KR102236332B1

KR102236332B1 - 항노화, 항산화, 피부 재생 및 피부 면역을 위한 식물 컴플렉스 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102236332B1
Application number: KR1020190033061A
Authority: KR
Inventors: 강태균; 모상현; 윤란애; 박신애; 이정훈; 김혜인
Original assignee: (주)캣뷰티; 주식회사 바이오에프디엔씨
Priority date: 2019-03-20
Filing date: 2019-03-20
Publication date: 2021-04-06
Also published as: KR20200113125A

Abstract

본 발명은 항노화, 항산화, 피부 재생 및 피부 면역을 위한 식물 컴플렉스 화장료 조성물로써, 식물세포 컴플렉스 배양물 또는 그 추출물을 함유하는 피부개선용 화장료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는, 사과세포배양추출물, 포트마리골드추출물, 해바라기추출물, 중국체이스트트리추출물, 포도추출물, 라벤더추출물, 에델바이스추출물, 라이코펜, 베타카로틴, 커큐민, 안토시아닌, 항산화 물질 및 면역증강물질을 유효성분으로 함유함으로써, 항염, 피부 생기 부여, 피부재생, 피부 활력 증대, 피부 보습, 피부 장벽 기능 보호, 청색광, 외부 환경스트레스로부터의 피부 보호, 항산화, 항노화 등의 기능을 가진 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

항노화, 항산화, 피부 재생 및 피부 면역을 위한 식물 컴플렉스 화장료 조성물{A plant complex cosmetic composition for anti-aging, anti-oxidant, skin regeneration and skin immune}

인간의 피부는 나이가 들어감에 따라 여러 가지 내적, 외적 요인에 의해 변화를 겪는다. 내적으로는 신진대사를 조절하는 각종 호르몬의 분비가 감소하고, 면역 세포의 기능과 세포들의 활성이 저하되어 생체에 필요한 면역 단백질 및 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 된다. 외적으로는 오존층 파괴로 인하여 태양광선 중 지표에 도달하는 자외선의 함량이 증가하고 환경오염이 더욱 심화됨에 따라 자유 라디칼 및 활성 유해 산소 등이 증가함으로써, 피부의 두께가 감소하고, 주름이 증가하며, 탄력이 감소될 뿐 아니라 피부 트러블이 자주 발생하는 등 여러 가지 변화를 일으키게 된다.

한편, 컬러 테라피(color therapy)란, 색채의 전달을 통해 정서적, 정취적인 안정을 얻고 삶의 활력을 키우는 일종의 치료 요법이다. 빛의 한 형태인 색은 각각의 고요한 진동수와 파장을 지니는 일종의 에너지로, 다양한 진동수와 파장을 이용해 우리 몸의 신체조직을 활성화시키기도 하고 억제시키기도 하여 치료에 긍정적인 효과를 나타낸다. 이는 색이 가진 에너지와 성질을 이용해 심리적인 영역을 포함하여 인체에 직접 물리적인 영향을 미치는 효과를 유도하는 친환경적인 테라피인 것이다.

얼마 전까지만 해도 현대적인 각종 의학 치료법들의 발달로 컬러 테라피는 진지하게 연구하거나 조사해야 하는 가치 있는 영역으로 간주되지 않았다. 하지만 최근 미국에서 여러 의학자들에 의해 색채를 통한 다양한 치료에 대한 효과 및 효능 연구가 다방면으로 진행되면서 21세기의 새로운 대체 보완 의학으로 주목을 받고 있다. 인간의 시각은 뇌 활동의 70%를 담당하며, 시각적 요소 중 색이 차지하는 비율은 30%로, 인간의 정신 및 육체에 영향을 주며, 자극을 줌으로써 인체의 에너지 패턴을 조절하여 신체의 질서와 균형 회복에 도움을 줄 수 있기 때문이다.

특히 컬러 테라피는 헤어, 피부, 메이크업, 네일아트 등의 미용 분야에도 다양하게 활용될 수 있으며, 컬러 테라피를 적용한 화장품은 그 효과가 배로 증폭되는 등 본래의 기능에 긍정적인 영향을 미쳐 피부 관리에 활용되는 연구에 대한 논의가 활발해지고 있다.

대한민국등록특허 10-1922601

본 발명자들은, 사과세포배양추출물, 포트마리골드추출물, 해바라기추출물, 중국체이스트트리추출물, 포도추출물, 라벤더추출물, 에델바이스추출물, 라이코펜, 베타카로틴, 커큐민, 안토시아닌, 항산화 물질 및 면역증강물질이, 항염, 피부 생기 부여, 피부 활력 증대, 피부 보습, 피부 장벽 기능 보호, 청색광, 외부 환경스트레스로부터의 피부 보호, 항산화, 항노화 등 다양한 기능성 화장료 소재가 될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 사과세포배양추출물, 포트마리골드추출물, 해바라기추출물, 중국체이스트트리추출물, 포도추출물, 라벤더추출물, 에델바이스추출물, 라이코펜, 베타카로틴, 커큐민, 안토시아닌, 항산화 물질 및 면역증강물질을 유효성분으로 함유함으로써, 항염, 피부 생기 부여, 피부 활력 증대, 피부 재생, 피부 면역, 피부 보습, 피부 장벽 기능 보호, 청색광, 외부 환경스트레스로부터의 피부 보호, 항산화, 항노화를 위한 화장료 조성물 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은, 상기 사과세포배양추출물, 포트마리골드추출물, 해바라기추출물, 중국체이스트트리추출물, 포도추출물, 라벤더추출물, 에델바이스추출물, 라이코펜, 베타카로틴, 커큐민, 안토시아닌, 항산화 물질 및 면역증강물질을 유효성분으로 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 과제를 해결하고자, 본 발명은 사과세포배양추출물, 포트마리골드추출물, 해바라기추출물, 중국체이스트트리추출물, 포도추출물, 라벤더추출물, 에델바이스추출물, 라이코펜, 베타카로틴, 커큐민, 안토시아닌, 항산화 물질 및 면역증강물질을 유효성분으로 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다.

본 발명자들은 7가지 천연 식물인 사과(빨간색), 포트마리골드(카렌듈라)(주황색), 해바라기(노란색), 체이스트트리(초록색), 포도(파랑·남색), 라벤더(보라색), 에델바이스(흰색)를 선정하여 시각적으로 컬러 테라피 효과를 가짐과 동시에 유용성분을 다량 함유하도록 피부 효능에 좋고, 건강함을 부여할 수 있는 화장품 원료로 활용하였다.

피토케미컬은 식물을 뜻하는 영어 피토(phyto)와 화학을 뜻하는 케미컬(chemical)의 합성어이다. 식물의 뿌리나 잎에서 만들어지는 모든 화학물질을 통틀어 일컫는 개념으로 이는 식물이 병원균이나 해충, 미생물 등으로부터 스스로를 보호하기 위해 만들어내는 일종의 보호물질이다.

특히 채소나 과일 내 다량 함유돼 있는데, 각 채소와 과일의 고유 컬러를 나타내는 성분이기도 하다. 색깔별로는 붉은색·주황색·노란색·보라색·녹색 등 화려하고 짙은 색소에 많이 들어 있다. 그 밖에 흰색을 띠는 마늘류·버섯류, 검은색을 띠는 콩류·곡물류에도 피토케미컬이 들어 있다.

생명유지를 위해 반드시 섭취해야 하는 필수영양소는 아니지만 인체에 들어가면 다양한 생리 활성 기능인 항산화 작용, 세포 손상 억제, 면역기능 향상 등에 도움을 줘 '제7의 영양소' 로도 불린다. 버드나무 껍질에서 추출한 아스피린, 말라리아 특효약 퀴닌, 발암물질 생성을 억제하는 플라보노이드, 카로티노이드 등이 대표적으로 사용되는 피토케미컬의 일종이다. 비타민과 무기염류가 풍부하고 암예방, 항산화작용, 혈중 콜레스테롤 저하, 염증 감소 등의 효과가 있는 것으로 밝혀지면서 의약품이나 식품 원료 등으로 개발하기 위한 연구가 활발하게 이루어지고 있다.

