KR20240060576A - 포도 캘러스 배양액을 유효성분으로 함유하는 항균 및 항산화용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 엡실론 비니페린(epsilon(ε)-Viniferin), 델타 비니페린(delta(δ)-Viniferin) 및 레스베라트롤(resveratrol) 등을 포함하는 포도 캘러스 배양액을 유효성분으로 함유하는 항균 및 항산화용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 본 발명의 포도 캘러스, 이의 배양액 및 이의 추출액은 세포독성이 없고, 유의적인 항산화 효과 및 여드름균에 대한 항균 효과를 나타내며, 특히 순수 viniferin과 비교하여 현저한 항산화 및 항균 효과를 가지므로, 상기 포도 캘러스, 이의 배양액 및 이의 추출액은 항산화 및 항균용 조성물의 유효 성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 엡실론 비니페린(epsilon(ε)-Viniferin), 델타 비니페린(delta(δ)-Viniferin) 및 레스베라트롤(resveratrol) 등을 포함하는 포도 캘러스 배양액을 유효성분으로 함유하는 항균 및 항산화용 조성물에 관한 것이다.
전 세계적으로 산업중심사회에서 서비스중심사회로 전환되는 과정에서 인간의 건강이 최대의 화두가 되었다. 석유계 물질을 바탕으로 한 산업사회의 급격한 팽창은 인간에게 편리함을 가져다 주었지만, 급속한 발전의 후유증으로 인해 거주환경이 오염되었을 뿐만 아니라 인간 스스로의 건강을 해치는 상황도 초래하게 되었다. 이에 생활 밀착형 제품들을 중심으로 친환경적인 물질에 대한 관심과 요구가 높아지고 있는 상황이다.
산소는 생명을 유지하는데 꼭 필요한 요소로써 인체에서 호흡이란 과정을 통해 몸 속에서 에너지를 만드는 데에 사용하지만 산소가 우리에게 에너지만 주는 것은 아니다. 산소는 체내에서 음식물과 결합하는 과정 중에 활성산소라는 유해성 산소를 만드는데, 이 활성산소는 우리 몸에 질병을 일으키는 원인으로 작용하고 있으며, 최근에는 의학계가 인간 노화의 주범으로 활성산소를 지목하고 있다. 이에, 활성산소의 독성으로부터 인체를 보호할 수 있는 천연물 유래 항산화제 개발이 꾸준히 이루어지고 있다.
여드름은 모든 연령대에서 대부분의 사람들에게 발생하며, 면포 또는 농포 등을 형성하는 피부질환이다. 여드름의 발생원인은 과도한 피지분비, 호르몬 불균형, 모낭 내 이상 각화 및 Propionibacterium acnes의 증식 및 염증반응 등의 복합적인 요인으로 발생한다. 여드름 원인균인 P. acnes는 혐기성 피부 상재균으로 모낭 내에서 증식하며, 피지의 트리글리세라이드를 리파아제가 가수분해하여 생성되는 유리지방산과 이에 의한 모낭의 자극으로 화학주성인자(chemotactic factor)가 발생하여 염증반응을 일으킨다. P. acnes 감염에 의한 여드름의 치료방법은 항생제 투여가 가장 많이 사용되고 있으나, 항생제의 내성 등에 의해 치료 효과가 떨어질 수 있다. 이에, 여드름 치료에 부작용 및 내성이 없는 생약 유래 물질에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
한편, 식물 유래 다양한 유용 물질(예, 이차 대사산물)을 생물 공학적인 방법으로 생산하려는 많은 연구가 시도되었다. 그 중의 가장 효과적인 생산법이 식물세포 배양법이다. 이 방법은 배양배지와 배양환경 및 다양한 유도인자(elicitor) 처리 등을 통해 효과적으로 이차 대사산물을 생산할 수 있다. 또한, 재배 또는 자연 환경의 제약(고/맹독성 농약, 중금속 오염, 계절적 지배, 기후 조건 등)을 받지 않고도 식물 유래 유용 물질을 연속적으로 그리고 안정적으로 대량생산하는 것이 가능하므로 상업적으로 중요하다고 할 수 있다.
또한, 관련 선행문헌으로 대한민국 등록특허 제10-1253374호(여드름 피부 개선용 화장료 조성물)는 여드름 피부 개선을 위한 화장료 조성물로 김치유산균발효추출물과 대두발효추출물을 이용하고, 대한민국 등록특허 제10-0879032호(천연 항균 및 항염 효과가 있는 항균, 항산화 및 항염 억제제 및 이를 함유하는 화장료 조성물)는 한약재 감초, 지모, 독활, 황백, 황련, 고삼, 황금, 괴화, 자초 혼합 추출물을 이용하여, 항균 효과가 있는 화장료 조성물을 제공하고 있으나, 포도 캘러스의 여드름 균에 대한 항균 효과 및 항산화 효과는 알려진 바 없다.
