CN111344414B - 利用豆科植物培养根的香豆雌酚生产方法 - Google Patents

利用豆科植物培养根的香豆雌酚生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及利用豆科植物培养根的香豆雌酚生产方法以及香豆雌酚含量增加的豆科植物提取物制备方法，根据本发明的一方面的方法可以利用豆科植物以及酶，均匀且高含量地获取生成的香豆雌酚，因此相比现有方法，能够节约费用以及时间，而且由于是利用天然物质生产的香豆雌酚，因此可以安全活用到药学、食品或者化妆品之类的多种领域。

Description

利用豆科植物培养根的香豆雌酚生产方法
技术领域
本发明涉及利用豆科植物培养根的香豆雌酚生产方法以及香豆雌酚含量增加的豆科植物提取物制备方法。
背景技术
由于美国FDA禁止在对更年期女性的雌激素疗法中使用具有强大的雌激素效果的低廉的合成雌激素，例如己烯雌酚(diethylstilbestrol；DES)，因此可替代女性荷尔蒙的天然植物雌激素已囊括了研究兴趣。但是，由于这些物质是以极其微量形式存在于自然界，所以很难大量获得这些物质。另外，由于对大规模合成这些物质的不冷不热的态度，导致超过半个世纪也没有显著进步。虽然间歇性地报道过有关合成方法的开发，但是它们仅仅是实验室规模，而且目前没有一种用于大规模生产的容易的方法。
迄今为止，香豆雌酚(coumestrol)已被认为是植物雌激素中最强的物质，主要发现于豆科(leguminosae)、菊科(compositae)植物的种子、根部和叶子中，作为一种异黄酮(isoflavonoid)，一般归类为香豆草醚(coumestan)类化合物。香豆雌酚因其在植物受损时在受伤部位以高浓度分泌并且通过抗氧化、抗炎以及抗毒素作用而具有抗菌、抗真菌以及抗病毒作用以防止感染，而受到关注。该现象是由于多种细菌、真菌以及病毒导致的感染会诱导包括香豆雌酚的各种芳香化合物(aromatic compounds)的合成。公知香豆雌酚的这种抗生素作用基于其酚类结构(抗氧化剂的化学框架)，因此抑制了自由基(free radicals)氧化剂的引入并且阻断体内过氧化物的生成。此外，已知在多种天然香豆草醚衍生物中，只有香豆雌酚具有雌激素效果。对雌激素效果的实验是基于对未成熟小鼠口服后子宫重量的变化来评估的。从该实验结果中作为特殊事项观察到，香豆雌酚在幼龄雌性小鼠中表现出有效的雌激素效果，但在成熟雄性动物中不显示活性，并且完全没有毒性。
然而，由于在一部分植物体中香豆雌酚的存在量非常少，因此目前商用的天然香豆雌酚价格非常昂贵。因此，曾短暂地试图进行通过合成获得香豆雌酚的研究，然而，由于复杂的化学结构(融合有大量芳香环)，尚未发现开发简单的香豆雌酚合成方法的途径。虽然已经报道了几种合成方法，但每种方法都有以下说明的各种问题，从而商业化上存在困难。另外，天然成分被认为比化学合成的成分安全性更好，因此正在开发用于从天然成分大量生产的方法。
发明内容
技术问题
本说明书的课题为，提供利用天然原料，以高含量有效且均匀地生产香豆雌酚的方法。
技术方案
为了解决所述课题，本说明书提供香豆雌酚生产方法，其包括：(1)步骤，使豆科植物培养根位于生物反应器内的培养基中，从而在所述生物反应器内保持一定的空气供应量并进行增殖；(2)步骤，从经过所述(1)步骤的培养根获取提取物；以及(3)步骤，在所述提取物处理酶或者生产酶的微生物。
另外，本说明书提供香豆雌酚含量增加的豆科植物提取物的制备方法，其包括所述(1)步骤至(3)步骤。
技术效果
根据本发明的一方面的香豆雌酚生产方法利用豆科植物以及酶，能够均匀且高含量地获取生成的香豆雌酚，因此相比现有方法，能够节约费用以及时间，而且由于是利用天然物质而不是利用合成生产的香豆雌酚，因此如上生产的香豆雌酚可以安全活用到药学、食品或者化妆品之类的多种领域。
附图说明
图1是利用根据本发明的一方面的外植技术，培养豆培养根4周的情况的图；
图2a以及图2b是通过HPLC色谱图确认酶反应前后的豆培养根提取物内的香豆雌甙和香豆雌酚的结果的图。
具体实施方式
本说明书中，外植(explantation)可以称为外植或者体外培养，主要分离动植物个体的一部分并在体外培养的技术。主要包括在体外生存一定时间，并耗时培养直到逐渐确认到某种发生的变化。一般的组织培养也是体外培养的一种方法。另外，根据本发明的一方面的反应器内培养也包含在体外培养中。
在本说明书中，外植技术包括在添加有特定成分的培养基等的人工培养器生长选自包括原生质体、细胞、组织、器官、胚、种子、培养根以及植物体的一部分的群中的一种以上的情况。