빨간색은 생명, 힘, 활기를 상징하고 강력한 에너지원이며 자극제의 역할도 한다. 헤모글로빈에 영향을 주어서 에너지를 증가시키고, 체온을 높이며, 순환을 돕는 기능을 하기 때문에 마비를 치료하는데 사용된다. 보색인 청록색과 함께 사용하면 빨강색은 감염의 방지를 돕는다. 빨강색은 박테리아가 침입한 곳에 혈액 공급을 증가시키고 보색인 청록색은 염증을 제거하고 정화작용을 돕는다.

주황색은 조화를 우선시하는 안정과 기쁨의 색으로 삶의 원만한 인간관계 조성에 도움을 주며, 신체적인 면과 정신적인 면 사이의 균형을 이룰 수 있게 해준다. 또한 생각과 느낌의 자유를 주며 신체가 자연스럽고 흥겹게 움직일 수 있도록 도와준다. 생화학, 즉 구조에 변화를 일으켜 우울증을 몰아내게 해서 이 색채는 자살충동을 느끼는 사람에게 사용하면 좋다. 또한 신장과 쓸개에 있는 결석치료에 주로 사용한다.

노란색은 정신과 지성의 상징이고 사고력과 지적인 힘을 나타내고 정신적인 활동을 고무시킨다. 초연함의 색채이기 때문에 강박적인 생각이나 감정, 습관으로부터 초연할 수 있도록 돕는다. 사람의 나약함을 드러내도록 하며 가슴깊이 내재된 문제를 풀어내는데 도움을 주기 때문에 카운슬링과 관련하여 사용하면 효과적이다. 신경을 강화하고 보다 높은 정신활동을 불러일으키고 신체의 운동신경을 활성화시키므로 근육에 에너지를 생기게 한다. 피부조직을 개선시키므로 피부에 난 상처를 소독하고 치료하거나 습진 같은 병을 치료할 수 있다. 또 관절부위에 쌓인 칼슘을 분해하는 것을 돕기 때문에 류마티스나 관절염 치료에도 도움을 준다.

초록색은 조화의 색으로 스펙트럼상의 중간에 있는 색채로 뜨겁거나 차갑지도 않은 중성 색채에 가깝다. 이것은 균형과 조화, 안정의 색채이기 때문에 부정적이거나 긍정적인 인간의 에너지를 조화롭게 만드는 힘을 가지고 있다. 이 색채는 인간의 세 가지 측면을 조화시킬 수도 있는데 몸, 마음, 영혼을 조화시켜 전체성을 창조하는 것이다. 초록색은 전염병에 사용될 수 있는 방역성의 속성을 가진다. 또한 해독이나 심장질환에도 사용된다.

파란색은 심리적으로 가장 안정적인 효과를 주는 색으로, 시원한 이미지와 함께 사람을 느긋하게 하고 확장된 느낌을 받도록 하는 색채이고 긴장, 두려움, 가슴이 두근거리는 것, 불면증을 치료하는데 유용하다. 흥분을 가라앉게 하며 후두염, 편도선염, 갑상선 종과 목의 통증을 치료하는데 사용될 수 있다. 갑상선을 활성화시키고 따라서 신진대사와 체온조절을 한다. 파란색은 면역체계에 강한 영향을 주고 전염병, 폐혈증, AIDS 치료에 사용한다.

남색은 마음을 넓게 만들고 두려움이나 억압으로부터 마음을 자유롭게 한다. 마음과 관련되어 있기 때문에 이 색채는 신체에 영향을 주고 정신적인 불안에서 벗어나게 하는데 효과가 있다. 눈과 귀에 관련이 있는 색채이며 그렇기 때문에 이런 기관들과 관련된 질병에 사용된다. 또한 남색은 송과선을 활성화시키기 때문에 소뇌와 중추신경계, 내분비선, 그중에서도 세레토닌과 멜라토닌을 자극한다. 그러므로 신체 전반에 걸쳐 호르몬 활동과 무의식적 과정들, 상상력, 통찰력, 직관력과 심리적인 능력을 향상시킨다.

보라색은 숭고함, 자기존중, 품위와 관련이 있다. 진정한 자아나 내적인 신성과 결합하기 위해 최후의 관문인 영적인 인식의 영역으로 인도한다. 치료에 사용할 때 이 색채는 약한 세포구조를 재 강화시키고 에너지를 회복하도록 돕는다. 정신분열증과 같은 정신적인 질병에 매우 유용하다. 머리와 관련된 병인 좌골 신경통을 치료하는데도 이 색채가 사용되고 신경체계와 관련된 모든 질병에도 사용된다. 뇌하수체 선을 활성화시키고 그것은 대뇌와 신경계, 창조성, 영감, 예술주의, 예술적 능력과 높은 이상성을 향상시킨다.

한편, 흰색은 빛의 컬러이자 에너지의 근원으로 깨끗하고 투명한 느낌을 주는 색으로 순결과 순수, 청결함과 관련이 있다. 시원함과 동시에 마음이 맑아지는 정화 효과를 주며, 신체적으로는 통증 및 발열의 증상 완화, 스트레스로부터 오는 답답함을 느낄 때, 상실이나 허망함을 느낄 때 도움을 주는 색이다.

본 발명은 일 관점에서, 사과세포배양추출물, 포트마리골드추출물, 해바라기추출물, 중국체이스트트리추출물, 포도추출물, 라벤더추출물, 에델바이스추출물, 라이코펜, 베타카로틴, 커큐민, 안토시아닌, 항산화 물질 및 면역증강물질을 유효성분으로 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 구체적으로는, 상기 캘러스 배양물 또는 그 추출물, 라이코펜, 베타카로틴, 커큐민, 안토시아닌, 항산화 물질, 면역증강물질은 그 함량에 제한없으나, 조성물의 총 중량에 대하여 예를 들어, 0.01 내지 10 중량%로 함유할 수 있다.

본 발명에 있어서, 유효성분이 되는 각 성분에 대한 설명은 다음과 같다.

(1) 사과세포배양추출물, Malus Domestica Fruit Cell Culture Extract,

쌍떡잎식물 장미목 장미과 낙엽교목 식물인 사과나무의 열매는 지름 5~10cm 정도의 둥근 모양으로 빛깔은 보통 붉거나 노랗다. 원산지는 발칸반도로 알려져 있다. 알칼리성 식품으로, 칼로리가 적고 몸에 좋은 성분이 많이 들어있다. 식이섬유는 혈관에 쌓이는 유해 콜레스테롤을 몸밖으로 내보내고 유익한 콜레스테롤을 증가시켜 동맥경화를 예방해준다. 또한 칼륨은 몸속의 염분을 배출시켜 고혈압 예방과 치료에 도움을 준다. 수용성 식이섬유인 펙틴 또한 위액의 점도를 높히고 악성 콜레스테롤을 내보내어 급격한 혈압상승을 억제해주며, 페놀산은 체내의 불안정한 유해산소를 무력화시켜 뇌졸중을 예방한다. 사과에 함유된 케세틴은 폐기능을 강하게 하여 담배연기나 오염물질로부터 폐를 보호해준다. 또한 피로물질을 제거해주는 유기산과 피부미용에 좋은 비타민 C도 다량 함유되어 있다. 사과의 과육은 잇몸건강에 좋으며 사과산은 어깨결림을 감소해주는 효과가 있다. 사과로 만든 식초는 화상·두드러기 등을 치료하는 데 쓴다.

(2) 포트마리골드꽃추출물, Calendula Officinalis Flower Extract,

속명의 Calendula는 로마인들이 달의 초하루를 'calendae'라고 했으며 이것을 1개월로 하여 꽃이 1개월 동안 피는 데서 유래하였다. 높이 20~70cm 정도 자라는 1년초 또는 다년초로 꽃의 색은 주황색으로 향기가 독특하며 약간 악취가 있다. 카렌듈라의 주요 성분인 플라보노이드는 강력한 항산화 작용과 진정 작용이 있어 여드름·뾰루지 등 피부 트러블 진정에 도움을 준다고 알려져 있다. 피부재생의 꽃이라 불리며 상처 난 피부치료를 촉진하고 염증 억제 역할을 한다. 피부에 좋아 화장품의 재료 뿐 아니라 목욕제로도 쓰인다.