이에 본 발명자들은 식물 유래 유용 물질을 대량으로 생산하는 방법을 구축하고, 이를 이용한 기능성 화장료, 건강기능식품 및 약학적 소재를 개발하기 위해 노력한 결과, 본 발명의 포도 캘러스 배양액은 유의적인 항산화 및 항균 효과를 나타내고, 특히 순수 viniferin과 비교하여 현저한 항산화 및 항균 효과를 나타내므로, 상기 포도 캘러스 배양액을 천연물 유래 항산화 및 항균용 약학적 조성물, 화장료 조성물 및 건강식품으로 유용하게 사용될 수 있음을 밝힘으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 포도 캘러스, 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액 및 캘러스 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항균용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 포도 캘러스, 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액 및 캘러스 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항균용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 포도 캘러스, 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액 및 캘러스 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 여드름 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 포도 캘러스, 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액 및 캘러스 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항균용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 포도 캘러스, 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액 및 캘러스 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 여드름 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
아울러, 본 발명은 포도 캘러스, 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액 및 캘러스 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항균용 건강식품을 제공한다.
본 발명의 포도 캘러스, 이의 배양액 및 이의 추출액은 세포독성이 없고, 유의적인 항산화 및 여드름균에 대한 항균 효과를 나타내며, 특히 순수 viniferin과 비교하여 현저한 항산화 및 항균 효과를 가지므로, 상기 포도 캘러스, 이의 배양액 및 이의 추출액은 항산화 및 항균용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 MNT-1 cell에서 Viniferin 및 포도 캘러스 배양액(시료명 A)의 세포독성을 확인한 도이다. 포도 캘러스 배양액(시료명 A)은 Viniferin과 비교하기 위하여 epsilon-Viniferin 함량 기준으로 시료를 희석하여 well에 처리하였다.
도 2는 Raw 264.7cell에서 Viniferin 및 포도 캘러스 배양액(시료명 A)의 세포독성을 확인한 도이다. 포도 캘러스 배양액(시료명 A)은 Viniferin과 비교하기 위하여 epsilon-Viniferin 함량 기준으로 시료를 희석하여 well에 처리하였다.
도 3은 포도 캘러스 배양액(시료명 A) 및 포도 캘러스 배양액의 추출물(시료명 a)의 항산화 효과를 확인하기 위하여 DPPH 분석을 수행한 도이다.
도 4는 포도 캘러스 배양액(시료명 A 및 시료명 C)을 3종의 P. acnes에 처리 72시간 후, P. acnes 생장을 저해하는 최소 농도를 확인한 도이다.
도 5는 포도 캘러스 배양액(시료명 A 및 시료명 C)을 3종의 P. acnes에 처리 72시간 후, P. acnes 생장을 억제하는 최소 농도를 확인한 도이다.
도 6는 포도 캘러스 배양액(시료명 A 및 시료명 C)을 3종의 P. acnes에 처리 48시간 후, P. acnes 생장을 억제하는 최소 농도를 확인한 도이다.
도 7은 원반확산시험을 이용하여 포도 캘러스 배양액의 추출물(시료명 a)의 항균 효과를 확인한 도이다.
도 2는 Raw 264.7cell에서 Viniferin 및 포도 캘러스 배양액(시료명 A)의 세포독성을 확인한 도이다. 포도 캘러스 배양액(시료명 A)은 Viniferin과 비교하기 위하여 epsilon-Viniferin 함량 기준으로 시료를 희석하여 well에 처리하였다.
도 3은 포도 캘러스 배양액(시료명 A) 및 포도 캘러스 배양액의 추출물(시료명 a)의 항산화 효과를 확인하기 위하여 DPPH 분석을 수행한 도이다.
도 4는 포도 캘러스 배양액(시료명 A 및 시료명 C)을 3종의 P. acnes에 처리 72시간 후, P. acnes 생장을 저해하는 최소 농도를 확인한 도이다.
도 5는 포도 캘러스 배양액(시료명 A 및 시료명 C)을 3종의 P. acnes에 처리 72시간 후, P. acnes 생장을 억제하는 최소 농도를 확인한 도이다.
도 6는 포도 캘러스 배양액(시료명 A 및 시료명 C)을 3종의 P. acnes에 처리 48시간 후, P. acnes 생장을 억제하는 최소 농도를 확인한 도이다.
도 7은 원반확산시험을 이용하여 포도 캘러스 배양액의 추출물(시료명 a)의 항균 효과를 확인한 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 포도 캘러스, 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액 및 캘러스 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명에서, 상기 캘러스는 정상적인 기관형성이나 조직분화를 일으키는 능력을 잃은 무정형의 조직 또는 세포 덩어리로서 대부분 유세포로 되어 있으며, 식물체에서 잘라낸 조직을 생장조절제를 함유한 조직배양용 배지에서 배양하거나, 식물체에 상처를 내거나 또는 식물체의 상구에 생장조절제를 처리하였을 때 생기는 특수한 조직 또는 세포덩어리를 말한다.
또한, 상기 파쇄물은 세포를 일반적인 detergent 등을 이용하여 화학적인 방법 또는 프렌치 프레스(French Press) 등을 이용한 물리적인 방법 등으로 파쇄하여 얻은 세포 용해물을 의미하고, 그 방법은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 그 방법은 특별히 제한되지 않는다.
또한, 상기 배양액은 당업계에 공지된 통상적인 방법으로 세포를 배양하는 과정을 거친 후 원심분리(centrifugation), 거름망 여과 등의 물리적인 방법을 이용하여 펠렛을 제거한 나머지 배양액(컨디션드 배지)을 의미하고, 그 방법은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 그 방법은 특별히 제한되지 않는다.
