 조직배양 방법으로부터 획득된 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에서, 상기 단계 2)의 캘러스 생성용 MS 배지는 카제인(casein)을 추가로 더 포함할 수 있고, 상기 단계 3)의 신초 형성용 MS 배지는 질산은(AgNO3) 및 지베렐린(GA3)을 추가로 더 포함할 수 있고, 바람직하게는 상기 단계 2)의 캘러스 생성용 MS 배지는 1~3g/L의 카제인을 추가로 더 포함할 수 있고, 상기 단계 3)의 신초 형성용 MS 배지는 15~25μM의 질산은 및 0.3~0.7mg/L의 지베렐린을 추가로 더 포함할 수 있으며, 더 바람직하게는 상기 단계 2)의 캘러스 생성용 MS 배지는 2g/L의 카제인을 추가로 더 포함할 수 있고, 상기 단계 3)의 신초 형성용 MS 배지는 18μM의 질산은 및 0.5mg/L의 지베렐린을 추가로 더 포함하는 것이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액, 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이들 각 제형으로 이루어진 화장료 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가로 클로로플루오로히드로카본, 프로판-부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 아세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 형광 물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 찔레 조직배양 묘 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 피부 미백 및 주름개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취인 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 제조예 및 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 제조예 및 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
제조예 1. 찔레 조직배양 묘 생성
1) 배지의 제조
- MS 배지
3차 증류수에 MS 파우더(M0222.0050, duchefa) 4.4g, 자당(sucrose) 30g, MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) 0.5g을 녹인 후, pH를 5.7로 맞춘 다음 최종 부피가 1L가 되도록 3차 증류수를 넣어 맞췄다. 그 후, 삼각플라스크에 옮겨 담고, 파이토 아가(phyto agar)를 5g 넣은 후, 멸균하였다(121℃, 1.5기압, 15분). 멸균이 종료된 후 70℃까지 온도가 내려가면 클린벤치에서 배양용 접쉬(dish)에 분주하였다.
- 캘러스 생성용 MS 배지
3차 증류수에 MS 파우더(M0222.0050, duchefa) 4.4g, 자당(sucrose) 30g, MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) 0.5g을 녹인 후, pH를 5.7로 맞춘 다음 최종 부피가 1L가 되도록 3차 증류수를 넣어 맞췄다. 그 후, 삼각플라스크에 옮겨 담고, 파이토 아가(phyto agar)를 3g 및 카제인(casein) 2g을 넣은 후, 멸균하였다(121℃, 1.5기압, 15분). 멸균이 종료된 후 70℃까지 온도가 내려가면 클린벤치에서 2mg의 NAA 및 0.5mg의 BAP를 혼합한 다음 배양용 접쉬(dish)에 분주하였다.
- 신초 형성용 MS 배지
3차 증류수에 MS 파우더(M0222.0050, duchefa) 4.4g, 자당(sucrose) 30g, MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) 0.5g을 녹인 후, pH를 5.7로 맞춘 다음 최종 부피가 1L가 되도록 3차 증류수를 넣어 맞췄다. 그 후, 삼각플라스크에 옮겨 담고, 파이토 아가(phyto agar)를 3g을 넣은 후, 멸균하였다(121℃, 1.5기압, 15분). 멸균이 종료된 후 70℃까지 온도가 내려가면 클린벤치에서 0.1mg의 NAA, 1mg의 BAP 및 0.5mg의 지베렐린(GA3)을 혼합하고, 질산은(AgNO3)을 18μM이 되도록 혼합한 다음 배양용 접쉬(dish)에 분주하였다.
- 신초 증식용 WPM 배지
3차 증류수에 WPM 파우더(MB-L4461-50L, MB cell) 2.38g, 자당(sucrose) 30g, MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) 0.5g을 녹인 후, pH를 5.7로 맞춘 다음 최종 부피가 1L가 되도록 3차 증류수를 넣어 맞췄다. 그 후, 삼각플라스크에 옮겨 담고, 파이토 아가(phyto agar)를 3g을 넣은 후, 멸균하였다(121℃, 1.5기압, 15분). 멸균이 종료된 후 70℃까지 온도가 내려가면 클린벤치에서 1mg의 BAP를 혼합한 다음 배양용 접쉬(dish)에 분주하였다.
