WO2019098598A9 - 콩과식물 배양근을 이용한 쿠메스트롤 생산 방법 - Google Patents

콩과식물 배양근을 이용한 쿠메스트롤 생산 방법 Download PDF

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WO2019098598A9
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이은정
강영규
박준성
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(주)아모레퍼시픽
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/181—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system, e.g. Salinomycin, Septamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01015—Polygalacturonase (3.2.1.15)

Definitions

  • the present specification relates to a method for producing coumestrole using a legume cultured root and a method for producing a cosmeceutic extract having an enhanced content of comestrol.
  • Coestestrol is a substance known to be the most potent of all phytoestrogens to date, and is mainly found in the seeds, roots, and leaves of legumes, asteraceae, and is an isoflavonoid. It is generally classified as a coumestan-based compound.
  • Coumestrol is a substance that has been attracting attention when it is known that when plants are traumatized, they are secreted in a dark concentration at the wound site and act as an anti-bacterial, anti-fungal and anti-viral agent through anti-oxidant, anti-inflammatory and anti-toxin action, thereby preventing infection. . This is because infections of various bacteria, fungi, and viruses induce the synthesis of various aromatic compounds, including coumestrole.
  • coumestrol has a chemical basic skeleton as an antioxidant and has a phenolic structure, thereby inhibiting the inflow of free radicals oxidizing agents and inhibiting the generation of peroxidation compounds in vivo.
  • coumestrol is known to have an estrogen effect.
  • estrogen effects were evaluated based on changes in the weight of the uterus after oral administration to immature mice. As a remarkable result from these experiments, it was found that coustrol effectively showed an estrogen effect in young female rats, but did not show activity and was not toxic in mature male animals.
  • the present specification is to (1) placing the leguminous culture root in a medium in a bioreactor to maintain a constant air supply in the bioreactor and propagate it; (2) obtaining an extract from the cultured muscle that has undergone step (1); And (3) treating the extract with an enzyme or a microorganism that produces it, provides a method for producing coestrol.
  • the present specification provides a method for producing a legume extract having an enhanced content of coumestroll, including steps (1) to (3).
  • the method for producing coumestrole is obtained by using legumes and enzymes, and thus it is possible to obtain the cousmetrol produced in a uniformly high content, thereby saving cost and time than the conventional method, Since it is produced by using natural products rather than synthetic, it can be safely used in various fields such as pharmacy, food or cosmetics.
  • FIG. 1 shows a state in which soybean cultured cultivated for 4 weeks using the explantation technology according to an aspect of the present invention.
  • Figures 2a and 2b shows the results of confirming the cosmetrin and coumestrol in the soybean culture root extract before and after the enzyme reaction by HPLC chromatogram.
  • explantation is also referred to as explantation (external) or in vitro culture, and is a technique of culturing in vitro by separating a part of a plant or animal object. This usually involves culturing in vitro over a period of time and taking time to see any developmental changes.
  • General tissue culture is also a method of in vitro culture.
  • in vitro culture according to an aspect of the present invention is also included in in vitro culture.
  • the explantation technology includes growing at least one selected from the group comprising protoplasts, cells, tissues, organs, embryos, seeds, culture roots, and plant parts in an artificial culture apparatus such as a medium to which a specific component is added. .
  • enzyme preparation is a preparation containing a single or several types of active enzymes, excipients, additives, and the like, and may be commercially available or prepared in the laboratory.
  • An example of an enzyme preparation in the present specification is an enzyme preparation comprising a polygalacturonase, which is a kind of pectinase derived from Aspergillus aculeatus , preferably pectinex Ultra SP-L ( Pectinex Ultra SP-L, Novozyme, Denmark).
  • the present invention (1) by placing the legume culture medium in a medium in a bioreactor to maintain a constant air supply in the bioreactor and proliferate; (2) obtaining an extract from the cultured muscle that has undergone step (1); And (3) adding an enzyme preparation, an enzyme, or a microorganism producing the same to the extract.
  • the present invention may include a method for preparing a legume extract having an improved content of coumestrol, which includes steps (1) to (3) above, and a method for increasing the content of comestroles in a legume extract. .
  • the legume may be soybean.
  • the soybean may be soybean, flat soybean, soybean, seomoktae, blacktae, chungtae, yellow bean, hedge bean, kidney bean, unripe kidney bean, red bean, large bean, or bean sprout bean, preferably soybean or flat bean.
  • the varieties of the beans are not limited, but in one aspect, they may be varieties for bean paste and tofu, herbs, rice or green beans.
  • Examples of varieties for jang and tofu include: Daepung (application for protection of varieties-2003-152), Hojang (application for protection of varieties-2003-155), Jangwon (application for protection of varieties-2001-34), Daehwang (Application for Breeding Protection-2000-19), Sodam (Sodamkong, Application for Breeding Protection-1999-19), Song Hak (Application for Breeding Protection-1999-22), Daewon (Daewonkong, Breeding Name Registration No.
  • Sowon (Sowon, filed for protection of varieties-2000-16), Anpyeong, filed for application for protection of varieties (2003-151) , Seonam (Sunam, Application for Variety Protection-2003-153), Dachae (Dachae, Application for Variety Protection-2003-148), So-Rok (Application for Variety Protection-2002-116), Soho (Sohokong, Application for Variety Protection- 2001-36), Somyeong (Somyeongkong, Application for Variety Protection-1998-18), Dawon (Application for Variety Protection Application-1998-209), Pungsannamul (Pungsannamul, Application for Variety Protection-1998-140), Ikannamul , Application for protection of varieties-1998-139), Sobaek namul (product name registration No.
  • soybeans are preferably varieties capable of germination and resistant to pests. Examples of such beans include myths, wishes, Anpyeong, Seonam, Dachae, Sorok, Soho, Somyeong, Dawon, Pungsannamul, Iksannamul, Sobaeknamul, Gwangan, monolobes, and galaxies.
  • the soybean according to one aspect of the present invention is not limited to the soybean variety.
  • Flat beans according to an aspect of the present invention are variously called lead-derived beans, lead-derived beans, lead-legged beans, lead-dried beans, flat beans, and the like.
  • the method may include germinating legumes in the medium prior to step (1). In another aspect, the method may also include the step of inducing the legume culture root from the legume plant prior to step (1).
  • leguminous plant extracts cultivated in the open field and extracted by a general method are not very uniform in composition, so uniform mass production of a composition for achieving a specific purpose is very difficult.
  • the enzyme in the enzyme preparation of step (3) or the enzyme of step (3) may be pectinase.
  • the enzyme in the enzyme preparation of step (3) or the enzyme of step (3) may be polygalacturonase.