在本说明书中，“酶制剂(enzyme preparation)”是指包括单一或者多种活性酶和赋形剂、添加剂等的制剂，不仅是市售的酶制剂，还可以是在研究所任意制备的。作为本说明书内的酶制剂的一例，为包括作为从棘孢曲霉(As pergillus aculeatus)由来的果胶酶的一种的多聚半乳糖醛酸酶的酶制剂，可以优选为Pectinex Ultra SP-L(Novozyme公司，丹麦)。
一方面，本发明可以为香豆雌酚生产方法，其包括：(1)步骤，使豆科植物培养根位于生物反应器内的培养基中，从而在所述生物反应器内保持一定的空气供应量并进行增殖；(2)步骤，从经过所述(1)步骤的培养根获取提取物；以及(3)步骤，在所述提取物添加酶制剂、酶或者生产酶的微生物。
另一方面，本发明可以为包括所述(1)步骤至(3)步骤的、香豆雌酚含量增加的豆科植物提取物的制备方法、豆科植物提取物内的香豆雌酚含量增加方法。
作为一体现例，所述豆科植物可以为豆。作为其他体现例，所述豆可以为大豆、宽叶蔓豆、青仁黑豆、鼠目太豆、黑大豆、青豆、黄豆、四季豆、红腰豆、斑豆、赤豆、小黑豆或豆芽豆，可以优选为大豆或者宽叶蔓豆。所述豆的品种不受限制，一方面，可以为豆酱类以及豆腐用、豆芽用、煮饭用豆或者毛豆用品种。作为豆酱以及豆腐用品种包括大豊(Daepung，品种保护申请，申请-2003-152)、湖酱(Hojang，品种保护申请，申请-2003-155)、壮元(Jangwon，品种保护申请，申请-2001-34)、大潢(品种保护申请，申请-2000-19)、小胆(sodamkong，品种保护申请，申请-1999-19)、松鹤(品种保护申请，申请-1999-22)、大元(Daewonkong，品种名称登记编号第01-0003-38号)、真品(Jinpumkong，品种保护申请，申请-1998-204)、蛋白(Danbae gkong，品种保护申请，申请-1998-201)、豆油(Duyoukong，品种保护申请，申请-1998-151)、新八达(Shinpaldalkong，品种保护申请，申请-1998-199)、太光(Taekwangkong，品种保护申请，申请-1998-198)、万里(Mallikong，品种名称登记编号第01-0003-11号)、长寿(Jangsukong，品种名称登记编号第01-0003-9)、无限(Muhankong，品种平常登记编号第01-0003-7号)、白云(Baegunkong，品种保护申请，申请-1998-193)、鸟卵(Saealkong，品种保护申请，申请-1998-143)、黄金(品种名称登记编号第01-0003-1号)以及长叶(品种名称登记编号第01-0003-41号)等。作为豆芽用品种包括神话(Sh inhwa，品种名称登记编号第01-0003-134号)、小圆(Sowon，品种保护申请，申请-2000-16)、安平(Anpyeong，品种保护申请，申请-2003-151)、西南(Sunam，品种保护申请，申请-2003-153)、多彩(Dachae，品种保护申请，申请-2003-148)、小绿(品种保护申请，申请-2002-116)、小胡(Sohokong，品种保护申请，申请-2001-36)、疏明(Somyeongkong，品种保护申请，申请-1998-18)、多元(品种保护申请，申请-1998-209)、丰产豆芽(Pungsannamu l，品种保护申请，申请-1998-140)、益山豆芽(Iksannamul，品种保护申请，申请-1998-139)、小白豆芽(品种名称登记编号第01-0003-31号)、光安(K wangankong，品种保护申请，申请-1998-202)、短叶以及银河(Eunhakong，品种名称登记编号第01-0003-6号)等。作为煮饭用品种包括青磁(Cheongjak ong，品种保护申请，申请-2001-38)、黑青(Heugcheong，品种保护申请，申请-2000-27)、褐味(品种保护申请，申请-2000-25)、鲜黑(Seonheukkong，品种保护申请，申请-1999-20)、黑豆以及一品黑豆(品种保护申请，申请-1998-158)等。作为毛豆用品种包括多兀(Daol，品种保护申请，申请-2003-149)、新绿(品种保护申请，申请-2001-35)、新乙(saeol)、黑乙(geomjeong ol)、夕凉毛豆(seokyang-putkong)、华严毛豆(hwaeom-putkong)(品种名称登记编号第01-0003-21号)以及大乙(keunol)等。在本发明的其他一方面，豆优选为可发芽且对病虫害强的品种。作为如上所述豆，例如包括神话、小圆、安平、西南、多彩、小绿、小胡、疏明、多元、丰产豆芽、益山豆芽、小白豆芽、光安、短叶以及银河等。然而，根据本发明的一方面的豆并不局限于所述豆品种。