상기 추출물은 캘러스 자체 또는 캘러스 분말, 캘러스 파쇄물, 또는 캘러스 배양액을 당업계에 알려진 통상의 방법에 의하여 추출한 것을 의미하고, 그 방법은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 그 방법은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어 냉침 추출, 열수 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 등이 있다. 추출 용매로는 일반적으로 사용될 수 있는 용매를 사용할 수 있으며, 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3-부틸렌 글리콜 등을 사용할 수 있다.
한편, 상기 포도 캘러스 및 이의 배양액은 하기와 같이 제조되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
1) 포도 조직으로부터 캘러스를 유도하는 단계; 및
2) 상기 유도된 포도 캘러스를 활성유도제 및 가용화제를 첨가하여 배양하는 단계.
상기 단계 1)의 포도는 포도의 꽃, 잎, 줄기, 가지, 열매 및 뿌리로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 부위일 수 있고, 보다 구체적으로 포도의 꽃인 것이 바람직하고, 상기 포도의 품종은 청수, 홍단, 탐나라, 홍이슬, 흑구슬, 흑보석, 수옥, 두누리, 탐금추, 홍아람, 나르샤, 홍소담, 알덴 (Alden), 캠벨얼리(Campbell Early), 델라웨어(Delaware), 더체스(Ductchess), 골든머스캇(Golden Muscat), 힘로드 시드레스 (Himrod Seedless), 쉴러(Schuyler), 홍이두(Beniizu), 거봉 (Kyoho), 피오네(Pione), 슈퍼함부르그(Super Hamburg), 타노레드(Tano Red), 머스캇함부르그 (Muscat Hamburg) 및 시벨 9110 (Seibel 9110)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단계 1)에서 캘러스의 유도는 식물체의 조직 또는 이의 절편체를 조직배양용 배지에서 배양하여 이루어진다. 상기 조직배양용 배지로는 MS(Murashige and Skoog, 1962) 배지, N6(Chu et al., 1975), B5(Gamborg et al., 1968), NN(Nitsch and Nitsch, 1967) 배지, WHITE 배지 등 다양한 식물의 기본 배지를 사용할 수 있다. 또한, 상기 조직배양용 배지는 식물 생장조절제가 첨가된 것을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 식물 생장조절제는 당업계에 공지된 물질을 이용할 수 있으나, 바람직하게는 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 2,4,5-T(2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid), Dicamba(2-methoxy-3,6-dichlorobenzoic acid), IAA(indole-3-acetic acid), IBA(indole-3-butyric acid), MCPA(2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid), NAA(1-naphthylacetic acid), NOA(2-naphthyloxyacetic acid), Picloram(4-amino-2,5,6-trichloropicolinic acid) 등의 옥신(Auxin)류; BAP(6-benzylaminopurine), 2iP(N6-(2-isopentyl)adenine), Kinetin(6-furfurylaminopurine), Thidiazuron(1-phenyl-3-(1,2,3-thiadiazol-5-yl)urea), Zeatin(4-hydroxy-3-methyl-trans-2-butenylaminopurine) 등의 사이토키닌(Cytokinin)류 및 이의 유도체를 포함할 수 있다. 이외에도 조직배양용 배지에는 세포의 분화 및 증식에 작용하는 알카로이드류, 테르페노이드류, 카로테노이드류, 페놀류 화합물 및 천연 추출물 등을 추가로 첨가할 수 있다. 보다 바람직하게는 IAA, NAA, 2,4-D 및 키네틴을 첨가할 수 있고, 보다 더 바람직하게는 0.05~0.2 mg/L IAA, 0.05~0.2 mg/L NAA, 1~2 mg/L 2,4-D 및 0.2~0.3 mg/L 키네틴을 첨가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 단계 2)에서 활성유도제는 메틸 자스몬산, SA 또는 플라젤린 22일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 메틸 자스몬산일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 가용화제는 사이클로덱스트린, 메틸사이클로덱스트린 또는 스테비오사이드(stevioside)일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 스테비오사이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 메틸 자스몬산 및 스테비오사이드는 바람직하게는 각각 50~350 μM 및 40~60 mM의 농도로 첨가할 수 있으며, 보다 바람직하게는 각각 100 μM 및 50 mM의 농도로 첨가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 조성물은 프로피오니박테륨 아크네(Propionibacterium acnes), 스태필로코커스 에피더미스(Staphylococcus epidermis), 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스태필로코커스 사프로파이티커스(Staphylococcus saprophyticus), 슈도모나스 아에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 액티노마이세스 바우마니(Actinomyces baumannii), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 서브틸리스 아종 스피지제니(Bacillus subtilis subsp. spizizenii), 클렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia), 클렙시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca) 및 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)로 구성된 군으로 부터 어느 하나 이상의 균에 대한 항균활성을 갖는 것이 바람직하고, 특히 프로피오니박테륨 아크네(Propionibacterium acnes)에 대하여 유의적인 정균 및 살균 활성을 나타내므로, 상기 조성물은 여드름 예방 및 치료용 약학적 조성물로 사용되는 것이 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 포도 캘러스를 유도한 후, 이의 배양액 및 이의 추출물을 제조한 후, 세포 독성을 확인한 결과, epsilon-Viniferin은 20 μg/ml 내에서만 세포독성이 없었으나, 포도 캘러스 배양액은 epsilon-Viniferin이 100 μg/ml 포함되어 있어도 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였다(도 1 및 도 2 참조).