  • the amount of enzyme in the enzyme preparation in step (3) may be 0.5 to 10% by weight based on the total weight of the enzyme preparation.
  • the microorganism in step (3) may be Aspergillus aculeatus . Since the enzyme or enzyme preparation is derived from the Aspergillus aculeatus, the same effect as using the enzyme or enzyme preparation can be obtained through treatment or fermentation with the microorganism.
  • the addition amount of the enzyme preparation in step (3) is 50% by weight, 60% by weight, 70% by weight, 80% by weight, 90% by weight, It may be 100% by weight or more or 110% by weight or more.
  • the amount of the enzyme preparation added may be 120 wt% or less, 110 wt% or less, 100 wt% or less, 90 wt% or less, 80 wt% or less, 70 wt% or less, or 60 wt% or less.
  • the addition amount of the enzyme preparation in the step (3) may be 90 to 110% by weight compared to the extract subjected to the step (2).
  • the amount of the enzyme added in step (3) may be 0.8 to 8 parts by weight compared to 100 parts by weight of the extract subjected to step (2).
  • the amount of the enzyme added is 0.8 parts by weight or more, 0.9 parts by weight or more, 1 part by weight or more, 1.2 parts by weight or more, 1.5 parts by weight or more, 2 parts by weight or more compared to 100 parts by weight of the extract after the step (2) , 2.5 parts by weight or more, 3 parts by weight or more, 3.5 parts by weight or more, 4 parts by weight or more, 4.5 parts by weight or more, 5 parts by weight or more, 5.5 parts by weight or more, 6 parts by weight or more, 6.5 parts by weight or more, 7 parts by weight or more Or 7.5 parts by weight or more.
  • the amount of the enzyme added is 8 parts by weight or less, 7.5 parts by weight or less, 7 parts by weight or less, 6.5 parts by weight or less, 6 parts by weight or less, 5.5 parts by weight or less compared to 100 parts by weight of the extract after the step (2) , 5 parts by weight or less, 4.5 parts by weight or less, 4 parts by weight or less, 3.5 parts by weight or less, 3 parts by weight or less, 2.5 parts by weight or less, 2 parts by weight or less, 1.8 parts by weight or less, 1.5 parts by weight or less, 1.2 parts by weight or less Or 1 part by weight or less.
  • the enzyme of the enzyme preparation may be an enzyme that breaks down pectin in plant tissue.
  • the enzyme preparation may include a polygalacturonase (Polygalacturonase), which is a kind of pectinase derived from Aspergillus aculeatus .
  • the enzyme preparation may further include pectintranseliminase, pectinesterase, hemicellulase, and cellulases as enzymes.
  • the enzyme preparation may be pectinex ultra SP-L (Novozyme, Denmark).
  • the amount of polygalacturonase contained in the enzyme preparation is 2000 units / mL or more, 2200 units / mL or more, 2400 units / mL or more, 2400 units / mL or more, 2600 units / mL or more, 2800 units / mL or more, based on enzymatic activity , 3000units / mL or more, 3200units / mL or more, 3400units / mL or more, 3600units / mL or more, 3800 units / mL or more, 4000units / mL or more, 4200units / mL or more, 4400units / mL or more, 4600units / mL or more, or 4800units / mL or more It may be abnormal.
  • the amount is 5000units / mL or less, 4800units / mL or less, 4600units / mL or less, 4400units / mL or less, 4200units / mL or less, 4000units / mL or less, 3800units / mL or less, 3600units / mL or less, 3400units / mL or less, 3200units or less It may be / mL or less, 3000units / mL or less, 2500units / mL or less, or 2400units / mL or less.
  • the amount of polygalacturonase contained in the enzyme preparation may be 3800 units / mL or more.
  • the amount of the enzyme added in step (3) may be 2000 to 5000 units compared to 1 g of the extract subjected to step (2) based on enzyme activity.
  • the amount of the enzyme added in step (3) is 2000 units or more, 2200 units or more, 2400 units or more, 2600 units or more, 2800 units or more, 3000 units or more, 3200 units or more compared to 1 g of the extract obtained through step (2) based on enzyme activity, It can be over 3400 units, over 3600 units, over 3800 units, over 4000 units, over 4200 units, over 4400 units, over 4600 units, or over 4800 units.
  • the added amount is 5000 units or less, 4800 units or less, 4600 units or less, 4400 units or less, 4200 units or less, 4000 units or less, 3800 units or less, 3600 units or less, 3400 units or less, 3200 units or less, 3200 units or less, based on the enzyme activity. It can be 3000 units or less, 2500 units or less, or 2400 units or less. Preferably, the addition amount may be 3500 to 4200 units compared to 1 g of the extract subjected to step (2) based on enzyme activity.
  • the amount of polygalacturonase in the enzyme preparation is 0.1 wt% or more, 0.5 wt% or more, 0.8 wt% or more, 1 wt% or more, 1.2 wt% or more, 1.4 wt% based on the total weight of the enzyme preparation Above, above 1.6%, above 1.8%, above 2%, above 2.2%, above 2.6%, above 2.8%, above 3%, above 3.2%, above 3.4%, 3.6% Above, above 3.8% by weight, above 4% by weight, above 4.2% by weight, above 4.4% by weight, above 4.6% by weight, above 4.8% by weight, above 5% by weight, above 5.2% by weight, above 5.4% by weight, above 5.6% by weight Or more, 6% or more, 6.5% or more, or 7% or more.
  • the amount of the polygalacturonase is 8 wt% or less, 7.5 wt% or less, 7 wt% or less, 6.5 wt% or less, 6 wt% or less, 5.8 wt% or less, 5.6 wt% or less, 5.4 wt% or less , 5.2% or less, 5% or less, 4.8% or less, 4.6% or less, 4.4% or less, 4.2% or less, 4% or less, 3.8% or less, 3.6% or less, 3.4% or less , 3.2% or less, 3% or less, 2.8% or less, 2.6% or less, 2.4% or less, 2.2% or less, 2% or less, 1.8% or less, 1.6% or less, 1.4% or less , 1.2 wt% or less, 1 wt% or less, 0.8 wt% or less, 0.6 wt% or less, 0.4 wt% or less, or 0.2 wt% or less.
  • the preferred amount of polygalacturonase is
  • the function and role of the enzyme preparation is to remove the sugar from the cosmetrin in the extract so that cosmetrin can be converted to coumestrol, maintaining the quality of the legume cultured muscles uniformly and mass production
  • the yield of coumestrol can be significantly improved and maintained uniformly.
  • the legume of step (1) may be soybean.
  • the legume of step (1) may be soybean or flat soybean.