根据本发明的一方面的宽叶蔓豆有扁豆、扁细豆、扁平豆、扁扁豆、半野生大豆等多种叫法。
一方面，所述方法在(1)步骤之前可以包括在培养基内发芽豆科植物的步骤。另一方面，所述方法在(1)步骤之前还可以包括从豆科植物的植物体诱导豆科植物培养根的步骤。
一般，露地栽培并通过一般的方法提取的豆科植物提取物其成分等不一定，因此很难均匀地大量生产用于达成特定目的的组合物。然而，通过根据本发明的一方面的方法，则可以利用使外部影响因素等最小化的外植技术，均匀地大量生产香豆雌酚。
作为一体现例，(3)步骤的所述酶制剂内的酶或者(3)步骤的所述酶可以为果胶酶(pectinase)。
作为其他体现例，(3)步骤的所述酶制剂内的酶或者(3)步骤的所述酶可以为多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase)。
作为其他体现例，(3)步骤的所述酶制剂内酶的量以酶制剂总重量为基准，可以为0.5至10重量％。一方面，(3)步骤的所述微生物可以为棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)。由于所述酶或者酶制剂为从所述棘孢曲霉由来，因此可以通过利用所述微生物的处理或者发酵，获得与使用所述酶或者酶制剂相同的效果。
作为其他体现例，(3)步骤的所述酶制剂的添加量相对于经过所述(2)步骤的提取物，可以为50重量％以上、60重量％以上、70重量％以上、80重量％以上、90重量％以上、100重量％以上或者110重量％以上。另一方面，所述酶制剂的添加量可以为120重量％以下、110重量％以下、100重量％以下、90重量％以下、80重量％以下、70重量％以下或者60重量％以下。优选为，所述(3)步骤的所述酶制剂的添加量相对于经过所述(2)步骤的提取物，可以为90至110重量％。
作为一体现例，(3)步骤的所述酶的添加量相对于经过所述(2)步骤的提取物100重量份，可以为0.8至8重量份。一方面，所述酶的添加量相对于经过所述(2)步骤的提取物100重量份，可以为0.8重量份以上、0.9重量份以上、1重量份以上、1.2重量份以上、1.5重量份以上、2重量份以上、2.5重量份以上、3重量份以上、3.5重量份以上、4重量份以上、4.5重量份以上、5重量份以上、5.5重量份以上、6重量份以上、6.5重量份以上、7重量份以上或者7.5重量份以上。另一方面，所述酶的添加量相对于经过所述(2)步骤的提取物100重量份，可以为8重量份以下、7.5重量份以下、7重量份以下、6.5重量份以下、6重量份以下、5.5重量份以下、5重量份以下、4.5重量份以下、4重量份以下、3.5重量份以下、3重量份以下、2.5重量份以下、2重量份以下、1.8重量份以下、1.5重量份以下、1.2重量份以下或者1重量份以下。
一方面，所述酶制剂的酶可以为在植物组织中分解果胶的酶。另一方面，所述酶制剂作为酶可以包括作为从棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)由来的果胶酶的一种的多聚半乳糖醛酸酶。又一其他方面，所述酶制剂作为酶还可以包括果胶反式消去酶(pectintranseliminase)、果胶酯酶(pectinesterase)、半纤维素酶(hemicellulase)以及纤维素酶(cellulases)。又一其他方面，所述酶制剂可以为Pectinex Ultra SP-L(Novozyme公司，丹麦)。
作为一体现例，所述酶制剂内包含的多聚半乳糖醛酸酶的量以酶活性(Enzymatic Activity)为基准，可以为2000单位/mL(units/mL)以上、2200单位/mL以上、2400单位/mL以上、2600单位/mL以上、2800单位/mL以上、3000单位/mL以上、3200单位/mL以上、3400单位/mL以上、3600单位/mL以上、3800单位/mL以上、4000单位/mL以上、4200单位/mL以上、4400单位/mL以上、4600单位/mL以上或者4800单位/mL以上。另外，所述量可以为5000单位/mL以下、4800单位/mL以下、4600单位/mL以下、4400单位/mL以下、4200单位/mL以下、4000单位/mL以下、3800单位/mL以下、3600单位/mL以下、3400单位/mL以下、3200单位/mL以下、3000单位/mL以下、2500单位/mL以下或者2400单位/mL以下。优选为，所述酶制剂内包含的多聚半乳糖醛酸酶的量可以为3800单位/mL。