- 발근 유기 MS 배지
3차 증류수에 MS 파우더(M0222.0050, duchefa) 4.4g, 자당(sucrose) 30g, MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) 0.5g을 녹인 후, pH를 5.7로 맞춘 다음 최종 부피가 1L가 되도록 3차 증류수를 넣어 맞췄다. 그 후, 삼각플라스크에 옮겨 담고, 파이토 아가(phyto agar)를 3g을 넣은 후, 멸균하였다(121℃, 1.5기압, 15분). 멸균이 종료된 후 70℃까지 온도가 내려가면 클린벤치에서 0.5mg의 IBA를 혼합한 다음 배양용 접쉬(dish)에 분주하였다.
2) 찔레 조직배양 묘 생성
당년에 자라고 눈이 1개 이상 포함된 찔레 마디를 5~10cm로 잘라 채취한 후, 1~2개 마디가 포함되게 자른 다음 소독 과정을 진행하였다. 소독 과정은 찔레 마디를 증류수로 2~3회 세척한 후, 70%(v/v) 에탄올에 1분 동안 침지시키는 과정을 2회 반복하고, 그 후, 0.5~2%(v/v) 하이포아염소산나트륨액에 1분 동안 침지시키는 과정을 2회 반복하였다. 이후, 소독된 찔레 마디는 멸균수를 이용하여 3회 세척한 다음 무균실로 옮겨 추가로 2회 멸균수로 헹구어준 다음 물기를 제거한 후, 괴사한 가장자리 조직을 제거한 다음 절편을 MS 배지에 치상하였다. 5일 동안 배양한 후, 오염되지 않은 찔레 마디 절편을 캘러스 유기 실험에 이용하였다.
0.5mg/L BAP 및 2mg/L NAA가 포함된 캘러스 생성용 MS 배지에 상기 오염되지 않은 찔레 마디 절편을 치상하여 4주 동안 배양하며 캘러스 생성을 유도하였다. 그 후, 1mg/L BAP 및 0.1mg/L NAA가 포함된 신초 형성용 MS 배지에서 상기 생성된 캘러스를 4주 동안 배양하여 신초를 형성하였다.
신초 형성 이후, 1mg/L BAP가 포함된 신초 증식용 WPM 배지에서 상기 형성된 신초를 6주 동안 증식시기고, 이후, 0.5mg/L IBA(3-indole butyric acid)가 포함된 발근 유기 MS 배지에서 상기 증식시킨 신초를 4주 동안 배양하여 뿌리를 유도하여 찔레 조직배양 묘를 획득하였다.
제조예 2. 찔레 조직배양 묘 추출물의 제조
상기 제조예 1에서 획득한 찔레 조직배양 묘에 70%(v/v) 에탄올을 10배수 첨가한 후, 40℃에서 6시간 동안 추출한 다음 여과하였다. 여과 후, 여액을 농축한 후 동결 건조하여 실험의 시료로 사용하였다.
본 발명의 비교예로 사용된 찔레꽃 추출물은 남원시 송동면 일대에서 채취한 것으로, 건조된 찔레꽃을 50%(v/v) 에탄올을 20배수 첨가한 후, 80℃에서 4시간 동안 추출하여 여과하였다. 여과 후, 여액을 농축한 후 동결 건조하여 실험의 시료로 사용하였다.
실시예 1. 항산화 효과
1) 플라보노이드 함량 분석
상기 제조예 2의 시료 1mg을 MeOH 1mL에 녹여 시험관에 취하고, 10mL의 디에킬렌글리콜(diethylene glycol)을 가하여 잘 혼합한 후 1N NaOH를 1mL 첨가한 다음 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 420nm에서 흡광도를 측정하였고, 이때 표준물질로 퀘르세틴(quercetin)을 사용하여 시료와 동일한 방법으로 분석한 후 얻은 표준곡선으로부터 총 플라보노이드 함량을 계산하였다.