(3) 해바라기꽃추출물, Helianthus Annuus (Sunflower) Flower Extract,

해바라기란 중국 이름인 향일규를 번역한 것이며, 해를 따라 도는 것으로 오인한 데서 붙여진 것이다. 콜럼버스가 아메리카대륙을 발견한 다음 유럽에 알려졌으며 '태양의 꽃' 또는 '황금꽃'이라고 부르게 되었다. 북미 원산이며 전초에 짧은 강모가 나 있다. 잎은 어긋나고 심장꼴이며 대형이고 잎 가장자리에 톱니가 있다. 수과에는 고급지방산이 들어 있어서 식용유로써 식용하며, 특히 성인병 방지에 좋다고 한다. 한방에서는 줄기 속을 약재로 이용하는데 이뇨·진해·지혈에 사용한다.

(4) 중국체이스트트리잎세포추출물, Vitex Negundo Leaf Cell Extract,

유럽 남부산의 마편초속의 관목으로 잎은 털 모양으로 무성하게 나고, 향기나는 엷은 청자색 꽃이 핀다. 잎은 3~5개의 소엽으로 구성된 장상복엽이며 마주 난다. 소엽은 길이 2~8㎝로서 피침형 또는 타원상 피침형이며, 뒷면에 잔털과 선점이 있고 가장자리에 큰 톱니가 있거나 결각상이다. 체이스트트리는 거담·진해·진통 작용이 있어서 해소와 천식, 복통에 약으로 이용된다. 또, 부인들의 백대하나 어린아이의 천식해소에도 긴요하게 이용된다.

(5) 포도세포추출물, Vitis Vinifera (Grape) Fruit Cell Extract

포도는 살과 수분이 많고 안에 씨가 있는 장과로, 7~8월에 검은 빛으로 익는다. 원산지는 아시아 서부의 흑해연안과 카프카 지방으로 알려져 있으며, 우리나라에는 고려 시대의 문집에서 그에 관한 기록이 나타나고 있다. 성분으로는 당분(포도당·과당)이 많이 들어 있어 피로회복에 좋고 비타민 A·B·B2·C·D 등이 풍부해서 신진대사를 원활하게 한다. 그 밖에 칼슘·인·철·나트륨·마그네슘 등의 무기질도 들어 있다. 알칼리성 식품으로서 근육과 뼈를 튼튼하게 하고 이뇨작용을 하여 부종을 치료하는 데 도움이 된다. 또 생혈 및 조혈작용을 하여 빈혈에 좋고 바이러스 활동을 억제하여 충치를 예방하며, 레스베라트롤이라는 항암 성분이 있어서 암의 억제에도 효과가 있다. 신경세포를 만드는 신경효소의 활동과 효능을 증진하여 알츠하이머병이나 파킨슨병 등의 퇴행성 질병을 예방하는 데도 도움을 준다.

(6) 라벤더잎세포추출물, Lavandula Angustifolia (Lavender) Leaf Cell Extract

속명의 Lavandula는 "씻다"라는 뜻의 라틴어에서 유래하는데, 이것은 로마 사람들이 목욕이나 세탁시에 라벤더를 물에 넣는 것을 좋아했기 때문이다. 꽃줄기에 자색 별모양의 작은꽃이 피는 꿀풀과의 다년생 식물로 꽃·잎·줄기를 덮고 있는 털들 사이에 향기가 나오는 기름샘이 있어 정유를 생산한다. 정유는 향수와 화장품의 원료로 사용하고 요리의 향료로 사용할 뿐만 아니라 두통이나 신경안정을 치료하는 데도 쓴다.

(7) 에델바이스캘러스배양추출물, Leontopodium Alpinum Callus Culture Extract

국화과에 속하는 식물로 알프스를 포함한 유럽과 아시아의 고산지대에 서식한다. 에델바이스(Edelweiss)는 독일어의 'edel'과 'weiss'에서 유래하며 "고결한 희색"을 의미한다. 에델바이스의 학명은 그리스어로 '사자의 발'을 의미하는 라틴어 'Leontopodium'에서 유래하였다. 높이 10~20cm이며, 전체적으로 흰 면모가 덮여 있다. 잎은 뿌리에서 비교적 많이 나오고 줄기에 약간 있으며 선형이다. 줄기 끝에 포가 모여 달려서 사방으로 퍼지고 중앙에 약간의 두상화가 달린다. 유럽에서는 예로부터 민간요법으로 사용되어 왔으며 전통적으로 복부 통증, 협심증, 기관지염, 암, 설사, 이질, 해열 등의 증상에 사용되어 왔다

(8) 라이코펜(Lycopene)

토마토와 같은 붉은색을 가진 과일(토마토, 수박, 감, 붉은 포도, 석류, 자몽, 구아바)에 풍부하게 들어 있는 색소 성분이다. 라이코펜은 사람의 몸에서 가장 흔한 카로티노이드이며 가장 효능이 좋은 카로티노이드 항산화물질 가운데 하나이다. 피부 내 라이코펜의 수치는 자외선에 노출될 때 가장 빠른 속도로 반응하여 고갈되는 것으로 알려지고 있어, 피부 합병증 예방에 효과적이다. 혈류 개선 및 암세포 억제에도 도움을 준다.

(9) 베타카로틴(beta-Carotene)

카로티노이드 계열 물질 중 하나로, 당근의 주황색 빛깔에는 우리 몸에 대단히 유익한 영양소인 카로틴이 담겨 있다. 암과 심장질환 예방에 효과가 있는 항산화제로 카로틴의 강력한 항산화 작용은 유해산소(활성산소) 작용으로 체내 세포가 손상되는 것을 방지하여 세포를 보호하는 데 중요한 역할을 한다. 베타카로틴은 체내로 흡수되면 비타민 A로 전환돼 피부, 뼈에 긍정적인 역할을 할 뿐만 아니라 면역 기능 향상에도 도움을 준다.

(10) 커큐민(Curcumin)

카레의 주성분으로 카레 특유의 노란색은 주재료 중의 하나인 강황 또는 울금(Curcuma longa)이라 불리는 식물의 뿌리에서 나오는 알칼로이드의 일종인 천연 색상 물질 커큐민에 의한 것이다. 항종양, 항산화, 항아밀로이드와 항염증작용을 가지고 있으며 산화에 의한 DNA 손상과 지질과산화를 억제하고 자유래디컬의 청소부 역할을 한다.

(11) 이소플라본(Isoflavone), Soy Isoflavones

콩에 다량 함유되어 있는 화학물질로 여성호르몬인 에스트로겐과 비슷한 구조 뿐 아니라 유사한 기능을 담당하여 '식물성 에스트로겐'이라 불린다. 우울증·골다공증, 얼굴이 붉어지는 증세 등 여성호르몬이 부족하여 나타날 수 있는 갱년기 증세를 완화시켜 준다. 뿐만 아니라 암을 예방하는 효과도 있다. 유방암 등 부작용을 유발하는 에스트로겐요법과 비교하여 부작용이 없으므로 에스트로겐을 대체할 수 있는 성분으로 주목받고 있다.

(12) 안토시아닌(Anthocyanin)

붉은 빛을 내는 폴리페놀 계열의 색소로 주로 베리류, 검붉은 과일과 채소에 많이 함유돼 있다. 안토시아닌은 체내의 노폐물인 활성산소를 제거해 노화를 예방하는 기능이 있으며, 빛의 자극을 전달하는 작용을 하는 로돕신의 재합성을 촉진하여 시력 회복에도 효과적인 것으로 알려져 있다. 안토시아닌이 많이 함유된 식품에는 블루베리, 포도, 가지, 검은콩, 흑미 등이 있다.

(13) 레스베라트롤(Resveratrol)

식물에서 발견되는 항산화물질인 폴리페놀 계열에 속하는 물질로 포도, 오디, 땅콩 등에 들어있으며, 특히 적포도주에 다량 함유되어 있다. 인체의 여러 질병에 도움이 되는 것으로 알려져 있는데 항암 및 강력한 항산화 작용을 하며 혈청 콜레스테롤을 낮춰 주는 역할을 하고, 항암, 항바이러스, 신경보호, 항노화, 항염, 수명 연장 등의 효과가 보고되고 있다.