在一体现例中，(3)步骤的所述酶的添加量以酶活性为基准，相对于经过所述(2)步骤的提取物1g，可以为2000至5000单位(units)。一方面，(3)步骤的所述酶的添加量以酶活性为基准，相对于经过所述(2)步骤的提取物1g，可以为2000单位以上、2200单位以上、2400单位以上、2600单位以上、2800单位以上、3000单位以上、3200单位以上、3400单位以上、3600单位以上、3800单位以上、4000单位以上、4200单位以上、4400单位以上、4600单位以上或者4800单位以上。所述添加量以酶活性为基准，相对于经过所述(2)步骤的提取物1g，可以为5000单位以下、4800单位以下、4600单位以下、4400单位以下、4200单位以下、4000单位以下、3800单位以下、3600单位以下、3400单位以下、3200单位以下、3000单位以下、2500单位以下或者2400单位以下。另外，优选为，所述添加量以酶活性为基准，相对于经过所述(2)步骤的提取物1g，可以为3500至4200单位。
一方面，所述酶制剂内的多聚半乳糖醛酸酶的量以所述酶制剂总重量为基准，可以为0.1重量％以上、0.5重量％以上、0.8重量％以上、1重量％以上、1.2重量％以上、1.4重量％以上、1.6重量％以上、1.8重量％以上、2重量％以上、2.2重量％以上、2.6重量％以上、2.8重量％以上、3重量％以上、3.2重量％以上、3.4重量％以上、3.6重量％以上、3.8重量％以上、4重量％以上、4.2重量％以上、4.4重量％以上、4.6重量％以上、4.8重量％以上、5重量％以上、5.2重量％以上、5.4重量％以上、5.6重量％以上、6重量％以上、6.5重量％以上或者7重量％以上。另一方面，所述多聚半乳糖醛酸酶的量可以为8重量％以下、7.5重量％以下、7重量％以下、6.5重量％以下、6重量％以下、5.8重量％以下、5.6重量％以下、5.4重量％以下、5.2重量％以下、5重量％以下、4.8重量％以下、4.6重量％以下、4.4重量％以下、4.2重量％以下、4重量％以下、3.8重量％以下、3.6重量％以下、3.4重量％以下、3.2重量％以下、3重量％以下、2.8重量％以下、2.6重量％以下、2.4重量％以下、2.2重量％以下、2重量％以下、1.8重量％以下、1.6重量％以下、1.4重量％以下、1.2重量％以下、1重量％以下、0.8重量％以下、0.6重量％以下、0.4重量％以下或者0.2重量％以下。所述酶制剂内的多聚半乳糖醛酸酶的优选量可以为1至5重量％。
一方面，所述酶制剂的功能以及作用为从提取物内香豆雌甙去除糖，从而能够使香豆雌甙转化为香豆雌酚，通过将均匀保持豆科植物培养根的质量并大量生产的外植方法与所述酶制剂的技术特征进行结合，从而能够使香豆雌酚的收率显著提高并均匀保持香豆雌酚的含量。
作为其他体现例，(1)步骤的所述豆科植物可以为豆。
作为其他体现例，(1)步骤的所述豆科植物可以为大豆或者宽叶蔓豆。
作为其他体现例，(2)步骤的所述提取物可以为将水、C1至C6的低级醇或者其混合物作为溶剂进行提取的。
一方面，所述混合物的醇浓度可以为60至100％(w/v)。一方面，所述乙醇浓度可以为60％(w/v)以上、70％(w/v)以上、75％(w/v)以上、80％(w/v)以上、85％(w/v)以上、90％(w/v)以上或者95％(w/v)以上。另一方面，所述醇浓度可以为100％(w/v)以下、95％(w/v)以下、90％(w/v)以下、85％(w/v)以下、80％(w/v)以下、75％(w/v)以下、70％(w/v)以下或者65％(w/v)以下。
另一方面，所述低级醇可以为乙醇。
另一方面，所述(2)步骤可以为将经过所述(1)步骤的培养根进行干燥之后，从该干燥的培养根利用所述溶剂获得提取物的步骤。
又一其他方面，(2)步骤的所述提取物可以为将所述培养根进行干燥的培养根:提取溶剂的重量比率设为1:10至1:70进行提取的提取物。所述重量比率可以为1:10以上、1:15以上、1:20以上、1:25以上、1:30以上、1:35以上、1:40以上、1:45以上、1:50以上、1:55以上、1:60以上或者1:65以上。另外，所述重量比率可以为1:70以下、1:65以下、1:60以下、1:58以下、1:55以下、1:52以下、1:50以下、1:48以下、1:45以下、1:42以下、1:40以下、1:38以下、1:36以下、1:35以下、1:30以下、1:25以下、1:20以下或者1:15以下。
作为一体现例，(1)步骤的所述生物反应器可以为搅拌釜反应器(Stirred TankReactor)、鼓泡塔反应器(Bubble Column Reactor)、气升式生物反应器(Air LiftReactor)、流化床反应器(Fludized Bed Reactor)、固定床/填充床反应器(Fixed/PackedBed Reactor)或者塔式发酵罐(Tower Fermenter)，可以优选为球状鼓泡生物反应器(BulbType bubble bioreactor)。