  • the extract of step (2) may be extracted with water, C1 to C6 lower alcohol, or a mixture thereof as a solvent.
  • the alcohol concentration of the mixture may be 60 to 100% (w / v). In one aspect, the alcohol concentration is 60% (w / v) or more, 70% (w / v) or more, 75% (w / v) or more, 80% (w / v) or more, 85% (w / v) ), 90% (w / v) or more, or 95% (w / v) or more.
  • the alcohol concentration is 100% (w / v) or less, 95% (w / v) or less, 90% (w / v) or less, 85% (w / v) or less, 80% (w / v) ) Or less, 75% (w / v) or less, 70% (w / v) or less, or 65% (w / v) or less.
  • the lower alcohol may be ethanol.
  • the step (2) may be a step of obtaining an extract using the solvent in the dried cultured muscle after drying the cultured muscle subjected to the step (1).
  • the extract of step (2) may be an extract extracted by setting the weight ratio of the cultured root: the extracting solvent in which the cultured muscle is dried at 1:10 to 1:70.
  • the weight ratio is 1:10 or more, 1:15 or more, 1:20 or more, 1:25 or more, 1:30 or more, 1:35 or more, 1:40 or more, 1:45 or more, 1:50 or more, 1 It may be: 55 or more, 1:60 or more, or 1:65 or more.
  • the weight ratio is 1:70 or less, 1:65 or less, 1:60 or less, 1:58 or less, 1:55 or less, 1:52 or less, 1:50 or less, 1:48 or less, 1:45 or less, 1:42 or less, 1:40 or less, 1:38 or less, 1:36 or less, 1:35 or less, 1:30 or less, 1:25 or less, 1:20 or less, or 1:15 or less.
  • the bioreactor of step (1) is a Stirred Tank Reactor, a Bubble Column Reactor, an Air Lift Reactor, and a Fludized Bed Reactor. It can be a Reactor, Fixed / Packed Bed Reactor, or Tower Fermenter, preferably a Bub Type bubble bioreactor.
  • the medium of step (1) may be an IBA (indole-3-butyric acid) and a carbon source added.
  • the carbon source is glucose, fructose, mannose, ribose, arabinose, xylose, galactose, sucrose, cellobiose, trehalose, lactose, raffinose, amylose, starch, sorbitol, mannitol, and glycerol. It may be one or more selected.
  • the medium of step (1) has a concentration of ammonium nitrate (NH 4 NO 3 ) of 650 mg / l or more, 660 mg / l or more, 700 mg / l or more, 740 mg / l or more, 760 mg / l or more , 800mg / l or more, 825mg / l or more, 850mg / l or more, 900mg / l or more, 1000mg / l or more, 1200mg / l or more, or 1400mg / l or more.
  • NH 4 NO 3 ammonium nitrate
  • the concentration of the ammonium nitrate is 1500 mg / l or less, 1400 mg / l or less, 1200 mg / l or less, 1000 mg / l or less, 990 mg / l or less, 900 mg / l or less, 850 mg / l or less, 825 mg / l or less , 800 mg / l or less, 760 mg / l or less, 740 mg / l or less, 700 mg / l or less, or 660 mg / l or less.
  • the medium of step (1) has a concentration of calcium chloride (CaCl 2 ⁇ 2H 2 O) of 175 mg / l or more, 176 mg / l or more, 190 mg / l or more, 200 mg / l or more, 220 mg / l or more, It may be 240 mg / l or more, 260 mg / l or more, 264 mg / l or more, 270 mg / l or more, 280 mg / l or more, 300 mg / l or more, 350 mg / l or more, or 380 mg / l or more.
  • CaCl 2 ⁇ 2H 2 O calcium chloride
  • the concentration of the calcium chloride is 400mg / l or less, 380mg / l or less, 350mg / l or less, 300mg / l or less, 280mg / l or less, 270mg / l or less, 264mg / l or less, 260mg / l or less, It may be 240 mg / l or less, 220 mg / l or less, 200 mg / l or less, 190 mg / l or less, or 176 mg / l or less.
  • the medium of step (1) has a concentration of magnesium sulfate (MgSO 4 ⁇ 7H 2 O) of 145 mg / l or more, 148 mg / l or more, 150 mg / l or more, 160 mg / l or more, 180 mg / l or more , 185mg / l or more, 190mg / l or more, 200mg / l or more, 215mg / l or more, 222mg / l or more, 240mg / l or more, 280mg / l or more, or 300mg / l or more.
  • MgSO 4 ⁇ 7H 2 O magnesium sulfate
  • the concentration of magnesium sulfate is 320 mg / l or less, 300 mg / l or less, 280 mg / l or less, 240 mg / l or less, 222 mg / l or less, 215 mg / l or less, 200 mg / l or less, 190 mg / l or less , 185mg / l or less, 180mg / l or less, 160mg / l or less, 150mg / l or less, or 148mg / l or less.
  • the medium of step (1) has a concentration of potassium phosphate (KH 2 PO 4 ) of 65 mg / l or more, 68 mg / l or more, 70 mg / l or more, 75 mg / l or more, 80 mg / l or more, It may be 85 mg / l or more, 90 mg / l or more, 95 mg / l or more, 100 mg / l or more, 102 mg / l or more, 120 mg / l or more, or 140 mg / l or more.
  • KH 2 PO 4 potassium phosphate
  • the concentration of the potassium phosphate is 150 mg / l or less, 140 mg / l or less, 120 mg / l or less, 110 mg / l or less, 102 mg / l or less, 100 mg / l or less, 95 mg / l or less, 90 mg / l Or less, 85 mg / l or less, 80 mg / l or less, 75 mg / l or less, 70 mg / l or less, or 68 mg / l or less.
  • the medium of step (1) has a potassium nitrate (KNO 3 ) concentration of 750 mg / l or more, 760 mg / l or more, 800 mg / l or more, 850 mg / l or more, 900 mg / l or more, 950 mg / l Or more, 1000 mg / l or more, 1140 mg / l or more, 120 mg / l or more, or 1400 mg / l or more.
  • KNO 3 potassium nitrate
  • the potassium nitrate is 1500mg / l or less, 1400mg / l or less, 1300mg / l or less, 1140mg / l or less, 1000mg / l or less, 980mg / l or less, 950mg / l or less, 900mg / l or less, 850mg / l or less, 800 mg / l or less, or 760 mg / l or less.
  • the medium of step (1) may be Murashige and Skoog medium.
  • the type of component in the medium of step (1) is the same as the type of component in the Murashige and Skoog medium, and the concentration of the component is 40% of the component concentration in the Murashige / Scook medium Or more, 45% or more, 50% or more, 55% or more, or 58% or more.