또한, 본 발명자들은 포도 캘러스 배양액의 항산화 효과를 확인하기 위하여 DPPH 분석을 수행한 결과, epsilon-Viniferin 및 delta-Viniferin은 500μg/ml에서 대조군에 비하여 라디칼이 25% 정도 소거되었으나, 본 발명의 포도 캘러스 배양액(시료명 A) 및 포도 캘러스 배양액의 추출물(시료명 a)의 경우 500 μg/ml(epsilon-Viniferin 함량 기준)에서 라디칼이 60% 이상 소거되는 것을 확인하였다(도 3 참조).
또한, 본 발명자들은 포도 캘러스 배양액의 항균 효과를 확인한 결과, 본 발명의 포도 캘러스 배양액은 여드름 균에 대하여 유의적인 살균 및 정균 효과를 나타내며 특히 순수 viniferin과 비교하여 현저한 항균 효과를 나타냄을 확인하였다(도 4 내지 도 7 참조).
따라서, 본 발명의 포도 캘러스, 이의 배양액 및 이의 추출액은 세포독성이 없고, 유의적인 항산화 효과를 나타내며, 여드름균에 대한 현저한 항균 효과를 나타내므로, 항산화 및 항균용 조성물의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효 성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물(예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름(예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하 주사에 의해 투여될 수 있다. 이때, 비경구 경로로는 경피 투여가 바람직하며, 그 중에서도 도포에 의한 국부 투여(topical application)가 가장 바람직하다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 경구 투여량은 성인 기준으로 0.001-100 ㎎/kg(체중) 범위 내이다. 또한 외용제인 경우에는 성인 기준으로 1.0 내지 3.0 ㎖의 양으로 1일 1회 내지 5회 도포하여 1개월 이상 계속할 수 있다. 다만, 상기 투여량은 본 발명의 범위로 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 포도 캘러스, 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액 및 캘러스 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항균용 화장료 조성물을 제공한다.
상기 포도 캘러스, 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액 및 캘러스 추출물, 이의 효과에 대해서는 상기 항산화 및 항균용 조성물에 대한 설명과 동일한바, 구체적인 설명은 상기 내용을 원용하고, 이하에서는 화장료 조성물에 특유한 구성에 대해서만 설명하도록 한다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 유효 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예컨대, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 항료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 보다 상세하게는, 영양 크림, 수렴 화장수, 유연 화장수, 로션, 에센스, 영양젤 또는 마사지 크림 등의 제형으로 제조될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형이 계면활성제-함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
아울러, 본 발명은 포도 캘러스, 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액 및 캘러스 추출물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 항산화 및 항균용 건강식품을 제공한다.
상기 포도 캘러스, 캘러스 파쇄물, 캘러스 배양액 및 캘러스 추출물, 이의 효과에 대해서는 상기 항산화 및 항균용 조성물에 대한 설명과 동일한바, 구체적인 설명은 상기 내용을 원용하고, 이하에서는 건강식품 조성물에 특유한 구성에 대해서만 설명하도록 한다.
본 발명에 따른 건강식품은 유효 성분 이외에 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 다이사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제[타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)]를 사용할 수 있다.
유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강 식품 중의 상기 유효 성분의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량으로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효 성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강식품이 건강 음료 조성물로 제조되는 경우에는 본 발명의 유효 성분 이외에 구연산, 액상 과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
또한, 상기 건강식품은 상술한 성분 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 건강식품은 천연 과일 쥬스, 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 포도 캘러스 배양액의 제조
<1-1> 포도 캘러스 유도
포도 품종으로 켐벨(Vitis vinifera L. cv Campbell Early)을 이용하여 포도 조직으로부터 캘러스를 유도한 후 증식하였다.
구체적으로, 포도의 꽃을 절취하여 흐르는 물로 세척한 다음 70% 에탄올 용액에 1분간 침지하여 표면살균을 실시하였다. 표면살균은 무균작업대 내에서 포도 꽃 조직을 유리병에 담고 상업용 락스(약 1% sodium hypochlorite) 용액으로 15분간 실시하였으며 멸균 증류수로 3회 세척하였다. 표면살균이 완료된 조직은 멸균 여과지를 이용하여 남은 습기를 제거하고 배양에 사용하였다. 표면살균이 완료된 포도의 꽃 조직을 메스를 이용하여 절취한 다음 각각의 조직(꽃잎, 꽃밥, 수술대)을 배양배지에 치상하였다. 포도 캘러스 유도에 사용된 배지는 [표 1]에 나타내었으며, 생장조절제로 0.1 mg/L IAA, 0.1 mg/L NAA, 1.5 mg/L 2,4-D 그리고 0.25 mg/L 키네틴이 첨가된 배지를 사용하였다. 배양조건은 25℃ 항온기에서 암배양을 실시하였다. 배양 후 형성된 백색의 캘러스는 동일조성의 고체배지에 약 4주 간격으로 계대배양을 실시하였다.