(14) 사포닌(Saponin)

인삼에 많이 들어 있다고 알려진 사포닌은 콜레스테롤과 유사한 화학적 구조를 가져, 콜레스테롤 흡수를 저해하고 배출을 돕기도 한다. 체지방으로 축적되는 에너지를 줄여주는 것 역시 사포닌 고유의 역할 중 하나로, 동물 실험 결과 비만 체질을 근본적으로 개선하는 기능까지 있다. 사포닌은 인체의 면역력을 높이는 성분으로 알려져 있으며, 특히 인삼에 함유된 사포닌 종류인 진세노사이드(ginsenoside)와 엘루테로사이드(eleutheroside)가 유명하다.

본 발명에 있어서, '캘러스(callus)'는 식물체에 상처가 났을 때, 세포가 분열 능력을 회복하여 상처를 막고 비대하여 지는 유상조직으로, 식물체에서 잘라낸 조직을 옥신을 함유한 배지에서 배양하거나, 어떤 종류의 식물에 상처를 내거나, 상처 부위를 옥신으로 처리하거나 할 때에 생기는 미분화 조직 또는 세포덩어리를 말하는 것으로서, 새로운 배지에 계대 배양함으로써 영구적으로 분열 및 증식을 할 수 있다. 이러한 캘러스는 정상적인 기관형성이나 조직분화를 일으키는 능력을 잃은 무정형의 조직 또는 세포덩어리로 대부분 유세포로 되어 있으며, 넓은 의미로는 아그로박테리움(agrobacterium) 등의 감염에 의해서 생기는 식물종양조직도 포함시키기도 한다. 즉, 식물체내의 세포는 증식하면 즉시 방향이 정해져서 특정한 조직뿐 만 아니라 기관으로 규칙적으로 조립되어 간다. 그러나, 조직배양을 통해 형성된 미분화 세포 덩어리인 캘러스는 외부로부터 다양한 식물 성장 호르몬 등의 자극을 주게 되면 그때까지 유지되어 왔던 통제가 해제되어 세포가 제멋대로 증식하는 것으로 해석된다.

탈분화에 의해 얻어진 캘러스를 같은 조성을 가진 액체배지에 넣어서 진탕 배양하면 세포는 따로 떨어져 현탁 상태로서 증식을 계속한다. 이 캘러스나 배양세포는 새로운 배지에 계대 배양함으로써 영구적으로 분열 및 증식할 수 있게 되어 완전 식물체가 노화해서 죽어가는 분화세포와는 본질적으로 차이가 있다. 몇 세대 정도 계대 배양한 캘러스 또는 배양세포를 다양한 식물 성장 호르몬을 제거한 고형 배지에 도포해두면 눈과 뿌리가 나와서 개체 식물이 복원된다. 이 재생식물은 한 개의 배양세포의 분열증식에서 유래한 것이며, 그 배양세포의 근원을 말하면 배축이나 수조직에서 유도한 것이다.

본 발명에 있어서, "캘러스"는 식물의 어느 부위로부터 유도된 것이든 모두 가능하나, 일 구체예로, 꽃잎, 꽃받침, 열매, 씨방, 태좌 조직의 일부이거나, 종자의 발아된 유묘로부터 자엽을 절취하여 유도시킨 캘러스일 수 있다.

본 발명에 있어서, "캘러스 배양물" 또는 "식물세포 배양물" 또는 "식물세포 캘러스 배양물"은 캘러스를 배지에 배양시킨 것이다. 상기 배지는 기술분야에서 캘러스 배양에 일반적으로 사용되고 있는 배지가 있다면, 제한 없이 사용 가능하다.

본 발명에 있어서, 상기 피부개선용은 피부 생기 부여, 피부 활력 증진, 피부수렴용, 항염, 피부 장벽강화 또는 개선용, 창상 치유, 피부 재생, 피부 면역, 보습, 항산화, 항노화, 청색광으로부터의 피부 보호, 외부 환경 스트레스로부터의 피부 보호 등 다양한 피부 활성 개선 기능을 포함한다.

본 발명의 피부개선용 화장료 조성물의 제조방법은 다음의 단계를 포함한다:

(a) 포트마리골드꽃, 해바라기꽃 각각의 추출물을 제조하는 단계; (b) 사과, 포도, 라벤더잎, 중국체이스트트리잎, 에델바이스의 각각의 식물 조직으로부터 캘러스를 유도 및 배양하는 단계; (c) 상기 (a) 단계의 추출물들 및 (b) 단계의 식물세포 캘러스 배양물 또는 그 추출물을 혼합하는 단계; 및 (d) 라이코펜 및 베타 카로틴과 상기 (c)단계의 혼합물을 혼합하여 피부개선용 조성물을 제조하는 단계.

본 발명에 있어서, 상기 (c)단계는, (b)단계에서 얻어진 각각의 식물세포 캘러스 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시켜 조성물을 제조하는 단계를 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 (c)단계는, (b)단계에서 얻어진 각각의 식물세포 캘러스 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시킨 다음, 초음파 추출 또는 열수 추출하여 조성물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 (c)단계는, 커큐민, 항산화물질인 이소플라본, 레스베라트롤, 안토시아닌, 및 면역증강물질인 사포닌을 추가하여 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 커큐민, 이소플라본(소이 아이소플라본), 안토시아닌, 레스베라트롤, 및 사포닌은 각각 전체 조성물 100중량부에 대하여 함유량에 제한은 없으나, 예를 들어, 0.0001중량부의 극소량이 들어가더라도 본 발명에서 목적하는 효과를 내기에 충분하다.

본 발명에 있어서, 상기 라이코펜, 베타카로틴도 각각 전체 조성물 100중량부에 대하여 함유량에 제한없으나, 예를 들어, 0.01 내지 0.05중량부를 함유할 수 있다. 들어가더라도 본 발명에서 목적하는 효과를 내기에 충분하다.

본 발명에 있어서, 상기 캘러스 배양물 (배양체) 자체를 사용하거나, 배양물을 여과하여 사용하거나, 배양물을 파쇄하여 사용하거나, 배양물을 건조시켜 분말화한 다음, 정제수에 녹여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, "추출물"은 상기 캘러스 배양물의 추출물을 분말화하거나, 냉수추출법, 열수추출법, 에탄올 추출법 등 종래 알려진 다양한 추출법에 의해 수득한 추출물을 의미한다.

본 발명에서 추출 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 냉침 추출, 초음파 추출, 환류 추출, 열수 추출 등이 있다. 여기서, 열수추출의 경우, 열탕증류기에서 8~48시간동안, 80~100℃ 로 가열하여 열수 추출물을 얻는다.

냉수 추출의 경우, 예컨대, 냉수 (15-25℃)에 상기 캘러스 배양물 자체 또는 그것의 건조된 분말을 혼합하여 3일동안 추출하여 냉수추출물을 얻는다.

또는, 물, 유기 용매, 또는 이의 혼합 용매를 사용하여 추출하는 방법으로 제조될 수 있다. 추출한 액은 바로 사용하거나 또는 농축 및/또는 건조하여 사용할 수 있다. 유기용매를 사용하여 추출하는 경우, 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올, 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, N, N-디메틸포름아미드(DMF), 디메틸설폭사이드(DMSO), 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합용매인 유기용매를 사용하며 생약의 유효 성분이 파괴되지 않거나 최소화된 조건에서 실온 또는 가온하여 추출할 수 있다. 추출하는 유기용매에 따라 약제의 유효성분의 추출정도와 손실정도가 차이가 날 수 있으므로, 알맞은 유기용매를 선택하여 사용하도록 한다. 특히, 본 발명에 있어서는 에탄올 추출물, 바람직하게는 20-50% 에탄올 추출물, 일 구체예로써 50% 에탄올 추출물이 바람직하며, 추출방법은 실시예에 기재된 바와 같이, 50% 에탄올에 섞은 후 3일동안 교반하여 얻는다.