총 플라보노이드 함량을 측정한 결과, 하기 표 1에 개시된 바와 같이 본 발명의 찔레 조직배양 묘 추출물의 총 플라보노이드 함량은 156.83mg/g이었고, 찔레꽃 추출물의 총 플라보노이드 함량은 86.77mg/g으로, 찔레 조직배양 묘 추출물의 총 플라보노이드 함량이 찔레꽃 추출물 대비 1.8배 높았다.
| 시료 | 총 플라보노이드 함량 |
| 찔레 조직배양 묘 추출물 | 156.83mg/g |
| 찔레꽃 추출물 | 86.77mg/g |
2) DPPH 라디칼 소거능
DPPH 라디칼 소거활성을 확인하기 위해, 상기 제조예 2의 시료와 200μM DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)를 1:1의 부피비로 혼합한 후, 37℃에서 30분 동안 반응 시킨 후, 517nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 1에 개시된 바와 같이 찔레 조직배양 묘 추출물(RME)은 10, 25, 50, 100, 200, 500㎍/mL 농도에서 각각 14.1, 45.9, 84.7, 95.2, 95.0, 95.2%의 DPPH 라디칼 소거 활성을 나타내 농도의존적으로 소거 활성이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 찔레 조직배양 묘 추출물은 50㎍/mL 농도부터 양성대조군인 vitC(250μM, 83.0%)와 유사한 효능을 나타내었다.
또한, 하기 표 2에 개시된 바와 같이 찔레 조직배양 묘 추출물과 찔레꽃 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성을 비교해 본 결과, 찔레 조직배양 묘 추출물의 SC50(drug concentration eliciting 50% of the maximum stimulation) 값이 찔레꽃 추출물 대비 약 4.19배 낮은 것을 확인할 수 있었다.
| 시료 | DPPH SC50(㎍/mL) |
| 찔레 조직배양 묘 추출물 | 29.35 |
| 찔레꽃 추출물 | 123.10 |
실시예 2. 미백효과
본 발명의 미백효과 실험은 식품의약품안전처의 "피부의 미백에 도움을 주는 기능성화장품 유효성 평가 가이드 라인"에 따라 진행하였다.
1) 세포주
세포는 마우스 멜라노마 세포주인 B16F10(ATCC CRL-6475TM)을 사용하였고, 10%(v/v) FBS(fetal bovine serum)와 1%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin)이 포함된 DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium) 배지를 사용하여 37℃, CO2 5%, 가습조건이 되는 세포 배양기에서 배양하였다.
2) 세포독성시험
96웰-플레이트에 세포를 웰당 1.5×103개로 분주하고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 제조예 2의 시료를 농도별(10~200㎍/mL)로 처리하고 72시간 동안 추가 배양하였다. 배양 후, MTT 용액을 분주한 후, 4시간 뒤 제거하고 DMSO 용액을 넣어 플레이트 쉐이커(plate shaker)에서 추출하였다. 추출 후, 540nm에서 추출물의 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 2에 개시된 바와 같이 찔레 조직배양 묘 추출물 및 찔레꽃 추출물은 모든 농도에서 세포독성이 없는 것을 확인하였다. 하지만, 찔레꽃 추출물은 고농도에서 찔레 조직배양 묘 추출물 대비 낮은 세포 생존율을 보였다.
3) 세포 내 멜라닌 생성량 측정
60mm 배양 접시(culture dish)에 B16F10을 1.5×105cells/dish로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 멜라닌 생성 유도물질인 α-MSH(alpha-melanocyte-stimulating hormone; Sigma-Aldrich, USA)를 처리하여 멜라닌 생성을 유도한 후, 제조예 2의 시료 및 양성대조군을 처리하여 72시간 동안 추가 배양하였다. 이후, 배양된 세포를 수확하여 1N NaOH 용액을 첨가하여 세포를 용해하고, 용해물을 원심분리한 후, 상층액만 취하여 96웰-플레이트에 분주한 다음 세포 내의 멜라닌 함량(lysate)을 490nm 흡광도에서 측정하였다. 측정된 세포 내 멜라닌 생성량은 BCA 단백질 분석 키트(Thermo Fisher Scientific, USA)를 이용하여 총 단백질 양으로 나누어 환산하였다.