| (mg/L) | |
| KNO3 | 2,500 |
| (NH4)2SO4 | 134 |
| MgSO4·7H2O | 250 |
| MnSO4·1H2O | 10 |
| ZnSO4·7H2O | 2 |
| CuSO4·5H2O | 0.025 |
| NH4H2PO4 | 150 |
| NaH2PO4 | 150 |
| KCl | 300 |
| KI | 0.75 |
| CoCl2·6H2O | 0.025 |
| CaCl2·2H2O | 150 |
| H3BO3 | 3 |
| Na2MoO4·2H2O | 0.25 |
| FeSO4·7H2O | 27.85 |
| Na2-EDTA | 37.25 |
| Thiamine HCl | 10 |
| Nicotinic acid | 1 |
| Pyridoxine HCl | 1 |
| myo-inositol | 100 |
| IAA | 0.1 |
| NAA | 0.1 |
| 2,4-D | 1.5 |
| Kinetin | 0.25 |
| Sucrose | 20,000 |
| Gelrite | 4,000 |
| pH = 5.8. sterilized at 121˚C for 15 minutes |
|
<1-2> 포도 캘러스 배양액 회수
상기 실시예 <1-1>에서 유도되어 안정화된 포도 캘러스를 배양하여 포도 캘러스 배양액을 회수하였다.
구체적으로, 상기 실시예 <1-1>에서 유도되어 안정화된 포도 캘러스를 1 mg/L 2,4-D가 포함된 MS(Murashige & Skoog) 배지를 칭하는 MS1D(MS 4.4g, 수크로스 30 g, MES 0.5 g, 미오-이노시톨 0.1 g, 티아민 HCl 0.4 mg, 2,4-D 1 mg/L) 액체배지 100 ㎖에 10 g씩 3개 플라스크에 각각 접종한 후 25℃, 90rpm으로 14일간 배양하였다. 14일간 배양하여 증식한 캘러스를 미리 멸균하여 건조한 3L 바이오리액터에 모두 계대한 후 1.2L의 MS1D 액체배지를 추가하였다. 7일간 배양 후 100 μM MeJA(methyl jasmonate)와 50 mM 스테비오사이드를 함께 처리하였으며, 이후 배양 5일째 시료를 거름망에 걸러 캘러스와 캘러스 배양액으로 분리함으로써, 포도 캘러스 배양액(시료명 A)을 획득하였다.
아울러, 상기 제조한 포도 캘러스 배양액 내 존재하는 epsilon-Viniferin, delta-Viniferin 및 resveratrol의 함량을 측정한 결과는 표 2에 나타낸 바와 같다.
한편, epsilon-Viniferin, delta-Viniferin 및 resveratrol의 함량은 상기 포도 캘러스 배양액(시료명 A) 20 ㎖에 같은 부피의 에틸아세테이트를 넣고 잘 섞은 후 에틸아세테이트 층을 회수하고 증발기를 이용하여 에틸아세테이트를 제거하였다. 최종적으로 에탄올 1㎖에 녹인 다음 적당량으로 희석하여 HPLC로 엡실론-비니페린, 델타-비니페린, 레스베라트롤 각각의 함량을 분석하였다.
<1-3> 포도 캘러스 배양액의 추출물의 제조
상기 실시예 <1-2>에서 획득한 포도 캘러스 배양액(시료명 A)을 에틸아세테이트로 추출하여 포도 캘러스 배양액의 추출물(시료명 a)을 제조하였다.
구체적으로 상기 실시예 <1-2>에서 획득한 포도 캘러스 배양액 (시료명 A) 20㎖에 같은 부피의 에틸아세테이트를 넣고 잘 섞은 후 에틸아세테이트 층을 회수하고 증발기를 이용하여 에틸아세테이트를 제거하였다. 최종적으로 에탄올 1㎖에 녹여서 캘러스 배양액의 추출물(시료명 a)을 제조하였다.
아울러, 상기 <1-2>와 동일한 방법으로 캘러스 배양액의 추출물(시료명 a) 내 epsilon-Viniferin, delta-Viniferin 및 resveratrol의 함량을 측정하였고, 그 결과 하기 표 2에 나타내었다.
<1-4> 시료 C의 제조
상기 실시예 <1-2>에서 플라스크에 접종하여 14일간 배양하여 증식한 캘러스를 바이오리액터 대신에 미리 멸균하여 건조한 플라스크에 계대한 후 300㎖의 MS1D 액체배지를 추가하였다. 7일간 배양 후 100 μM MeJA(methyl jasmonate)와 50 mM 스테비오사이드를 함께 처리하였으며 이후 배양 5일 째 시료를 거름망에 걸러 캘러스와 캘러스 배양액을 분리함으로써 포도 캘러스 배양액(시료명 C로 명명)을 획득하였다.