作为其他体现例，所述(1)步骤的培养基可以为添加有IBA(3-吲哚丁酸；indole-3-butyric acid)以及碳源的培养基。一方面，所述碳源可以为选自由葡萄糖、果糖、甘露糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖、蔗糖、纤维二糖、海藻糖、乳糖、棉子糖、直链淀粉、淀粉(Starch)、山梨糖醇、甘露醇以及甘油而成的群中的一种以上。
作为一体现例，所述(1)步骤的培养基中硝酸铵(NH4NO3)的浓度可以为650mg/L以上、660mg/L以上、700mg/L以上、740mg/L以上、760mg/L以上、800mg/L以上、825mg/L以上、850mg/L以上、900mg/L以上、1000mg/L以上、1200mg/L以上或者1400mg/L以上。作为其他体现例，所述硝酸铵的浓度可以为1500mg/L以下、1400mg/L以下、1200mg/L以下、1000m g/L以下、990mg/L以下、900mg/L以下、850mg/L以下、825mg/L以下、800mg/L以下、760mg/L以下、740mg/L以下、700mg/L以下或者660mg/L以下。
作为一体现例，所述(1)步骤的培养基中氯化钙(CaCl2·2H2O)的浓度可以为175mg/L以上、176mg/L以上、190mg/L以上、200mg/L以上、220m g/L以上、240mg/L以上、260mg/L以上、264mg/L以上、270mg/L以上、280mg/L以上、300mg/L以上、350mg/L以上或者380mg/L以上。作为其他体现例，所述氯化钙的浓度可以为400mg/L以下、380mg/L以下、350mg/L以下、300mg/L以下、280mg/L以下、270mg/L以下、264mg/L以下、260mg/L以下、240mg/L以下、220mg/L以下、200mg/L以下、190mg/L以下或者176mg/L以下。
作为一体现例，所述(1)步骤的培养基中硫酸镁(MgSO4·7H2O)的浓度可以为145mg/L以上、148mg/L以上、150mg/L以上、160mg/L以上、180mg/L以上、185mg/L以上、190mg/L以上、200mg/L以上、215mg/L以上、222mg/L以上、240mg/L以上、280mg/L以上或者300mg/L以上。作为其他体现例，所述硫酸镁的浓度可以为320mg/L以下、300mg/L以下、280mg/L以下、240mg/L以下、222mg/L以下、215mg/L以下、200mg/L以下、190mg/L以下、185mg/L以下、180mg/L以下、160mg/L以下、150mg/L以下或者148mg/L以下。
作为一体现例，所述(1)步骤的培养基中磷酸二氢钾(KH2PO4)的浓度可以为65mg/L以上、68mg/L以上、70mg/L以上、75mg/L以上、80mg/L以上、85mg/L以上、90mg/L以上、95mg/L以上、100mg/L以上、102mg/L以上、120mg/L以上或者140mg/L以上。作为其他体现例，所述磷酸二氢钾的浓度可以为150mg/L以下、140mg/L以下、120mg/L以下、110mg/L以下、102mg/L以下、100mg/L以下、95mg/L以下、90mg/L以下、85mg/L以下、80mg/L以下、75mg/L以下、70mg/L以下或者68mg/L以下。
作为一体现例，所述(1)步骤的培养基中硝酸钾(KNO3)的浓度可以为750mg/L以上、760mg/L以上、800mg/L以上、850mg/L以上、900mg/L以上、950mg/L以上、1000mg/L以上、1140mg/L以上、120mg/L以上或者1400mg/L以上。作为其他体现例，所述硝酸钾的浓度可以为1500mg/L以下、1400mg/L以下、1300mg/L以下、1140mg/L以下、1000mg/L以下、980mg/L以下、950mg/L以下、900mg/L以下、850mg/L以下、800mg/L以下或者760mg/L以下。
作为其他体现例，所述(1)步骤的培养基可以为MS(Murashige and Skoog)培养基。
一方面，所述(1)步骤的培养基内成分的种类与MS培养基内成分的种类相同，所述成分的浓度可以为MS培养基内成分浓度的40％以上、45％以上、50％以上、55％以上或者58％以上。另一方面，所述(1)步骤的培养基内成分的浓度可以为MS培养基内成分浓度的60％以下、55％以下、50％以下或者45％以下。