그 결과, 도 3에 개시된 바와 같이 찔레 조직배양 묘 추출물 50, 75, 100㎍/mL 처리시 멜라닌 생성량은 α-MSH 단독 처리군 대비 35.49±5.81, 49.25±1.56, 67.57±1.90%로 감소하였고, 찔레꽃 추출물 100㎍/mL 처리시 멜라닌 생성량은 α-MSH 단독 처리군 대비 63.77±0.16%로 감소하였다. 특히 찔레 조직배양 묘 추출물은 100㎍/mL 농도에서 찔레꽃 추출물 보다 멜라닌 생성을 3.8% 더 감소시켰다.
실시예 3. 주름개선효과
본 발명의 주름개선효과 실험은 식품의약품안전처의 "피부의 주름개선에 도움을 주는 기능성화장품 유효성 평가 가이드 라인"에 따라 진행하였다.
1) 세포주
세포는 섬유아세포주인 HDFa(Human Dermal Fibroblasts, adult; Gibco)를 사용하였고, 10%(v/v) LSGS(Low Serum Growth Supplement, Thermo Fisher)와 1%(v/v) 페니실린-스트렙토마이신(Penicillin-Streptomycin)이 포함된 배지(Human Fibroblast Expansion Basal Medium)를 사용하여 37℃, CO2 5%, 가습조건이 되는 세포 배양기에서 배양하였다.
2) 세포독성시험
96웰-플레이트에 세포를 웰당 3×104개로 분주하고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 제조예 2의 시료를 농도별(10~200㎍/mL)로 처리하고 72시간 동안 추가 배양하였다. 배양 후, MTT 용액을 분주한 후, 2시간 뒤 제거하고 DMSO 용액을 넣어 플레이트 쉐이커(plate shaker)에서 추출하였다. 추출 후, 540nm에서 추출물의 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 4에 개시된 바와 같이 찔레 조직배양 묘 추출물 및 찔레꽃 추출물은 100㎍/mL 농도까지 세포독성이 없는 것을 확인하였다.
3) 세포 내 콜라게나아제 활성 억제시험(MMP-1 함량 분석)
6웰-플레이트에 세포를 20×104cells/plate로 분주하고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후, 제조예 2의 시료 및 양성대조군을 처리한 배지로 교체하고 24시간 동안 배양하였다. 그 다음 PBS로 세척한 후 용해 완충액(lysis buffer)을 넣고 얼음 위에서 10분 동안 용해한 뒤, 원심분리(13,000rpm, 4℃, 20분)한 후 상층액을 회수하였다. 회수한 상층액은 브래드포드 시약(Bradford reagent, SIGMA)으로 BSA 표준곡선에 따라 단백질 함량을 측정하였고, MMP-1 Cell Lysate Human ELISA Kit(Thermo scientific, USA)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 수행한 후, MMP-1 콜라게나아제 표준곡선을 이용하여 MMP-1 함량을 측정하였다.
그 결과, 도 5에 개시된 바와 같이 찔레 조직배양 묘 추출물 10, 20, 50㎍/mL 농도에서 MMP-1 활성이 85.10±3.22, 73.59±1.31, 42.69±5.89%로 측정되었고, 찔레꽃 추출물 100㎍/mL 농도에서 MMP-1 활성이 98.87±4.40%로 측정되어, 찔레 조직배양 묘 추출물의 MMP-1 억제 활성이 찔레꽃 추출물 대비 현저하다는 것을 확인하였고, 찔레꽃 추출물은 100㎍/mL 농도에서 MMP-1 활성 억제능이 없는 것으로 확인되었다.