| 시료명 | 시료 조성(μg/ml) | ||
| e-viniferin | resveratol | d-viniferin | |
| A | 571.66 | 65.49 | 85.45 |
| a | 11433.12 | 1309.03 | 1709.00 |
| C | 1780 | 850 | 169570 |
<1-5> delta-Viniferin의 분리 정제
상기 <1-2>에서 제조한 포도 캘러스 배양액을 물과 에틸아세테이트로 분배 추출하여 얻어진 에틸아세테이트 층을 감압 농축하였다. 얻어진 농축물(15 g)을 MPLC 기기를 이용하여 역상 칼럼(10 × 30 cm)을 1단계 분리를 실시하였다. 이때 용리용매는 물-아세토나이트릴을 이용하였으며 물-아세토나이트릴 혼합용액을 100:1에서 100% 아세토나이트릴까지 극성을 낮추며 용리시켜 7개의 분획물(A-G)을 얻었다. 목표 화합물인 비니페린(trance-d-viniferin, 하기 화학식 1)이 다량 함유된 분획 C를 농축하여 농축물 1.3g을 얻었다. 얻어진 농축물 1.3g을 Recylcing LC 기기를 이용하여 역상 칼럼 크로마토그래피를 물-아세토나이트릴(2:2) 혼합용매 조건에서 실시하여 80% 이상 순도의 비니페린 160mg을 얻었다. 얻어진 분획물을 95% 메탄올로 용리시키는 겔크로마토그래피(Sephadex LH-20)를 실시하여 98% 순도의 비니페린 12mg을 얻었다. 얻어진 화합물의 구조는 1H-NMR, 13C-NMR, 2D-NMR, DEPT 및 질량분석기를 이용하여 규명하였다.
trans-δ-Viniferin: 1H-NMR (400 MHz, Acetone-d 6)δ 7.45 (1H, dd, J = 8.5, 2.0 Hz, H-14b), 7.27 (1H, s, H-10b), 7.25 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2(6)a), 7.07 (1H, d, J = 16.5 Hz, H-7b), 6.92 (1H, d, J = 16.5 Hz, H-8b), 6.88 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-13b), 6.86 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3(5)a), 6.55 (2H, d, J = 2.0 Hz, H-2(6)b), 6.29 (1H, t, J = 2.0 Hz, 12a), 6.27 (1H, t, J = 2.0 Hz, H-4b), 6.21 (2H, d, J = 2.0, H-10(14)a), 5.47 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-7a), 4.48 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-8a); 13C-NMR (100 MHz, Acetone-d 6) δ 159.7 (C-12b), 158.8 (C-11(13)a), 158.6 (C-3(5)b), 157.5 (C-4a), 144.3 (C-9a), 139.8 (C-1b), 131.6 (C-11b), 131.2 (C-1a), 130.8 (C-9b), 128.2 (C-7b), 127.7 (C-14b), 127.6 (C-2(6)a), 126.3 (C-8b), 123.0 (C-10b), 115.2 (C-3(5)a), 109.2 (C-13b), 106.4 (C-10(14)a), 104.7 (C-2(6)b), 101.8 (C-4b), 101.4 (C-12a), 93.1 (C-7a), 56.9 (C-8a).
<1-6> epsilon-Viniferin의 분리 정제
상기 <1-2>에서 제조한 포도 캘러스 배양액을 물과 에틸아세테이트로 분배 추출하여 얻어진 에틸아세테이트 층을 감압 농축하였다. 얻어진 농축물(10 g)을 MPLC 기기를 이용하여 역상 칼럼(10 × 30 cm)을 1단계 분리를 실시하였다. 이때 용리용매는 물-아세토나이트릴을 이용하였으며 물-아세토나이트릴 혼합용액을 70:1에서 100% 아세토나이트릴까지 극성을 낮추며 용리시켜 5개의 분획물(A-E)을 얻었다. 목표 화합물인 비니페린(trance-ε-viniferin, 하기 화학식 2)이 다량 함유된 분획 B를 농축하여 농축물 1.5g을 얻었다. 얻어진 농축물 1.5g을 Recylcing LC 기기를 이용하여 역상 칼럼 크로마토그래피를 물-아세토나이트릴(2:1) 혼합용매 조건에서 실시하여 85% 이상 순도의 비니페린 100mg을 얻었다. 얻어진 분획물을 95% 메탄올로 용리시키는 겔크로마토그래피(Sephadex LH-20)를 실시하여 98% 순도의 비니페린 30mg을 얻었다. 얻어진 화합물의 구조는 1H-NMR, 13C-NMR, 2D-NMR, DEPT 및 질량분석기를 이용하여 규명하였다.
trans-ε-viniferin 1H-NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.14 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-2(6)a), 7.03 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-2(6)b), 6.80 (1H, d, J = 13.6 Hz, H-7b), 6.78 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3(5)a), 6.65 (2H, d, J = 8.0 Hz, H-3(5)b), 6.56 (1H, d, J = 13.6 Hz), 6.28 (1H, brs, H-12b), 6.21 (1H, brs, H-12a), 6.18 (2H, brs, H-10a,14a), 5.37 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-7a), 4.35 (1H, d, J = 4.0 Hz, H-8a); 13C-NMR (100 MHz, MeOD) δ 161.3 (C-11b), 158.6 (C-11a, 13a), 158.3 (C-13b), 157.1 (C-4a), 156.9 (C-4b), 146.0 (C-9a), 135.6 (C-9b), 132.5 (C-1a), 129.1 (C-1b, 7b), 127.5 (C-2(6)b), 127.0 (C-2(6)a), 122.4 (C-8b), 118.8 (C-10b), 115.1 (C-3(5)b), 115.1 (C-3(5)a), 106.3 (C-14a, 10a), 103.1 (C-14b), 101.0 (C-12a), 95.6 (C-12b), 93.5 (C-7a), 56.9 (C-8a).