본 발명에 있어서, 상기 추출물은 농축, 또는 희석하여 사용할 수 있고, 추출물의 증류액을 사용할 수도 있다.

본 발명에 있어서, "유효성분으로 함유하는"의 의미는, 화장료 조성물로써 피부 생기 부여, 피부 활력 증진, 피부 보습, 피부 재생, 피부 면역, 항산화, 항노화, 피부 장벽 강화, 항염, 청색광으로부터의 피부 보호, 외부환경스트레스, 가령 UV, 먼지, 황사, 담배연기, 매연으로부터의 피부 보호 효과를 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미한다.

본 발명의 상기 제조방법에 있어서, 상기 (b)단계에서, 구체적으로는 캘러스 유도 및 배양하기 위해 적절한 배지를 선택할 수 있다. 기술 분야에서 일반적으로 사용되고 있는 배지가 있다면, 제한 없이 사용가능하다. 식물에서는 일반적으로 MS배지, B5배지 등을 주로 사용하고, 일 예로, MS배지의 조성(1L기준시)은 NH₄NO₃ 1650 mg, KNO₃ 1900 mg, CaCl₂.2H₂O 440 mg, MgSO₄.7H₂O 370 mg, KH₂PO₄ 170 mg, KI 0.83 mg, H₃BO₃ 6.2 mg, MnSO₄.4H₂O 22.3 mg, ZnSO₄.7H2O 8.6 mg, Na₂MoO₄.2H₂O 0.25 mg, CuSO₄,5H₂O 0.025 mg, CoCl₂.6H₂O 0.025 mg, FeSO₄.7H₂O 27.8 mg, Na₂EDTA.2H₂O 37.3 mg, Myoinositol 100 mg, Nicotinic acid 0.5 mg, Pyridoxine-HCl 0.5 mg, Thiamine-HCl 0.5 mg, Glycine 2 mg, Sucrose 30000 mg 이다.

본 발명에 있어서, 상기 (d)단계에서 있어서, (b)단계의 배양을 통해 얻어진 각각의 캘러스 배양물 그대로를 포함하는 조성물을 적절한 형태의 화장료 조성물로 제조하거나, 또는 상기 배양물을 공지된 추출 방법을 통해 추출물 형태로 수득하여 적절한 형태의 화장료 조성물로 제조할 수 있다.

예컨대, 상기 (c)단계는, (b)단계에서 얻어진 각각의 캘러스 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시켜 제조하거나, (b)단계에서 얻어진 캘러스 배양물을 건조하고, 분말화하여 정제수에 혼합시킨 다음, 냉수 추출, 열수 추출 또는 에탄올 추출하여 조성물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물에 있어서는, 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다.

상기 담체는 본 발명의 화장료 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량 %로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발명의 화장료 조성물이 제조되는 후술한 바의 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위(얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물/조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질/조성물을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로써, 본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기 유효성분 이외에 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글키롤, 폴리옥시에틸렌 경화피마자유, 에탄올, 트리에탄올아민 등을 포함할 수 있으며, 방부제, 항료, 착색료, 정제수 등을 필요에 따라 미량 포함할 수 있다.

또한, 종래에 잘 알려져 있는 생리활성성분이나 다른 식물세포 배양물 또는 추출물을 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은, 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 화장수, 에센스, 젤, 에멀젼, 로션, 크림(수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액(무수 및 수계), 무수 생성물(오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말, 또는 젤라틴 등의 피막이 있는 캅셀 (소프트 캅셀, 하드 캅셀) 제형 등의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 있어서의 피부는 얼굴 뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념으로, 이러한 두피에 적용될 수 있는 화장료 조성물로써, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 발모제 등이 있고, 전신에 적용될 수 있는 바디클렌져 등의 용도로써 다양한 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물의 제조방법은 전술한 제조방법에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기 제조방법을 일부 변형시킨 방법으로도 제조할 수 있다.

화장료 조성물로 제조될 경우, 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다. 또한, 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수 있다.

또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일,염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 피부 창상 치유, 피부 재생, 피부 면역, 항염, 피부 활력 증진, 피부 보습, 피부 장벽 기능 보호, 청색광, 외부환경스트레스로부터의 피부 보호, 항염, 항산화, 항노화 등의 기능을 가진 화장료 조성물로써, 다양한 기능성 화장품의 소재로 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 조성물의 창상 치유 효능을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명에 따른 조성물의 외부환경스트레스에 의한 LEA 단백질 발현양을 측정한 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

실시예 1: 본 발명에 따른 식물세포 컴플렉스 조성물 제조

실시예 1-1: 식물 시료의 표면소독

본 발명에 따른 세포를 생산을 위하여 사과, 중국체이스트트리, 포도, 라벤더, 에델바이스 식물체 혹은 식물의 잎을 준비하고, 표면을 살균하기 위하여, 70 % 에탄올에 30초간 침지시키고, 2 % 치아염소산나트륨(Sodium hypochlorite)에 5분 진탕하여 살균 후, 멸균수로 세척하였다.

실시예 1-2: 식물 세포 유도

살균된 식물체들 잎을 날카로운 칼을 이용하여 한번에 잘라서 식물생장조절물질(Plant Growth Regulators)인 1 mg/L 6-Benzylaminopurine, 0.3mg/L 2,4-D, 3% Sucrose 및 agar 8g/L 가 포함된 기본 MS배지(Murashige and Skoog 1962, Duchefa 사, Cat No. M0221)에서 25℃, 습도 70%의 생장상 조건으로 암배양하며 초기 식물세포를 유도하였다. 각각의 배지는 1N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 5.8 로 조정하였다. 계대배양은 2주 간격으로 수행하였다.

실시예 1-3: 본 발명에 따른 식물세포 배양 및 대량생산

무균적으로 계대 배양을 통하여 배양된 사과, 중국체이스트트리, 포도, 라벤더, 에델바이스 세포는 이후, 생물반응기를 이용하여 agar를 제외한 동일한 조성의 액체 배지에서 온도 25℃, 습도 70 %, 공기공급량 0.1 vvm으로 일정하게 조절하며 14일 간격으로 배양 및 증식하여 대량생산하였다.

실시예 1-4: 본 발명에 따른 조성물(Phyto Energy Complex) 제조

배양하여 사과, 중국체이스트트리, 포도, 라벤더, 에델바이스 식물세포들은 각각 수확되어 깨끗한 티슈로 충분히 수분을 제거한 후 60℃로 2일 동안 건조하였다.

본 발명에 따른 조성물을 수득하기 위하여 다음과 같이 각각을 추출하거나 혼합하였다.

<피토 에너지 컴플렉스(Phyto Energy Complex) 1>

1) 600 g 포트마리골드꽃, 600 g 해바라기꽃을 정제수 15 L에 104 ℃에서 4시간동안 각각 추출하고 필터한다.

2) 100 g 사과세포, 100 g 중국체이스트트리잎세포, 100 g 포도세포, 100 g 라벤더잎세포, 100 g 에델바이스캘러스도 정제수 20 L에 상기와 동일한 조건으로 각각을 추출하고 필터한다.

3) 그런 다음, 5 % 포트마리골드꽃추출물, 5 % 해바라기꽃추출물, 4 % 사과세포배양추출물, 4 % 중국체이스트트리잎세포추출물, 4 % 포도세포추출물, 4 % 라벤더잎세포추출물, 4 % 에델바이스캘러스배양추출물과 각각의 0.0001 %의 피토케미칼인 커큐민(Curcumin), 이소플라본(Soy Isoflavones), 안토시아닌(Anthocyanins), 레스베라트롤(Resveratrol), 사포닌(Saponins)을 추가하여 혼합하여 Phyto Energy Complex 1을 구성한다.

4) 카프릭글리세라이즈(Capric Glycerides)에 피토케미칼인 0.05 %의 라이코펜(Lycopene), 0.01 %의 Beta-Carotene(베타-카로틴)을 추가하여 혼합하여 Phyto Energy Complex 2를 구성한다.

5) 본 조성물은 상기의 Phyto Energy Complex 1, Phyto Energy Complex 2를 포함하여야 혼합한 조성물을 제조한다.