  • the concentration of the component in the medium of step (1) may be 60% or less, 55% or less, 50% or less, or 45% or less of the component concentration in the Murashige / Scook medium.
  • the medium pH when the culture root is placed in the medium in step (1) may be 4.8 to 6.8.
  • the pH may be 4.8 or higher, 5 or higher, 5.2 or higher, 5.4 or higher, 5.6 or higher, 5.8 or higher, 6.0 or higher, 6.2 or higher, 6.4 or higher, or 6.6 or higher.
  • the pH may be 6.8 or less, 6.6 or less, 6.4 or less, 6.2 or less, 6.0 or less, 5.8 or less, 5.6 or less, 5.4 or less, 5.2 or less, 5.0 or less.
  • the density when placing the culture root in the medium in the step (1), may be 2 to 6 g / L. In one aspect, the density may be 2 g / L or more, 3 g / L or more, 4 g / L or more, or 5 g / L or more. In another aspect, the density may be 6 g / L or less, 5 g / L or less, 4 g / L or less, or 3 g / L or less.
  • the proliferation of step (1) may be performed under cancer conditions.
  • the step (1) may be carried out at 19 to 25 °C.
  • the temperature may be 19 ° C or higher, 20 ° C or higher, 21 ° C or higher, 22 ° C or higher, 23 ° C or higher, or 24 ° C or higher.
  • the temperature may be 25 ° C or less, 24 ° C or less, 23 ° C or less, 22 ° C or less, 21 ° C or less, or 20 ° C or less.
  • the air supply amount in step (1) may be 0.05 to 0.4 vvm (air volume / culture volume per min).
  • the air supply amount is 0.05 vvm or more, 0.08 vvm or more, 0.1 vvm or more, 0.12 vvm or more, 0.14 vvm or more, 0.16 vvm or more, 0.18 vvm or more, 0.2 vvm or more, 0.22 vvm or more, 0.24 vvm or more, 0.26 vvm Or more, 0.28 vvm or more, 0.3 vvm or more, 0.32 vvm or more, 0.34 vvm or more, 0.36 vvm or more, or 0.38 vvm or more.
  • the air supply amount is 0.4 vvm or less, 0.38 vvm or less, 0.36 vvm or less, 0.34 vvm or less, 0.32 vvm or less, 0.3 vvm or less, 0.28 vvm or less, 0.26 vvm or less, 0.24 vvm or less, 0.22 vvm or less, 0.2 vvm Or less, 0.18vvm or less, 0.16vvm or less, 0.14vvm or less, 0.12vvm or less, 0.1vvm or less, 0.08vvm or less, or 0.06vvm or less.
  • the growth of step (1) may be performed for 2 to 5 weeks.
  • the proliferation of step (1) may be performed for 2 weeks or more, 3 weeks or more, or 4 weeks or more.
  • the proliferation of step (1) may be performed for 5 weeks or less, 4 weeks or less, or 3 weeks or less.
  • the extraction time of step (2) may be 20 to 28 hours. In one aspect, the extraction time may be 20 hours or more, 22 hours or more, 24 hours or more, 25 hours or more, or 26 hours or more. In another aspect, the extraction time may be 28 hours or less, 26 hours or less, 25 hours or less, 24 hours or less, 22 hours or less, or 21 hours or less.
  • the method has a concentration of 0.5% by weight, 1% by weight, 1.5% by weight, 2% by weight, 2.5% by weight, by adding distilled water to the product of step (3), 3% by weight, 5% by weight or more or 8% by weight or more may further include the step (4) of preparing a reactant.
  • the concentration is 10% or less, 8% or less, 5% or less, 3% or less, 2.5% or less, 2% or less, 1.5% or less, 1% or less, or 0.8% or less You can.
  • the temperature may be 40 degrees C or more, 42 degrees C or more, 44 degrees C or more, 46 degrees C or more, or 48 degrees C or more.
  • the temperature may be 50 degrees C or less, 48 degrees C or less, 46 degrees C or less, 44 degrees C or less, or 42 degrees C or less.
  • the rpm may be 60 or more, 70 or more, 80 or more, 90 or more, or 95 or more.
  • the rpm may be 100 or less, 95 or less, 90 or less, 85 or less, 80 or less, 75 or less, 70 or less or 65 or less.
  • the time may be 38 hours or more, 40 hours or more, 42 hours or more, 44 hours or more, 46 hours or more, 48 hours or more, 50 hours or more, 52 hours or more, 54 hours or more, or 56 hours or more.
  • the time may be 58 hours or less, 56 hours or less, 54 hours or less, 52 hours or less, 50 hours or less, 48 hours or less, 46 hours or less, 44 hours or less, 42 hours or less, or 40 hours or less.
  • the content of coumestrol in the precipitate may be 100 mg or more compared to 1 g of the precipitate.
  • the content is 100 mg or more, 110 mg or more, 120 mg or more, 130 mg or more, 140 mg or more, 142 mg or more, 143 mg or more, 144 mg or more, 144.27 mg or more, 145 mg or more, 145.5 mg or more, 146 mg or more, compared to 1 g of the precipitate It may be 146.4 mg or more, 147 mg or more, 147.5 mg or more, 148 mg or more, 148.5 mg or more, 148.53 mg or more, 149 mg or more, 150 mg or more, 155 mg or more, 160 mg or more, or 170 mg or more.
  • the content is 180 mg or less, 170 mg or less, 160 mg or less, 155 mg or less, 150 mg or less, 149 mg or less, 148.6 mg or less, 148.53 mg or less, 148.5 mg or less, 148 mg or less, 147.5 mg or less, 147 mg compared to 1 g of the precipitate Or less, 146.4mg or less, 146mg or less, 145.5mg or less, 145mg or less, 144.5mg or less, 144.27mg or less, 144mg or less, 143mg or less, 142mg or less, 140mg or less, 130mg or less, 120mg or less or 110mg or less.
  • the preferred content may be 140 to 150 mg compared to 1 g of the precipitate.
  • the above content is a significantly increased content to be close to about 100 times, compared to the case where the enzyme preparation is not treated with the general soybean root extract grown in the field (1.7 to 1.9 mg or less per 1 g of extract). In addition, it is also about 3 times higher than the conventional Murashige / Cook medium.
  • Example 1 Bean seed germination and in-flight plant induction
  • Soybean seeds Glycine max, preferably mythic bean varieties
  • flat soybeans were each sterilized with a 2% by weight aqueous sodium hypochlorite solution for 20 minutes and then washed three times with sterile water. After that, germination of the plant for 2 weeks under the condition of maintaining 25 ⁇ 1 °C in the plane using 0.5 ⁇ 1.0 MS medium (Murashige and Skoog Medium, Haarlem, Netherlands) with sucrose 30g / L added for each bean type Induced.