<실험예 1> 포도 캘러스 배양액의 세포 독성 확인
포도 캘러스 배양액, epsilon-Viniferin 및 delta-Viniferin의 세포독성 유무를 확인하기 위하여, MNT-1, Raw264.7세포를 이용하여 MTT assay를 수행하였다.
구체적으로, Raw264.7(murine macrophage)은 10% FBS와 1% gentamicine이 첨가된 DMEM(High glucose)배지에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였고, MNT-1(human melanoma cell)은 20% FBS와 1% gentamicine이 첨가된 DMEM/MEM(High glucose)배지에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하였다. 그런 다음, MNT-1(104 cell/well), Raw264.7(2x104 cell/well)을 각각 96well에 배양하고, 시료를 배지로 희석한 후, 각 well에 처리하였다. 24시간 후 MTT 용액을 100 μg/mL 농도로 처리하고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 1시간 반응시켰다. 그런 다음 배양액을 모두 제거하고 각 well에 acid-isopropanol 100 μl씩 넣는 후, 570 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다. 아울러, 시료는 Viniferin과 비교하기 위하여 epsilon-Viniferin 함량 기준으로 시료를 희석하여 well에 처리하였다.
그 결과, 도 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이 epsilon-Viniferin은 20 μg/ml 내에서만 세포독성이 없었으나, 포도 캘러스 배양액(시료명 A)은 epsilon-Viniferin이 100 μg/ml 포함되어 있어도 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였다(도 1 및 도 2).
<실험예 2> 포도 캘러스 배양액의 항산화 효과 확인
포도 캘러스 배양액의 항산화 효과를 확인하기 위하여 DPPH 분석을 수행하였다.
구체적으로 80% 메탄올을 이용하여 0.2 mM DPPH(1,1-Diphenyl-2-picryhydrazyl)용액을 제조한 후, DPPH 180 μl와 시료 20 μl를 잘 혼합하여 상온에서 10분간 반응 시킨 후, 517nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다. 한편, 시료는 Viniferin과 비교하기 위하여 epsilon-Viniferin 함량 기준으로 시료를 희석하여 well에 처리하였다. 또한 control로는 시료 대신 시료의 희석 용매에 DPPH시약을 넣어 사용하였다. 양성대조군으로 ascorbic acid를 처리하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 epsilon-Viniferin 및 delta-Viniferin은 500μg/ml에서 대조군에 비하여 라디칼이 25% 정도 소거되었으나, 본 발명의 포도 캘러스 배양액(시료명 A) 및 포도 캘러스 배양액의 추출물(시료명 a)의 경우 500 μg/ml(epsilon-Viniferin 함량 기준)에서 라디칼이 60% 이상 소거되는 것을 확인하였다(도 3).
<실험예 3> 포도 캘러스 배양액의 항균 효과 확인
<3-1> 여드름 균의 배양
포도 캘러스 배양액의 여드름 균에 대한 항균효과를 확인하기 위하여 Propionibacterium acnes (KCTC 3314, KCTC 3320, KCTC 5012)은 RCM(Reinforced Clostridial Medium)에서 37℃, anaerobic 조건으로 배양하였다.
<3-2> 여드름 균에 대한 MIC (minimum inhibitory concentration) 확인
MIC는 항균물질의 정균 특징을 측정하는 지표로 본 발명의 포도 캘러스 배양액을 500nM ~3.91nM 사이의 농도로 희석한 후, 3종의 P. acnes의 생장을 저해하는 최소 농도를 확인하였다.
구체적으로 상기 <3-1>에서 배양한 3종의 P. acnes를 RCM 액체배지 5ml에 anaerobic 조건으로 72시간 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 또한, 96well plate에 최고농도부터 DW로 1/2씩 희석하여 8개의 농도로 Master plate를 제조하였다. 그런 다음, 희석한 각각의 시료 50μl를 다른 96well plate에 옮겨 담았다. 상기 3종의 P. acnes를 1x106 cell/50ul가 되도록 희석하고(in 2xRCM), 균 50 μl (1x106 cell)를 각각 시료가 들어있는 96 well plate로 옮겨 담았다.
MIC를 측정하기 위하여 Microplate Reader로 0시간 OD600nm를 측정하였다. 그런 다음, 상기 96well plate를 anaerobic 조건으로 72시간 37℃ 인큐베이션에서 배양 후, Microplate Reader로 72시간 OD600nm를 측정한 후, 72시간 OD값에서 0시간 OD값을 빼준 후 Control과 시료 농도에 따른 P. acnes 3종의 생장을 비교하고, OD값 비교를 통해 항균활성을 확인하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 포도 캘러스 배양액(시료명 A)은 P. acnes 3320, 3314, 5012에 대해 각각 평균 151.72nM, 176.02nM, 117.45nM 농도에서 생장을 저해함을 확인하였고, δ-viniferin 함량이 높은 포도 캘러스 배양액(시료명 C)은 P. acnes 3320, 3314, 5012에 대해 각각 평균 88.43nM, 133.19nM, 80.15nM 농도에서 생장을 저해함을 확인하였다. 반면에 순수 ε-viniferin과 순수 δ-viniferin은 P. acnes 3종에 대한 생장저해를 나타내지 않음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 포도 캘러스 배양액은 순수 viniferin과 비교하여 현저한 정균 활성을 나타냄을 확인하였다.