실험예 1: 피부세포 배양을 통한 무자극 및 세포증식에 의한 재생효과 확인 시험

먼저 실시예 1의 본 발명에 따른 조성물인 Phyto Energy Complex가 피부세포에서 독성에 의한 자극이 있는지 알아보기 위해, MTT assay를 진행하였다.

이를 위하여 HaCaT 세포(human keratinocyte, 각질형성세포), Detroit 세포(human fibroblast, 섬유아세포)를 10 % FBS(Fetal Bovine Serum)가 함유된 DMEM(Dubelcco's Modified Eagle's Medium) 배지와 함께 96 well plate에 분주하고 5 % CO₂, 37 ℃의 조건인 항온기에서 24시간 배양하였다. 이후 정제수를 첨가한 대조군과 시험 물질인 조성물을 최종 0.1, 1, 5, 10, 20 %인 농도가 되도록 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. 이어 5 mg/mL MTT(3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl) -2, 5-diphenyl -2H- tetrazolium bromide) 용액을 각 well에 4 μL씩 첨가하고, 4시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거한 다음 DMSO(Dimethyl sulfoxide) 용액 100 μL씩 첨가하여 세포를 용해시킨 후, spectrophotometer를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

본 발명의 Phyto Energy Complex는 0.1 ~ 20 % 처리 농도에서 피부세포 내독성을 일으키지 않고, 증식이 있음을 확인하였다. 따라서 Phyto Energy Complex는 피부 자극 유발 가능성이 낮고 안전한 물질임을 의미하여 각질형성세포와 섬유아세포에 무해하며, 세포를 증식시킴으로써 피부 재생 효과를 확인할 수 있었다.

실험예 2: DPPH Radical Scavenging Activity를 이용한 항산화 효과 확인 시험

유해산소 (toxic oxygen species)라고도 하는 활성산소종 (Reactive oxygen species, R0S)은 호흡 등과 같은 생리작용에 의해 세포에서 생성되는 독성물질로 끊임없이 생산되고 소멸한다. 활성산소는 세균을 살균하여 생체 방어 작용을 하는 장점도 있지만, 일반적으로 생체 내에서 산화를 일으켜 생물 분자를 공격하여 세포나 조직에 피해를 주며, 노화나 각종 질병을 야기한다.

본 발명의 조성물 (Phyto Energy Complex)의 항산화 활성 효능을 살펴보기 위하여, DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl)에 의한 자유 라디칼 소거능을 조사하였다.

이를 위하여 구체적으로는, 에탄올 0.4 mL에 0.1 mM DPPH 용액 0.5 mL, 대조군과 시험 물질인 조성물을 최종 농도 0.01 %, 1 %, 5 % 가 되도록 0.1 mL씩 첨가하였다. 각 시료들을 혼합하여 실온 암조건에서 30분간 반응시킨 후, 517 nm에서 흡광도 측정을 통하여 DPPH 라디칼 소거능을 확인하였다.

본 발명의 Phyto Energy Complex 0.01 ~ 5 % 농도에서 자유 라디칼 소거능을 확인함으로써 항산화 효과를 확인하였다.

실험예 3: Wound healing assay를 이용한 창상치유, 항노화 효과 시험

본 발명의 조성물 (Phyto Energy Complex)이 세포의 증식 및 이동 족진에 도움을 주는지 Wound healing assay를 이용하여 항노화 효능을 평가하고자 하였다.

이를 위하여 HaCaT 세포를 Wound healing assay용 insert를 첨가한 12 well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 insert를 제거하여 0시간대에 세포 양상을 현미경 사진으로 획득하고, 대조군과 시험 물질인 조성물의 최종 농도 1 %, 2 %가 되도록 세포에 처리하였다. 이때, 양성 대조군 100 ng/mL EGF도 함께 처리하였다.

물질처리 후 7시간동안 추가배양 후 배지를 제거하고 500 μL fixing solution(4 % paraformaldehyde)으로 15분간 상온에서 배양하여 세포를 고정시켰다. 이후 PBS로 3번 세척한 뒤에, 7시간대에 세포 양상을 또한 현미경 사진으로 획득하였다. 창상 치유가 된 정도는 Image J라는 프로그램을 이용하여 계산하였다.

도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명의 Phyto Energy Complex를 1 %, 2 % 농도로 처리하여 실험한 결과, 대조군과 비교하여 세포의 증식 및 이동이 촉진되어 healing area가 증가함을 확인하였다.

실험예 4: 염증 유전자 활성화의 억제 효과 확인 시험

염증 반응은 외부로부터 물리적, 화학적 자극이나 세균감염에 대한 생체 조직의 방어 반응의 하나로써 손상된 조직을 수복하거나 재생하려는 기전이나, 만성으로 진행될 경우 반대로 조직 손상을 촉진하여 신경퇴행성질환과 같은 각종 만성질환과 암 등의 질병의 요인이 되기도 한다.

본 발명의 조성물 (Phyto Energy Complex)의 피부 염증 억제 효능을 살펴보기 위하여, 염증 반응에 관여하는 COX-2 (Cyclooxygenase-2), iNOS (Inducible nitric oxide synthase)의 발현양 변화를 조사하였다.

이를 위하여 HaCaT 세포를 96 well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 UVB 조사를 통해 염증반응을 유도하고, 대조군과 시험 물질인 조성물을 최종 농도 0.1 %, 1 %, 5 %가 되도록 세포에 처리하여 24시간 동안 추가 배양하였다. COX-2, iNOS의 유전자 수준에서 확인하기 위해 Real-time PCR 법을 수행하였으며, 그 시험 순서는 다음과 같다.

RNA isolation과 cDNA합성을 위해 SuperPrep™ cell lysis & RT Kit for qPCR(TOYOBO, Cat. SCQ-101)을 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 50 μL cell lysis mixture (gDNA remover 포함)를 넣고 5분간 반응시킨 후, stop solution을 첨가하였다. RT reaction mixture 32 μL에 추출한 mRNA 8 μL를 첨가하고 PCR을 이용하여 37 ℃ 15분, 50 ℃ 5분, 95 ℃ 5분 조건에서 cDNA를 합성하였다. 유전자의 발현을 비교·분석하기 위하여 상기에서 합성한 cDNA를 template로 하고, Thunderbird™ SYBR qPCR Mix (TOYOBO, Cat. QPS-201)를 이용하여 Real-time PCR 분석을 진행하였다. 실험에 사용한 primer는 Qiagen사의 QuantiTect primer assays (GAPDH; Cat. QT01192646, COX-2; Cat. QT00040586, iNOS; Cat. QT01323189)이며 시료의 COX-2, iNOS의 mRNA 발현량은 GADPH로 정량화 되어 비교하였다. Real-time qPCR 조건은 먼저 95 ℃ 15분 반응 후, 1 사이클 당 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 하여 총 40 사이클로 진행하였다.

본 발명의 Phyto Energy Complex는 UVB에 의한 염증 유도 후, 증가된 COX-2와 iNOS의 발현을 감소시킴으로써 염증 억제 효과가 있음을 확인하였다.

실험예 5: 항스트레스 유전자 활성화 관련 시험

본 발명의 조성물 (Phyto Energy Complex)이 세포 내 항스트레스 유전자 활성화를 통한 피부 항상성 유지에 도움을 주는지 확인하기 위하여, 이와 관련된 유전자들의 발현 양상을 확인하였다.

이를 위하여 HaCaT 세포를 96 well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 대조군과 시험 물질인 조성물 1 %를 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. 유전자 수준에서 확인하기 위해 Real-time PCR 법을 수행하였으며, 그 시험 순서는 다음과 같다.