  • MS medium Merashige and Skoog Medium, Haarlem, Netherlands
  • IBA indole-3-butyric acid, IBA
  • a bulb-type bioreactor commercially available, see FIG. 1 having an air volume of 3 L. Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Germany
  • the cultured muscles were grown for 4 weeks using 2 mg of 0.5 MS medium (Murashige and Skoog medium, Duchefa, The Netherlands) with 4 mg / L and sucrose 30 g / L added.
  • the cultured muscle was grown for 4 weeks under the above conditions and using 1.0 MS medium.
  • the 0.5 MS medium is a medium prepared by setting the concentration of raw materials such as minerals used in the medium to 1/2 of the normal MS medium, and the 1.0 MS medium refers to a medium in which the concentration of the raw material is the same as that of a normal MS medium.
  • the medium was adjusted to pH 5.8 using 1N NaOH and then sterilized at 121 ° C and 1.2 atmosphere for 35 minutes.
  • the cultured muscle was cut into 1-1.5 cm and inoculated into the medium at a 4 g / L inoculation density based on the weight of the body, and then cultured in a dark condition where 22 ⁇ 1 ° C. was maintained. In this process, no pesticides or fertilizers were used.
  • the air supply amount was constantly adjusted to 0.1 vvm (air volume / culture volume per min) using an air flow meter (RMA series; Dwyer Instruments, Inc., USA) for the entire period of incubation.
  • RMA series air flow meter
  • the supplied air is sequentially passed through an air condenser capable of condensing compressed air, a filter capable of removing impurities, and an air dryer, and then used into the bioreactor using an oil-free air compressor. Supplied.
  • the soybean culture roots obtained and dried according to Examples 1 and 2 were immersed in 80% (w / v) ethanol aqueous solution so that the weight ratio of the culture root: ethanol aqueous solution is 1:30 to 1:50 (preferably 1:30). And extracted at room temperature for 24 hours. The extract was filtered using filter paper, and then the solvent was evaporated to dryness to obtain a powder (extract).
  • extract was prepared using the cultured roots produced in Example 1, it was confirmed that the components in the extract were maintained uniformly, and mass production was performed by the extract manufacturing method incorporating passages, etc. It was confirmed that this is possible.
  • the extract powder was treated with distilled water 2 Reactants were prepared at a weight percent concentration (2 weight percent of the mixture of enzyme preparation and extract powder and 98 weight percent of distilled water) (the enzyme preparation contains 1 to 5 weight percent of polygalacturonase as pectinase, enzyme It contains more than 3800 units / ml of polygalacturonase on an active basis).
  • the reaction was maintained (reacted) for 48 hours at °C 45 ° C and 80 rpm, and then the precipitate was recovered using a centrifuge. The recovered precipitate was lyophilized to powder.
  • the content of coumestrol in soybean culture root extract is before the enzyme reaction (extract of 1. in Example 3 above), and after (precipitate of 2. of Example 3 above), the extract is filtered through a 0.45 ⁇ m filter and then equipped with a UV detector. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) was injected and analyzed in 10 ⁇ L increments. As a column, Mightysil RP-18 GP 250-4.6 (5 ⁇ m, KANTO CHEMICALS, JAPAN) was used, and the content of coumestrol in the extract was measured at a wavelength of 342 nm.
  • Table 1 below is a comparison of the content of coomestrol in soybean culture root extracts before and after the enzymatic reaction.
  • the yield refers to the weight of the extract according to 1. of Experimental Example 3 compared to the weight of soybean culture root input, and the weight of the sediment according to 2. of Experimental Example 3 to the weight of soybean culture root as a percentage (%), respectively. It is shown.
  • Coumestrol (mg / g extract) yield(%) Coumestrol (mg / g extract) 0.5 ms 33.7 ⁇ 0.04 1.8 ⁇ 0.10 5.6 ⁇ 0.20 146.4 ⁇ 2.13 1.0 ms 35.6 ⁇ 0.33 1.0 ⁇ 0.07 3.4 ⁇ 0.04 51.0 ⁇ 0.79
  • MS is an abbreviation for Murashige / Scook medium
  • the 0.5 MS medium is a medium prepared by setting the concentration of raw materials such as minerals used in the medium to 1/2 of the normal MS medium
  • the 1.0 MS medium is Concentration of the raw material refers to a medium that is the same as a normal MS medium
  • Figures 2a and 2b shows the results confirmed by HPLC chromatograms for the cosmetrin and coumestrol in the soybean culture root extract before and after the enzymatic reaction.

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Abstract

본 명세서는 콩과식물 배양근을 이용한 쿠메스트롤 생산 방법 및 쿠메스트롤 함량이 증진된 콩과식물 추출물 제조 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 일 측면에 따른 방법은 콩과 식물 및 효소를 이용하여, 생성되는 쿠메스트롤을 균일하게 고함량으로 얻을 수 있으므로, 기존 방법 보다 비용 및 시간을 절약할 수 있으며, 천연물을 이용하여 생산된 쿠메스트롤이므로 약학, 식품 또는 화장품을 예로 들 수 있는 다양한 분야에 안전하게 활용 가능하다.

Description

콩과식물 배양근을 이용한 쿠메스트롤 생산 방법
본 명세서는 콩과식물 배양근을 이용한 쿠메스트롤 생산 방법 및 쿠메스트롤 함량이 증진된 콩과식물 추출물 제조 방법에 관한 것이다.
갱년기 여성들을 위한 에스트로겐 요법에서 강력한 에스트로겐 효과를 갖고 있는 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol; DES) 등의 저렴한 합성 에스트로겐의 사용이 미국 FDA에 의해 전면 금지된 이후로 여성호르몬을 대체해 줄 수 있는 천연의 식물성 에스트로겐(phytoestrogen)에 관심이 모아지고 있다. 그러나 이러한 물질들은 천연에 극미량으로 존재하기 때문에 대량 확보가 매우 어려운 실정이다. 또한 과거 반세기에 걸쳐 이러한 물질들의 대량 합성 기술개발에 미온적이었기 때문에 두드러진 성과는 없었으며 비록 간헐적으로나마 합성법 개발에 대한 보고가 있기는 하나 이 역시 실험실적 수준에 그치고 있기 때문에 현재까지 이렇다 할 만한 손쉬운 대량 제조방법이 전무한 상태이다.