作为其他体现例，在所述(1)步骤中，使所述培养根位于培养基时的培养基pH可以为4.8至6.8。一方面，所述pH可以为4.8以上、5以上、5.2以上、5.4以上、5.6以上、5.8以上、6.0以上、6.2以上、6.4以上或者6.6以上。另一方面，所述pH可以为6.8以下、6.6以下、6.4以下、6.2以下、6.0以下、5.8以下、5.6以下、5.4以下、5.2以下、5.0以下。
作为其他体现例，在所述(1)步骤中，使所述培养根位于培养基时的密度可以为2至6g/L。一方面，所述密度可以为2g/L以上、3g/L以上、4g/L以上或者5g/L以上。另一方面，所述密度可以为6g/L以下、5g/L以下、4g/L以下或者3g/L以下。
作为其他体现例，所述(1)步骤的增殖可以是在黑暗条件下进行。
作为其他体现例，所述(1)步骤可以在19至25℃下进行。一方面，所述温度可以为19℃以上、20℃以上、21℃以上、22℃以上、23℃以上或者24℃以上。另一方面，所述温度可以为25℃以下、24℃以下、23℃以下、22℃以下、21℃以下或者20℃以下。
作为又一其他体现例，所述(1)步骤的空气供应量可以为0.05至0.4v vm(通气比；air volume/culture volume per min)。作为一体现例，所述空气供应量可以为0.05vvm以上、0.08vvm以上、0.1vvm以上、0.12vvm以上、0.14vvm以上、0.16vvm以上、0.18vvm以上、0.2vvm以上、0.22vvm以上、0.24vvm以上、0.26vvm以上、0.28vvm以上、0.3vvm以上、0.32vvm以上、0.34vvm以上、0.36vvm以上或者0.38vvm以上。作为其他体现例，所述空气供应量可以为0.4vvm以下、0.38vvm以下、0.36vvm以下、0.34vvm以下、0.32vvm以下、0.3vvm以下、0.28vvm以下、0.26vvm以下、0.24vvm以下、0.22vvm以下、0.2vvm以下、0.18vvm以下、0.16vvm以下、0.14vvm以下、0.12vvm以下、0.1vvm以下、0.08vvm以下或者0.06vvm以下。
作为其他体现例，所述(1)步骤的增殖可以进行2至5周。一方面，所述(1)步骤的增殖可以进行2周以上、3周以上或者4周以上。另一方面，所述(1)步骤的增殖可以进行5周以下、4周以下或者3周以下。
作为其他体现例，所述(2)步骤的提取时间可以为20至28小时。一方面，所述提取时间可以为20小时以上、22小时以上、24小时以上、25小时以上或者26小时以上。另一方面，所述提取时间可以为28小时以下、26小时以下、25小时以下、24小时以下、22小时以下或者21小时以下。
作为又一其他体现例，所述方法还可以包括(4)步骤，向所述(3)步骤的产物添加蒸馏水，制备所述产物的浓度为0.5重量％以上、1重量％以上、1.5重量％以上、2重量％以上、2.5重量％以上、3重量％以上、5重量％以上或者8重量％以上的反应物。一方面，所述浓度可以为10重量％以下、8重量％以下、5重量％以下、3重量％以下、2.5重量％以下、2重量％以下、1.5重量％以下、1重量％以下或者0.8重量％以下。
作为又一其他体现例，在所述(3)步骤或者(4)步骤之后还可以包括：在40至50℃以及60至100rpm的条件下保持38至58小时之后，通过离心分离回收沉淀物的步骤。一方面，所述温度可以为40℃以上、42℃以上、44℃以上、46℃以上或者48℃以上。另一方面，所述温度可以为50℃以下、48℃以下、46℃以下、44℃以下或者42℃以下。一方面，所述rpm可以为60以上、70以上、80以上、90以上或者95以上。另一方面，所述rpm可以为100以下、95以下、90以下、85以下、80以下、75以下、70以下或者65以下。一方面，所述时间可以为38小时以上、40小时以上、42小时以上、44小时以上、46小时以上、48小时以上、50小时以上、52小时以上、54小时以上或者56小时以上。另一方面，所述时间可以为58小时以下、56小时以下、54小时以下、52小时以下、50小时以下、48小时以下、46小时以下、44小时以下、42小时以下或者40小时以下。
通过所述方法，无需使用生长促进剂或者肥料、农药等，就可以环保且均匀地大量收获豆科植物培养组织，从而大量制备发挥环保且均匀效果的所述提取物以及组合物。