Claims (7)
- 찔레 조직배양 묘 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 피부 미백 및 주름개선용 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 추출물의 용매는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 항산화, 피부 미백 및 주름개선용 화장료 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 찔레 조직배양 묘는
1) 채취한 찔레 마디를 소독한 후 찔레 마디 절편을 배지에 치상하는 단계;
2) 상기 단계 1) 이후에, 상기 찔레 마디 절편으로부터 캘러스를 유기하는 단계;
3) 상기 단계 2) 이후에, 상기 유기된 캘러스로부터 신초를 유도하는 단계;
4) 상기 단계 3) 이후에, 상기 신초를 증식시키는 단계; 및
5) 상기 단계 4) 이후에, 상기 증식시킨 신초에 뿌리를 유도하는 단계;를 포함하는 조직배양 방법으로부터 획득된 것을 특징으로 하는 항산화, 피부 미백 및 주름개선용 화장료 조성물. - 제3항에 있어서, 상기 찔레 조직배양 묘는
1) 채취한 찔레 마디를 소독한 후, 소독된 찔레 마디 절편을 MS 배지에 치상하여 3~7일 동안 배양하는 단계;
2) 상기 단계 1) 이후에, BAP(6-Benzylaminopurine) 및 NAA(naphthaleneacetic acid)가 포함된 캘러스 생성용 MS 배지에 상기 찔레 마디 절편을 치상하여 3~5주 동안 캘러스 생성을 유도하는 단계;
3) 상기 단계 2) 이후에, BAP 및 NAA가 포함된 신초 형성용 MS 배지에서 상기 단계 2)에서 생성된 캘러스를 3~5주 동안 배양하여 신초를 형성하는 단계;
4) 상기 단계 3) 이후에, BAP가 포함된 신초 증식용 WPM 배지에서 상기 단계 3)에서 형성된 신초를 5~7주 동안 증식시키는 단계; 및
5) 상기 단계 4) 이후에, IBA(3-indole butyric acid)가 포함된 발근 유기 MS 배지에서 상기 단계 4)에서 증식시킨 신초를 3~5주 동안 배양하여 뿌리를 유도하는 단계;를 포함하는 조직배양 방법으로부터 획득된 것을 특징으로 하는 항산화, 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물. - 제4항에 있어서, 상기 찔레 조직배양 묘는
1) 채취한 찔레 마디를 소독한 후, 소독된 찔레 마디 절편을 MS 배지에 치상하여 3~7일 동안 배양하는 단계;
2) 상기 단계 1) 이후에, 0.3~0.8mg/L BAP 및 1~3mg/L NAA가 포함된 캘러스 생성용 MS 배지에 찔레 마디 절편을 치상하여 3~5주 동안 배양하며 캘러스 생성을 유도하는 단계;
3) 상기 단계 2) 이후에, 0.6~1.5mg/L BAP 및 0.05~0.3mg/L NAA가 포함된 신초 형성용 MS 배지에서 상기 단계 2)에서 생성된 캘러스를 3~5주 동안 배양하여 신초를 형성하는 단계;
4) 상기 단계 3) 이후에, 0.5~1.5mg/L BAP가 포함된 신초 증식용 WPM 배지에서 상기 단계 3)에서 형성된 신초를 5~7주 동안 증식시키는 단계; 및
5) 상기 단계 4) 이후에, 0.3~0.8mg/L IBA(3-indole butyric acid)가 포함된 발근 유기 MS 배지에서 상기 단계 4)에서 증식시킨 신초를 3~5주 동안 배양하여 뿌리를 유도하는 단계;를 포함하는 조직배양 방법으로부터 획득된 것을 특징으로 하는 항산화, 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물. - 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 단계 2)의 캘러스 생성용 MS 배지는 카제인(casein)을 추가로 더 포함하고, 상기 단계 3)의 신초 형성용 MS 배지는 질산은(AgNO3) 및 지베렐린(GA3)을 추가로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화, 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물.
- 찔레 조직배양 묘 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 피부 미백 및 주름개선용 건강기능식품 조성물.
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2021
- 2021-09-24 KR KR1020210126412A patent/KR20230043483A/ko not_active Application Discontinuation
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| Date | Code | Title | Description |
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| E902 | Notification of reason for refusal |