쿠메스트롤(coumestrol)은 식물성 에스트로겐 중에서 현재까지 가장 강력한 것으로 알려져 있는 물질로서 주로 콩과(leguminosae), 국화과(compositae) 식물의 씨앗, 뿌리 그리고 잎에서 발견되는 물질로써 이소플라보노이드(isoflavonoid)의 일종으로 일반적으로는 쿠메스탄(coumestan) 계열 화합물로 분류되고 있다. 쿠메스트롤은 식물이 외상을 입었을 때 상처 부위에 짙은 농도로 분비되어 항산화, 항염 및 항독소 작용을 통해 항균, 항진균 및 항바이러스 작용을 하여 감염을 방지하는 역할을 하는 것이 알려지면서 주목을 받았던 물질이다. 이러한 현상은 다양한 박테리아 및 곰팡이류, 바이러스 등의 감염이 쿠메스트롤을 포함한 다양한 방향족 화합물(aromatic compounds)의 합성을 유도하기 때문이다. 이러한 쿠메스트롤의 항생 작용의 근원은 항산화제로서의 화학적 기본 골격인 페놀성 구조를 보유하고 있어 프리 라디칼성(free radicals) 산화제의 유입을 억제하여 생체 내 과산화 화합물 생성을 저지하기 때문으로 알려지고 있다. 또한 다양한 천연 쿠메스탄 계열의 유도체들 중에서 오직 쿠메스트롤만이 에스트로겐 효과를 갖고 있는 것으로 알려지고 있다. 에스트로겐 효과에 대한 실험은 미숙한 쥐에게 경구 투여한 후 자궁의 무게 변화에 기초하여 평가되었다. 이러한 실험 결과에서 특기할 만한 사항으로 쿠메스트롤은 어린 암쥐에서는 효과적으로 에스트로겐 효과가 나타났지만 성숙한 숫컷 동물들에게는 활성을 나타내지 않았으며 독성이 전혀 없는 것으로 나타났다.
그러나, 쿠메스트롤은 일부 식물체에 극미량으로 존재하므로 현재 상용되는 천연 쿠메스트롤은 고가로 시판되고 있다. 이러한 이유로 합성을 통해 쿠메스트롤을 얻으려는 연구가 간헐적으로 시도되어 왔으나 여러 개의 방향족 고리가 융합되어 있는 다소 복잡한 화학 구조 때문에 손쉬운 합성법 개발에 대한 접근법이 소개되지 않고 있으며, 비록 몇 가지의 합성법이 보고되고 있으나 각 합성법들은 아래에 설명하는 다양한 문제점을 내포하고 있어 상용화에 많은 어려움이 따르고 있다. 또한 최근에 화학적 합성법에 의해 생산한 성분 보다는 천연에서 생산한 성분이 안전성 측면에서 좋은 이미지를 가지고 있기 때문에 천연 물질에서 대량으로 생산 할 수 있는 방법에 대한 연구가 필요한 실정이다.
본 명세서는 천연 원료를 이용하여 효율적이면서도 균일하게 쿠메스트롤을 고함량으로 생산하는 방법을 제공하는 것을 과제로 하고 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 명세서는 (1) 콩과식물 배양근을 생물반응기 내의 배지에 위치시켜 상기 생물반응기 내에서 공기공급량을 일정하게 유지하며 증식시키는 단계; (2) 상기 (1) 단계를 거친 배양근으로부터 추출물을 얻는 단계; 및 (3) 상기 추출물에 효소 또는 이를 생산하는 미생물을 처리하는 단계를 포함하는, 쿠메스트롤 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 명세서는 상기 단계 (1) 내지 단계 (3)을 포함하는, 쿠메스트롤 함량이 증진된 콩과식물 추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따른, 쿠메스트롤 생산방법은 콩과 식물 및 효소를 이용한 것으로서, 생성되는 쿠메스트롤을 균일하게 고함량으로 얻을 수 있으므로, 기존 방법 보다 비용 및 시간을 절약할 수 있으며, 합성이 아닌 천연물을 이용하여 생산된 쿠메스트롤이므로 이렇게 생산한 쿠메스트롤은 약학, 식품 또는 화장품을 예로 들 수 있는 다양한 분야에 안전하게 활용 가능하다.
도 1은 본 발명의 일 측면에 따른 엑스플랜테이션 기술을 이용하여, 4주간 콩 배양근을 배양한 모습을 나타낸 것이다.
도 2a 및 도 2b는 효소 반응 전후의 콩 배양근 추출물 내 쿠메스트린과 쿠메스트롤을 HPLC 크로마토그램으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
본 명세서에서, 엑스플랜테이션(explantation)이란, 외식(外植) 또는 체외배양이라고도 하고, 주로 동식물 개체의 일부를 분리하여 체외에서 배양하는 기술이다. 주로 일정 기간에 걸쳐 체외에서 생존하며 차차 어떤 발생적 변화가 보일 정도로 시간을 두고 배양을 하는 것을 포함한다. 일반적인 조직배양(組織培養)도 체외배양의 한 방법이다. 또한, 본 발명의 일 측면에 따른 기내 배양도 체외배양에 포함된다.
본 명세서에서 엑스플랜테이션 기술은, 원형질체, 세포, 조직, 기관, 배, 종자, 배양근 및 식물체의 일부를 포함하는 군에서 선택된 하나 이상을 특정 성분이 첨가된 배지 등의 인공 배양 기구에서 키우는 것을 포함한다.
본 명세서에서 “효소 제제(enzyme preparation)”란, 단일 또는 여러 종류의 활성 효소와 부형제, 첨가제 등을 포함하는 제제로서, 시판되는 것은 물론 연구실에서 임의 제조한 것일 수도 있다. 본 명세서 내의 효소 제제의 일 예는, 아스퍼질러스 아큘레아투스(Aspergillus aculeatus)로부터 유래한 펙티나아제 일종인 폴리갈락투로나제를 포함하는 효소 제제로서, 바람직하게는 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex Ultra SP-L, Novozyme사, 덴마크)일 수 있다.
본 발명은 일 측면에서, (1) 콩과식물 배양근을 생물반응기 내의 배지에 위치시켜 상기 생물반응기 내에서 공기공급량을 일정하게 유지하며 증식시키는 단계; (2) 상기 (1) 단계를 거친 배양근으로부터 추출물을 얻는 단계; 및 (3) 상기 추출물에 효소 제제, 효소 또는 이를 생산하는 미생물을 첨가하는 단계를 포함하는, 쿠메스트롤 생산 방법일 수 있다.
본 발명은 다른 측면에서, 상기 단계 (1) 내지 단계 (3)을 포함하는, 쿠메스트롤 함량이 증진된 콩과식물 추출물의 제조방법, 콩과식물 추출물 내의 쿠메스트롤 함량 증진방법일 수 있다.