作为其他体现例，所述沉淀物内的香豆雌酚的含量相对于1g的沉淀物，可以为100mg。一方面，所述含量相对于1g的所述沉淀物，可以为100mg以上、110mg以上、120mg以上、130mg以上、140mg以上、142mg以上、143mg以上、144mg以上、144.27mg以上、145mg以上、145.5mg以上、146mg以上、146.4mg以上、147mg以上、147.5mg以上、148mg以上、148.5mg以上、148.53mg以上、149mg以上、150mg以上、155mg以上、160mg以上或者170mg以上。另一方面，所述含量相对于1g的所述沉淀物，可以为180mg以下、170mg以下、160mg以下、155mg以下、150mg以下、149mg以下、148.6mg以下、148.53mg以下、148.5mg以下、148mg以下、147.5mg以下、147mg以下、146.4mg以下、146mg以下、145.5mg以下、145mg以下、144.5mg以下、144.27mg以下、144mg以下、143mg以下、142mg以下、140mg以下、130mg以下、120mg以下或者110mg以下。作为示例，优选为，所述含量相对于1g的所述沉淀物，可以为140至150mg。所述含量为相比向露地栽培的一般豆根提取物未处理酶制剂的情况(每1g提取物为1.7至1.9mg以下)，显著增加约100倍左右的含量。另外，还是相比使用通常的MS培养基的情况，增加约3倍以上的含量。
以下，举出实施例等更加具体说明本发明一方面的结构以及效果。然而，以下实施例等仅是为了有助于理解本发明的一方面而作为示例目的提供的，本发明的范畴以及范围并不由此进行限定。
【实施例1】豆种子的发芽以及离体植物的诱导
使用2重量％的次氯酸钠(Sodium Hypochlorite)水溶液对豆种子(Glycine max，优选为神话豆品种)以及宽叶蔓豆的每个表面杀菌20分钟之后，用无菌水洗涤3次。然后，按照豆种类分别利用添加有30g/L蔗糖的0.5-1.0MS培养基(Murashige and Skoog Medium，Haarlem，荷兰)，在反应器内保持25±1℃的光照条件诱导植物体的发芽2周。
【实施例2】豆培养根的诱导以及增殖
从反应器内发芽的植物体的胚根诱导培养根之后，在空气容积为3L的球状(BulbType)生物反应器(一般可以从市场购入，参考图1)内利用添加有4mg/L的IBA(3-吲哚丁酸；indole-3-butyric acid，Sigma-Aldrich；Merck KGaA，Darmstadt，德国)、30g/L的蔗糖的2L的0.5MS培养基(Murashige and Skoog medium，Duchefa，荷兰)增殖培养根4周。另外，通过与上述相同的条件并利用1.0MS培养基增殖培养根4周。所述0.5MS培养基是将用于培养基的无机质等原料的浓度设为通常MS培养基的1/2制备的培养基，1.0MS培养基是指所述原料的浓度与通常的MS培养基相同的培养基。培养基是使用了利用1N NaOH将pH调整为5.8之后，在121℃、1.2气压下灭菌35分钟的培养基。将所述培养根切成1-1.5cm，并以鲜重为基准以4g/L的接种密度接种到所述培养基之后，在保持22±1℃的黑暗条件下进行培养。该过程中一直未使用农药、肥料等。空气供应量则是在培养的整个期间利用空气流量计(air flowmeters，RMA series；Dwyer Instruments，Inc.美国)以0.1vvm(通气比；air volume/culture volume per min)调整为一定，供应到生物反应器内部的空气则为了保持一定的温度，依次通过能够凝结压缩空气的空气凝结器和能够去除杂质的过滤器以及空气干燥器等之后，利用没有使用油的空气压缩机供应到生物反应器内部。
图1中示出使用如上所述生物反应器等时的豆培养根增殖的情况，通过成分分析等确认到该情况与露地或野外栽培的一般的豆(来自种子、植物体)提取物不同，能够全年生产均匀质量的豆培养根提取物。
【实施例3】提取物的制备以及酶处理
1.提取物的制备
将根据所述实施例1以及2收获并干燥的豆培养根浸渍到80％(w/v)乙醇水溶液使培养根：乙醇水溶液的重量比率为1:30至1:50(优选为1:30)，并在常温下提取24小时。提取液是利用滤纸过滤之后蒸发干燥溶剂，收获粉末(提取物)。另外，通过反复提取实验，可以确认到利用通过所述实施例1生产的培养根制备提取物时，提取物内成分保持均匀，确认到可以通过结合传代培养等的所述提取物制备方式进行大量生产。
2.酶处理
在所述提取物粉末处理与通过如上所述方法收获的豆培养根提取物粉末相同重量的液相果胶酶(pectinase)酶制剂(pectinex ultra SP-L，Novozyme公司，丹麦)之后，利用蒸馏水以2重量％浓度(酶制剂和提取物粉末的混合物2重量％以及蒸馏水98重量％)制备反应物(所述酶制剂作为果胶酶包含1至5重量％的多聚半乳糖醛酸酶，以酶活性为基准包含3800单位/mL的多聚半乳糖醛酸酶)。所述反应物是在45℃、80rpm条件下保持(反应)48小时之后，利用离心分离器回收沉淀物。回收的沉淀物则进行冷冻干燥，进行粉末化。