구체적으로는 RNA isolation과 cDNA합성을 위해 SuperPrep™ cell lysis & RT Kit for qPCR (TOYOBO, Cat. SCQ-101)을 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 50 μL cell lysis mixture (gDNA remover 포함)를 넣고 5분간 반응시킨 후, stop solution을 첨가하였다. RT reaction mixture 32 μL에 추출한 mRNA 8 μL를 첨가하고 PCR을 이용하여 37 ℃ 15분, 50 ℃ 5분, 95 ℃ 5분 조건에서 cDNA를 합성하였다. 유전자의 발현을 비교분석하기 위하여 상기에서 합성한 cDNA를 template로 하고, Thunderbird™ SYBR qPCR Mix (TOYOBO, QPS-201)를 이용하여 Real-time PCR 분석을 진행하였다. 실험에 사용한 primer는 Qiagen사의 QuantiTect primer assays (GAPDH; QT01192646, HMOX1: QT00092645, NQO1: QT00050281, ABCA12: QT00025830, FTL: QT00055860, MT2A: QT00220199, TXNRD1: QT00055902)이며 시료의 HMOX1, NQO1, ABCA12, FTL, MT2A, TXNRD1의 mRNA 발현량은 GADPH로 정량화하여 비교되었다. Real-time qPCR 조건은 먼저 95 ℃ 15분 반응 후, 1 사이클 당 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 하여 총 40 사이클로 진행하였다.

본 발명의 Phyto Energy Complex에 의하여, 피부세포의 항상성에 관련한 유전자들(HMOX1, NQO1, ABCA12, FTL, MT2A, TXNRD1)의 발현이 유의하게 증가됨을 확인하였다.

실험예 6: 피부장벽 및 보습 개선 유전자 발현 확인 시험

피부장벽은 피부의 가장 바깥쪽에 있는 각질층으로 피부 최초의 방어막이라고 할 수 있다. 나이가 들어감에 따라 피부의 수분 함량은 급격하게 줄어들게 되는데 이는 피부 내의 보습인자들이 감소하기 때문이다.

본 발명의 조성물 (Phyto Energy Complex)의 피부 장벽 개선 및 보습 효능을 살펴보기 위하여, 수분/glycerol 수송체인 AQP3 (Aquaporin 3)와 자연보습인자로 알려진 FLG (Filaggrin)의 발현양 변화를 조사하였다.

이를 위하여 HaCaT 세포를 96 well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 대조군과 시험 물질인 조성물 1 %를 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. AQP3와 FLG의 유전자 수준에서 확인하기 위해 Real-time PCR 법을 수행하였으며, 그 시험 순서는 다음과 같다.

RNA isolation과 cDNA합성을 위해 SuperPrep™ cell lysis & RT Kit for qPCR (TOYOBO, SCQ-101)을 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 50 μL cell lysis mixture (gDNA remover 포함)를 넣고 5분간 반응시킨 후, stop solution을 첨가하였다. RT reaction mixture 32 μL에 추출한 mRNA 8 μL를 첨가하고 PCR을 이용하여 37 ℃ 15분, 50 ℃ 5분, 95 ℃ 5분 조건에서 cDNA를 합성하였다. 유전자의 발현을 비교분석하기 위하여 상기에서 합성한 cDNA를 template로 하고, Thunderbird™ SYBR qPCR Mix (TOYOBO, QPS-201)를 이용하여 Real-time PCR 분석을 진행하였다. 실험에 사용한 primer는 Qiagen사의 QuantiTect primer assays(GAPDH; QT01192646, AQP3; QT00212996, FLG; QT02448138)이며 시료의 AQP3, FLG의 mRNA 발현량은 GADPH로 정량화 하여 비교되었다. Real-time qPCR 조건은 먼저 95 ℃ 15분 반응 후, 1 사이클 당 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 하여 총 40 사이클로 진행하였다.

본 발명의 Phyto Energy Complex에 의하여 피부세포 내 AQP3, FLG 유전자 발현 증가를 확인함으로써 피부장벽 및 보습효과를 확인하였다.

실험예 7: 피부 면역 개선 및 방어력 증진 확인 시험

본 발명의 조성물 (Phyto Energy Complex)이 항균 효능을 가진 펩타이드 LL37 (CAMP, Cathelicidin-related antimicrobial peptides) 및 hBD-2 (human β-Defensin-2)의 활성을 통해 피부 면역과 방어력을 증진시키는 지 확인하였다.

이를 위하여 HaCaT 세포를 96 well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 대조군과 시험 물질인 조성물 1 %를 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. LL37과 hBD-2의 유전자 수준에서 확인하기 위해 Real-time PCR 법을 수행하였으며, 그 시험 순서는 다음과 같다.

RNA isolation과 cDNA합성을 위해 SuperPrep™ cell lysis & RT Kit for qPCR (TOYOBO, SCQ-101)을 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 50 μL cell lysis mixture (gDNA remover 포함)를 넣고 5분간 반응시킨 후, stop solution을 첨가하였다. RT reaction mixture 32 μL에 추출한 mRNA 8 μL를 첨가하고 PCR을 이용하여 37 ℃ 15분, 50 ℃ 5분, 95 ℃ 5분 조건에서 cDNA를 합성하였다. 유전자의 발현을 비교분석하기 위하여 상기에서 합성한 cDNA를 template로 하고, Thunderbird™ SYBR qPCR Mix (TOYOBO, QPS-201)를 이용하여 Real-time PCR 분석을 진행하였다. 실험에 사용한 primer는 Qiagen사의 QuantiTect primer assays (GAPDH; QT01192646, LL37; QT00010458, hBD-2; QT00204617)이며 시료의 LL37, hBD-2의 mRNA 발현량은 GADPH로 정량화 하여 비교되었다. Real-time qPCR 조건은 먼저 95 ℃ 15분 반응 후, 1 사이클 당 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 하여 총 40 사이클로 진행하였다.

본 발명의 Phyto Energy Complex는 피부세포에서 LL37과 hBD-2의 발현을 증가시켜 피부 면역과 방어력 증진에 도움을 주는 것을 확인하였다.

실험예 8: 자가 포식 활성 발현 확인 시험

오토파지(자가소화작용(Autophagy) 또는 Autophagocytosis)는 세포 내 조절과정에서 불필요하거나 기능하지 않는 자신의 소기관이나 세포 구성성분을 자연적으로 분해하는 파괴 기제이며, 기전에 이상이 생기면 암이나 신경 난치병 등이 발생한다.

본 발명의 조성물 (Phyto Energy Complex)의 자가 포식 활성 효능을 살펴보기 위하여, 오토파지 형성에 관여하는 LC-3 (Microtubule-associated protein 1A/1B-light chain 3)의 발현양 변화를 조사하였다.

이를 위하여 HaCaT 세포를 96 well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 대조군과 시험 물질인 조성물 1 %를 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. LC-3의 유전자 수준에서 확인하기 위해 Real-time PCR 법을 수행하였으며, 그 시험 순서는 다음과 같다.

RNA isolation과 cDNA합성을 위해 SuperPrep™ cell lysis & RT Kit for qPCR (TOYOBO, SCQ-101)을 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 50 μL cell lysis mixture (gDNA remover 포함)를 넣고 5분간 반응시킨 후, stop solution을 첨가하였다. RT reaction mixture 32 μL에 추출한 mRNA 8 μL를 첨가하고 PCR을 이용하여 37 ℃ 15분, 50 ℃ 5분, 95 ℃ 5분 조건에서 cDNA를 합성하였다. 유전자의 발현을 비교분석하기 위하여 상기에서 합성한 cDNA를 template로 하고, Thunderbird™ SYBR qPCR Mix (TOYOBO, QPS-201)를 이용하여 Real-time PCR 분석을 진행하였다. 실험에 사용한 primer는 Qiagen사의 QuantiTect primer assays (GAPDH; QT01192646, LC-3; QT00055069)이며 시료의 LC-3의 mRNA 발현량은 GADPH로 정량화 하여 비교되었다. Real-time qPCR 조건은 먼저 95 ℃ 15분 반응 후, 1 사이클 당 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 하여 총 40 사이클로 진행하였다.

본 발명의 Phyto Energy Complex는 피부세포에서 LC-3 발현을 증가시켜 자가 포식 활성화에 도움을 주는 것을 확인하였다.

실험예 9: Blue Light(청색광)에 의한 피부세포 보호 효과 시험

Blue Light는 380 ~ 500 nm 파장의 빛으로 사람이 볼 수 있는 가시광선, 즉, 망막까지 도달하는 빛 중에서 가장 파장이 짧고 강한 에너지를 갖고 있는 빛을 의미한다.