일 구현 예로서, 상기 콩과식물은 콩일 수 있다. 다른 구현 예로서, 상기 콩은 대두, 납작콩, 서리태, 서목태, 흑태, 청태, 황태, 울타리콩, 강낭콩, 얼룩강낭콩, 적두, 거두, 또는 콩나물콩일 수 있고, 바람직하게는 대두 또는 납작콩일 수 있다. 상기 콩의 품종은 제한이 없으나, 일 측면에서 장류 및 두부용, 나물용, 밥밑용 또는 풋콩용 품종일 수 있다. 장류 및 두부용 품종으로는, 대풍(Daepung, 품종보호출원 출원-2003-152), 호장(Hojang, 품종보호출원 출원-2003-155), 장원(Jangwon, 품종보호출원 출원-2001-34), 대황(품종보호출원 출원-2000-19), 소담(Sodamkong, 품종보호출원 출원-1999-19), 송학(품종보호출원 출원-1999-22), 대원(Daewonkong, 품종명칭등록번호 제01-0003-38호), 진품(Jinpumkong, 품종보호출원 출원-1998-204), 단백(Danbaegkong, 품종보호출원 출원-1998-201), 두유(Duyoukong, 품종보호출원 출원-1998-151), 신팔달(Shinpaldalkong, 품종보호출원 출원-1998-199), 태광(Taekwangkong, 품종보호출원 출원-1998-198), 만리(Mallikong, 품종명칭등록번호 제01-0003-11호), 장수(Jangsukong, 품종명칭등록번호 제01-0003-9호), 무한(Muhankong, 품종명칭등록번호 제01-0003-7호), 백운(Baegunkong, 품종보호출원 출원-1998-193), 새알(Saealkong, 품종보호출원 출원-1998-143), 황금(품종명칭등록번호 제01-0003-1호) 및 장엽(품종명칭등록번호 제01-0003-41호) 등이 있다. 나물용 품종으로는, 신화(Shinhwa, 품종명칭등록번호 제01-0003-134호), 소원(Sowon, 품종보호출원 출원-2000-16), 안평(Anpyeong, 품종보호출원 출원-2003-151), 서남(Sunam, 품종보호출원 출원-2003-153), 다채(Dachae, 품종보호출원 출원-2003-148), 소록(품종보호출원 출원-2002-116), 소호(Sohokong, 품종보호출원 출원-2001-36), 소명(Somyeongkong, 품종보호출원 출원-1998-18), 다원(품종보호출원 출원-1998-209), 풍산나물(Pungsannamul, 품종보호출원 출원-1998-140), 익산나물(Iksannamul, 품종보호출원 출원-1998-139), 소백나물(품종명칭등록번호 제01-0003-31호), 광안(Kwangankong, 품종보호출원 출원-1998-202), 단엽 및 은하(Eunhakong, 품종명칭등록번호 제01-0003-6호) 등이 있다. 밥밑용 품종으로는, 청자(Cheongjakong, 품종보호출원 출원-2001-38), 흑청(Heugcheong, 품종보호출원 출원-2000-27), 갈미(품종보호출원 출원-2000-25), 선흑(Seonheukkong, 품종보호출원 출원-1999-20), 검정콩 및 일품검정콩(품종보호출원 출원-1998-158) 등이 있다. 또한, 풋콩용 품종으로는, 다올(Daol, 품종보호출원 출원-2003-149), 신록(품종보호출원 출원-2001-35), 새을, 검정을, 석량풋콩, 화엄풋콩(품종명칭등록번호 제01-0003-21호) 및 큰을 등이 있다. 본 발명의 다른 일 측면에서, 콩은 발아가 가능하고 병충해에 강한 품종인 것이 바람직하다. 그와 같은 콩으로는, 예를 들어 신화, 소원, 안평, 서남, 다채, 소록, 소호, 소명, 다원, 풍산나물, 익산나물, 소백나물, 광안, 단엽 및 은하 등이 있다. 그러나 본 발명의 일 측면에 따른 콩이 상기 콩 품종에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 측면에 따른 납작콩은 납떼기콩, 납데기콩, 납쪼레기콩, 납드레콩, 납작콩 등으로 다양하게 불린다.
일 측면에서 상기 방법은 (1) 단계 이전에 배지 내에서 콩과식물을 발아시키는 단계를 포함할 수 있다. 다른 측면에서, 상기 방법은 (1) 단계 이전에 콩과식물의 식물체로부터 콩과식물 배양근을 유도하는 단계도 포함할 수 있다.
일반적으로 노지에서 재배하여 일반적인 방법으로 추출한 콩과식물 추출물은 성분 등이 일정하지 않으므로 특정 목적 달성을 위한 조성물의 균일한 대량생산이 매우 어렵다. 그러나, 본 발명의 일 측면에 따른 방법에 의하면, 외부 영향 요인 등을 최소화한 엑스플랜테이션 기술을 이용하여 쿠메스트롤을 균일하게 대량으로 생산할 수 있다.
일 구현 예로서, (3) 단계의 상기 효소 제제 내의 효소 또는 (3) 단계의 상기 효소는 펙티나아제(pectinase)일 수 있다.
다른 구현 예로서, (3) 단계의 상기 효소 제제 내의 효소 또는 (3) 단계의 상기 효소는 폴리갈락투로나제(Polygalacturonase)일 수 있다.
다른 구현 예로서, (3) 단계의 상기 효소 제제 내 효소의 양은 효소 제제 총 중량을 기준으로 0.5 내지 10 중량%일 수 있다. 일 측면에서, (3) 단계의 상기 미생물은 아스퍼질러스 아큘레아투스(Aspergillus aculeatus)일 수 있다. 상기 효소 또는 효소 제제는 상기 아스퍼질러스 아큘레아투스에서 유래된 것이기 때문에, 상기 미생물을 이용한 처리 또는 발효를 통해 상기 효소 또는 효소 제제를 사용한 것과 같은 효과를 얻을 수 있다.
다른 구현 예로서, (3) 단계의 상기 효소 제제의 첨가량은 상기 (2) 단계를 거친 추출물 대비 50 중량% 이상, 60중량% 이상, 70중량% 이상, 80중량% 이상, 90중량% 이상, 100중량% 이상 또는 110중량% 이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 효소 제제의 첨가량은 120중량% 이하, 110중량% 이하, 100중량% 이하, 90중량% 이하, 80중량% 이하, 70중량% 이하 또는 60중량% 이하일 수 있다. 바람직하게는, 상기 (3) 단계의 상기 효소 제제의 첨가량은 상기 (2) 단계를 거친 추출물 대비 90 내지 110중량%일 수 있다.