【实验例1】香豆雌酚分析
豆培养根提取物内的香豆雌酚含量是将酶反应前(所述实施例3.1的提取物)、后(所述实施例3.2的沉淀物)的提取物利用0.45μm过滤器(Filter)过滤之后，向安装有紫外检测器(UV Detector)的HPLC(高效液相色谱仪；High Performance LiquidChromatography)分别注入10μL进行了分析。使用Mightysil RP-18GP 250-4.6(5μm，KANTOCHEMICALS，JAPAN)柱，在342nm波长测定提取物内的香豆雌酚含量。
以下表1中比较了酶反应前后的豆培养根提取物内的香豆雌酚含量。表1中收率是分别用百分率(％)表示相对于豆培养根投入重量的所述实验例3.1的提取物的重量以及相对于豆培养根投入重量的所述实验例3.2的沉淀物的重量。
【表1】
(所述表1中MS为Murashige/Skoog培养基的简写，所述0.5MS培养基是将用于培养基的无机质等原料的浓度设为通常MS培养基的1/2制备的培养基，1.0MS培养基是指所述原料的浓度与通常的MS培养基相同的培养基)
另外，图2a以及图2b是通过HPLC色谱图确认酶反应前后的豆培养根提取物内的香豆雌甙和香豆雌酚的结果的图。
从所述表1、图2a以及图2b中可以确认到通过酶处理，提取物内的香豆雌甙的糖被去除而转化为香豆雌酚，确认到转化为香豆雌酚的量相比通过现有方法的量显著增加。同时，使用生物反应器等时，与露地或野外栽培的一般的豆(来自种子、植物体)提取物不同，可以全年生产均匀质量的豆培养根提取物，因此，可以确认到将所述外植技术与酶反应结合时，可以均匀且持续地生产所述高含量的香豆雌酚。

Claims (17)

1.一种香豆雌酚生产方法，其包括：
（1）步骤，使豆的培养根位于生物反应器内的培养基中，从而在所述生物反应器内保持一定的空气供应量且进行增殖；
（2）步骤，从经过所述（1）步骤的培养根获取提取物，所述提取物为80%（w/v）乙醇水溶液；以及
（3）步骤，在所述提取物添加酶或者生产酶的微生物；
其中，（3）步骤的所述酶为果胶酶，
其中，所述（1）步骤的培养基为添加有4mg/L的3-吲哚丁酸、30g/L的蔗糖的0.5MS培养基。
2.根据权利要求1所述的香豆雌酚生产方法，其中，（3）步骤的所述果胶酶为多聚半乳糖醛酸酶。
3.根据权利要求1所述的香豆雌酚生产方法，其中，（3）步骤的所述微生物为棘孢曲霉。
4.根据权利要求1所述的香豆雌酚生产方法，其中，（3）步骤的所述酶的添加量相对于100重量份的经过所述（2）步骤的提取物为0.8至8重量份。
5.根据权利要求1所述的香豆雌酚生产方法，其中，（3）步骤的所述酶的添加量以酶活性为基准，相对于1g的经过所述（2）步骤的提取物为2000至5000单位。
6.根据权利要求1所述的香豆雌酚生产方法，其中，（1）步骤的所述豆为大豆或者宽叶蔓豆。
7.根据权利要求1所述的香豆雌酚生产方法，其中，（1）步骤的所述生物反应器为球状鼓泡生物反应器。
8.根据权利要求1所述的香豆雌酚生产方法，其中，所述（1）步骤的培养基中硝酸铵的浓度为650至1500mg/L，氯化钙二水合物的浓度为175至400mg/L，硫酸镁七水合物的浓度为145至320mg/L，磷酸二氢钾的浓度为65至150mg/L，硝酸钾的浓度为750至1500mg/L。
9.根据权利要求1所述的香豆雌酚生产方法，其中，在所述（1）步骤中，使所述培养根位于培养基时的培养基pH为4.8至6.8。
10.根据权利要求1所述的香豆雌酚生产方法，其中，在所述（1）步骤中，使所述培养根位于培养基时的密度为2至6g/L。
11.根据权利要求1所述的香豆雌酚生产方法，其中，所述（1）步骤的增殖是在黑暗条件下进行。
12.根据权利要求1所述的香豆雌酚生产方法，其中，所述（1）步骤是在19至25℃下进行。
13.根据权利要求1所述的香豆雌酚生产方法，其中，所述（1）步骤的空气供应量为0.05至0.4vvm。
14.根据权利要求1所述的香豆雌酚生产方法，其中，所述（1）步骤的增殖进行3至5周。
15.根据权利要求1所述的香豆雌酚生产方法，其中，所述（2）步骤的提取时间为20至28小时。
16.根据权利要求1所述的香豆雌酚生产方法，其中，在所述（3）步骤之后还包括：在40至50℃以及60至100rpm的条件下保持38至58小时之后，通过离心分离回收沉淀物的步骤。
17.一种香豆雌酚含量增加的豆的提取物的制备方法，其包括权利要求1的（1）步骤至（3）步骤。
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