본 발명의 조성물 (Phyto Energy Complex)이 Blue Light 조사로부터 피부세포를 보호하는지 알아보고자, 460 nm 파장을 방출하는 Ultraviolet Crosslinker CL-1000을 사용하였다.

이를 위하여 HaCaT 세포를 96 well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 460 nm 파장을 10 mJ/cm²로 조사하고, 대조군과 시험 물질인 조성물을 최종 농도 0.1 %, 1 %, 5 %가 되도록 세포에 처리하여 24시간 동안 추가 배양하였다. 이어 피부세포의 생존률을 측정하기 위해 MTT assay를 진행하였다.

본 발명의 Phyto Energy Complex는 가시광선 영역대인 Blue Light 영역대의 빛을 특이적으로 반사시켜 차단하는 것이 가능하여 피부를 보호할 수 있음을 확인하였다.

실험예 10: 피부 에너지 활성 증진 효과 시험

본 발명의 조성물 (Phyto Energy Complex)의 피부 에너지 활성 증진 효과를 살펴보기 위하여, 세포의 에너지 (ATP)의 활성 정도를 측정하였다.

이를 위하여 Detroit 세포를 12 well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 대조군과 시험 물질인 Phyto Energy Complex를 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. 상기 과정을 통해 배양한 세포의 용해물을 희석한 일부 50 μL를 취해 ATP assay Kit(Abcam, Cat. ab83355) 내 ATP 표준물질 50 μL와 함께 각각 96 well plate에 넣고 50 μL의 ATP reaction mix 용액을 또한 각 well에 첨가하여 차광한 상태에서 30분간 실온 반응시켰다. 이후, 570 nm에서 흡광도를 측정한 후 ATP 표준농도곡선을 작성하여 시료 내 ATP 양을 산정하였다.

본 발명의 Phyto Energy Complex는 에너지 활성 효과가 있음을 확인하였고 특히 1 % 농도에서 효과가 좋았다.

실험예 11: 피부 활력 증진 효과 시험

본 발명의 조성물 (Phyto Energy Complex)의 피부 활력 증진 효과를 살펴보기 위하여, BMI(Body Mass Index)가 21 ~ 27인 20 ~ 45세의 여성 피험자 20명에게 시험 물질을 12주 동안 하루 1회 샤워 후 마사지와 함께 사용하게 하였으며, 사용 전과 사용 12주 후를 비교한 효과 여부를 판단하였다. 평가 항목은 설문평가를 하여 피부 세포 활성화 및 피부 활력 증진에 대해 효과를 느꼈다고 응답한 피험자 수를 조사하였다.

사용감 평가에서 응답자의 대부분이 대조군의 경우에는 12주 동안 사용한 후 피부 세포 활성화 및 피부 활력 증진 효과를 거의 느끼지 못했으나, 본 발명의 Phyto Energy Complex에 의하여 피부 세포 활성화와 피부 활력 증진을 느꼈다고 응답함을 확인하였다.

실험예 12 : 외부 환경 스트레스에 의한 LEA 단백질 발현 확인 시험

본 발명의 조성물 (Phyto Energy Complex)이 여러 외부 환경 스트레스에 의한 방어 효능이 있는지 알아보고자 LEA (Late embryogenesis abundant) 단백질의 활성 정도를 알아보았다. LEA는 발현 정도가 높을수록 스트레스에 대한 내성이 증가하여 세포 손상으로부터 보호하는 것으로 알려졌다.

이를 위하여 Detroit 세포를 96 well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 스트레스원에 세포를 6시간 동안 노출시켰다(UV, 먼지, 황사, 담배연기, 매연). 이때 스트레스 물질 부여 조건은 아래와 같다:

- UV ; UV-A 파장 350 nm, 강도 3 J/cm²

- 먼지 ; Asian sand dust(건조된 고비사막 dust, 입자직경 10~50 um) 20 μg/mL

- 황사 ; Asian sand dust(건조된 고비사막 dust, 입자직경 10 um이하) 20 μg/mL

- 담배연기 ; Cigarette Smoke Condensate(CSC, 담배연기응축물) 150 μg/mL, 니코틴 10 μg/mL

- 매연 ; Diesel Exhaust Particles(DEP) 10 μg/mL

스트레스 반응이 유도된 세포에 대조군과 시험 물질인 조성물 1 %를 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양한 후, LEA 단백질 발현량을 측정하기 위해 In-Cell ELISA Colorimetric Detection Kit를 사용하였다.

배양이 끝난 세포의 배지를 제거하고, 100 μL fixing solution(4 % paraformaldehyde)으로 15분간 상온에서 배양하여 세포를 고정시켰다. 이후 PBS로 세척하고, 100 μL의 Permeabilization solution을 넣고 15분간 상온에서 반응 시켰다. 이후 PBS로 세척하고, 100 μL Quenching solution을 넣고 20분간 상온에서 반응 시켰다. 이후 PBS로 세척하고, 100 μL Blocking solution을 넣고 30분간 상온에서 반응 시켰다.

용액을 제거하고 LEA 1차 항체 50 μL를 첨가하여 4 ℃에서 24시간 반응시켰다. 항체 제거 후 PBS로 세척하고, HRP conjugated 2차 항체 50 μL를 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. 이후 항체 제거하여 PBS로 세척을 한 뒤, 100 μL의 TMB substrate solution을 첨가하고 차광한 상태에서 15분간 실온에서 반응시켰다. 이후 100 μL stop solution (1 N H₂SO₄)을 첨가하고, 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

LEA (Late embryogenesis abundant) 단백질은 발현 정도가 높을수록 스트레스에 대한 내성이 증가하여 세포 손상으로부터 보호하는 것으로 알려져 있다.

도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 Phyto Energy Complex에 의하여 UV, 먼지, 황사, 담배연기, 매연의 스트레스원 노출 시 대조군에 비해 LEA 단백질의 발현양이 증가하여 세포 보호 효과가 있음을 확인하였다.

Claims

사과세포배양추출물, 포트마리골드추출물, 해바라기추출물, 중국체이스트트리추출물, 포도추출물, 라벤더추출물, 에델바이스추출물, 라이코펜, 베타카로틴, 커큐민, 안토시아닌, 이소플라본, 레스베라트롤 및 사포닌을 유효성분으로 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 포트마리골드추출물은 포트마리골드꽃추출물, 해바라기추출물은 해바라기꽃추출물, 중국체이스트트리추출물은 중국체이스트트리잎세포추출물, 포도 추출물은 포도세포 추출물, 라벤더 추출물은 라벤더잎세포추출물, 에델바이스추출물은 에델바이스캘러스배양추출물인 것을 특징으로 하는 피부 개선용 화장료 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 조성물은 창상 치유용 또는 피부 재생용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 항노화 또는 항산화용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 항염용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 항상성 유지용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 장벽 및 보습 개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 면역개선 및 방어 증진용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 청색광으로부터 피부 세포 보호를 위한 용도인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 피부 활력 증진용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 외부 환경 스트레스로부터 피부 보호용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
다음의 단계를 포함하는 사과세포배양추출물, 포트마리골드추출물, 해바라기추출물, 중국체이스트트리추출물, 포도추출물, 라벤더추출물, 에델바이스추출물, 라이코펜, 베타카로틴, 커큐민, 안토시아닌, 이소플라본, 레스베라트롤 및 사포닌을 유효성분으로 함유하는 제1항에 따른 피부 개선용 화장료 조성물의 제조방법:
(a) 포트마리골드꽃, 해바라기꽃 각각의 추출물을 제조하는 단계;
(b) 사과, 포도, 라벤더잎, 중국체이스트트리잎, 에델바이스의 각각의 식물 조직으로부터 캘러스를 유도 및 배양하는 단계;
(c) 상기 (a) 단계의 추출물들 및 (b) 단계의 식물세포 캘러스 배양물 또는 그 추출물을 혼합하는 단계; 및
(d) 라이코펜, 베타카로틴, 커큐민, 안토시아닌, 이소플라본, 레스베라트롤, 및 사포닌과 상기 (c)단계의 혼합물을 혼합하여 피부개선용 조성물을 제조하는 단계.