<3-3> 여드름 균에 대한 MBC (minimum bactericidal concentration) 분석
MBC는 항균물질의 살균 특징을 측정하는 지표로 본 발명의 포도 캘러스 배양액을 500nM ~3.91nM 사이의 농도로 희석한 후, 3종의 P. acnes의 생장을 억제하는 최소 농도를 확인하였다.
구체적으로 상기 <3-1>의 MIC를 측정한 plate를 이용하여 최소 살균 농도를 측정하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 MBC를 통해 항균물질의 72 시간 살균을 측정한 결과, 포도 캘러스 배양액(시료명 A)은 P. acnes 3320, 3314, 5012에 대해 각각 125nM에서 가장 생장억제 효과가 높은 것을 확인하였다. 또한, 포도 캘러스 배양액(시료명 C)은 P. acnes 3320, 5012에 대해 125nM, P. acnes 3314에 대해 62.5nM 농도에서 생장 억제가 가장 많이 나타나는 것을 확인하였다.
또한, 도 6에 나타낸 바와 같이 MBC를 통해 항균물질의 48hr 살균을 측정한 결과, 포도 캘러스 배양액(시료명 A)는 P. acnes 3320, 3314에 대해 각각 125nM에서 가장 생장억제 효과가 높은 것을 확인하였고, P. acnes 5012에 대해서는 62.5nM에서 생장이 억제되는 것을 확인하였다. 또한, 포도 캘러스 배양액(시료명 C)은 P. acnes 3320, 5012에 대해 62.5nM, P. acnes 3314에 대해 125nM 농도에서 생장억제가 가장 많이 나타나는 것을 확인하였다.
아울러, 48시간, 72시간 모두에서 순수 ε-viniferin과 순수 δ-viniferin은 P. acnes 3종에 대한 생장저해를 나타내지 않음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 포도 캘러스 배양액은 순수 viniferin과 비교하여 현저한 살균 활성을 나타냄을 확인하였다.
<3-4> 원반확산시험을 통한 항균 효과 확인
원반확산시험은 박테리아의 항균제 민감도 검사법으로 항균효과가 있을 경우 disk paper 주변에 clear zone이 형성되며, clear zone 형성 정도를 통해 항균 능력을 측정할 수 있다.
구체적으로 P. acnes 3320을 RCM 액체배지 5ml에 anaerobic 조건으로 72시간 37℃ incubator에서 배양하였다. 그런 다음, 5x105 ~ 1x106으로 희석한 균을 면봉에 적신 후 RCM agar 배지에 골고루 도말하였다. Disk paper를 agar plate 위에 올려 놓고, 원액의 시료로 disk paper를 적신 후, Anaerobic 조건으로 72시간 37℃ incubator에서 배양한 다음, Vernier Caliper를 이용하여 clear zone 크기를 측정하였다.
그 결과, 도 7 및 표 3에 나타낸 바와 같이 포도 캘러스 배양액의 추출물(시료명 a)을 ε-viniferin 기준으로 5 μg 및 10 μg 처리하였을 때, P. acnes 2종(P. acnes 3320, 5012)에 대한 항균성이 나타났으며, 구체적으로 대조군인 50% EtOH 처리군에서 8mm clear zone이 나타났으나, 본 발명의 포도 캘러스 배양액의 추출물(시료명 a)을 ε-viniferin 기준으로 5 μg 및 10 μg 처리하였을 때 8mm 이상의 clear zone이 나타나므로 본 발명의 포도 캘러스 배양액의 추출물(시료명 a)이 여드름균에 대한 항균활성을 나타냄을 확인하였다.
| 샘플 | clear zone diameter(mm) | |||
| 1차 | 2차 | 평균 | ||
| 순수 | ε-viniferin 10μg | 0 | 0 | 0 |
| ε-viniferin 5μg | 0 | 0 | 0 | |
| 본 발명의 시료명 a | ε-viniferin 10μg | 10.25±0.35 | 10±0 | 10.13±0.25 |
| ε-viniferin 5μg | 9.5±0 | 9±0 | 9.25±0.28 | |
Claims (4)
- 포도 캘러스 배양액의 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 화장료 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 포도 캘러스는 포도의 꽃, 잎, 줄기, 가지, 열매 및 뿌리로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 부위로부터 유래된 것을 특징으로 하는 항산화용 화장료 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 포도 캘러스는 활성유도제 및 가용화제를 첨가한 배지에서 배양하고, 상기 활성유도제 및 가용화제는 각각 메틸 자스몬산(methyl jasmonate) 및 스테비오사이드(stevioside)인 것을 특징으로 하는 항산화용 화장료 조성물.
- 포도 캘러스 배양액의 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화용 건강식품.
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