일 구현 예로서, (3) 단계의 상기 효소의 첨가량은 상기 (2) 단계를 거친 추출물 100중량부 대비 0.8 내지 8중량부일 수 있다. 일 측면에서, 상기 효소의 첨가량은 상기 (2) 단계를 거친 추출물 100중량부 대비 0.8 중량부 이상, 0.9 중량부 이상, 1중량부 이상, 1.2중량부 이상, 1.5중량부 이상, 2중량부 이상, 2.5중량부 이상, 3중량부 이상, 3.5중량부 이상, 4중량부 이상, 4.5중량부 이상, 5중량부 이상, 5.5중량부 이상, 6중량부 이상, 6.5중량부 이상, 7중량부 이상 또는 7.5중량부 이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 효소의 첨가량은 상기 (2) 단계를 거친 추출물 100중량부 대비 8중량부 이하, 7.5중량부 이하, 7중량부 이하, 6.5중량부 이하, 6중량부 이하, 5.5중량부 이하, 5중량부 이하, 4.5중량부 이하, 4중량부 이하, 3.5중량부 이하, 3중량부 이하, 2.5중량부 이하, 2중량부 이하, 1.8중량부 이하, 1.5중량부 이하, 1.2중량부 이하 또는 1중량부 이하일 수 있다.
일 측면에서 상기 효소 제제의 효소는 식물 조직에서 펙틴을 분해하는 효소일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 효소 제제는 아스퍼질러스 아큘레아투스(Aspergillus aculeatus)로부터 유래한 펙티나아제 일종인 폴리갈락투로나제(Polygalacturonase)를 효소로서 포함하는 것일 수 있다. 또 다른 측면에서, 상기 효소 제제는 효소로서 펙틴트랜셀리미나제(pectintranseliminase), 펙티네스터라제(pectinesterase), 헤미셀룰라제(hemicellulase) 및 셀룰라제(cellulases)를 더 포함하는 것일 수 있다. 또 다른 측면에서, 상기 효소 제제는 pectinex ultra SP-L(노보자임사, 덴마크)일 수 있다.
일 구현 예로서, 상기 효소 제제 내에 포함된 폴리갈락투로나제의 양은 효소 활성(Enzymatic Activity) 기준으로 2000units/mL 이상, 2200units/mL 이상, 2400units/mL 이상, 2600units/mL 이상, 2800units/mL 이상, 3000units/mL 이상, 3200units/mL 이상, 3400units/mL 이상, 3600units/mL 이상, 3800 units/mL 이상, 4000units/mL 이상, 4200units/mL 이상, 4400units/mL 이상, 4600units/mL 이상 또는 4800units/mL 이상일 수 있다. 또한, 상기 양은 5000units/mL 이하, 4800units/mL 이하, 4600units/mL 이하, 4400units/mL 이하, 4200units/mL 이하, 4000units/mL 이하, 3800units/mL 이하, 3600units/mL 이하, 3400units/mL 이하, 3200units/mL 이하, 3000units/mL 이하, 2500units/mL 이하 또는 2400units/mL 이하일 수 있다. 바람직하게는 상기 효소 제제 내에 포함된 폴리갈락투로나제의 양이 3800 units/mL 이상일 수 있다.
일 구현 예에서, (3) 단계의 상기 효소의 첨가량은 효소 활성을 기준으로 상기 (2) 단계를 거친 추출물 1g 대비 2000 내지 5000 units일 수 있다. 일 측면에서, (3) 단계의 상기 효소의 첨가량은 효소 활성을 기준으로 상기 (2) 단계를 거친 추출물 1g 대비 2000units 이상, 2200units 이상, 2400units 이상, 2600units 이상, 2800units 이상, 3000units 이상, 3200units 이상, 3400units 이상, 3600units 이상, 3800 units 이상, 4000units 이상, 4200units 이상, 4400units 이상, 4600units 이상 또는 4800units 이상일 수 있다. 또한, 상기 첨가량은 효소 활성을 기준으로 상기 (2) 단계를 거친 추출물 1g 대비 5000units 이하, 4800units 이하, 4600units 이하, 4400units 이하, 4200units 이하, 4000units 이하, 3800units 이하, 3600units 이하, 3400units 이하, 3200units 이하, 3000units 이하, 2500units 이하 또는 2400units 이하일 수 있다. 바람직하게는 또한, 상기 첨가량은 효소 활성을 기준으로 상기 (2) 단계를 거친 추출물 1g 대비 3500 내지 4200 units일 수 있다.
일 측면에서, 상기 효소 제제 내의 폴리갈락투로나제의 양은 상기 효소 제제 총중량을 기준으로 0.1 중량% 이상, 0.5 중량% 이상, 0.8 중량% 이상, 1 중량% 이상, 1.2 중량% 이상, 1.4 중량% 이상, 1.6 중량% 이상, 1.8 중량% 이상, 2 중량% 이상, 2.2 중량% 이상, 2.6 중량% 이상, 2.8 중량% 이상, 3 중량% 이상, 3.2 중량% 이상, 3.4 중량% 이상, 3.6 중량% 이상, 3.8 중량% 이상, 4 중량% 이상, 4.2 중량% 이상, 4.4 중량% 이상, 4.6 중량% 이상, 4.8 중량% 이상, 5 중량% 이상, 5.2 중량% 이상, 5.4 중량% 이상, 5.6 중량% 이상, 6 중량% 이상, 6.5 중량% 이상 또는 7 중량% 이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 폴리갈락투로나제의 양은 8 중량% 이하, 7.5 중량% 이하, 7중량% 이하, 6.5중량% 이하, 6중량% 이하, 5.8중량% 이하, 5.6중량% 이하, 5.4중량% 이하, 5.2중량% 이하, 5중량% 이하, 4.8중량% 이하, 4.6중량% 이하, 4.4중량% 이하, 4.2중량% 이하, 4중량% 이하, 3.8중량% 이하, 3.6중량% 이하, 3.4중량% 이하, 3.2중량% 이하, 3중량% 이하, 2.8중량% 이하, 2.6중량% 이하, 2.4중량% 이하, 2.2중량% 이하, 2중량% 이하, 1.8중량% 이하, 1.6중량% 이하, 1.4중량% 이하, 1.2중량% 이하, 1중량% 이하, 0.8중량% 이하, 0.6중량% 이하, 0.4중량% 이하 또는 0.2중량% 이하일 수 있다. 상기 효소 제제 내의 폴리갈락투로나제의 바람직한 양은 1 내지 5 중량%일 수 있다.
일 측면에서, 상기 효소 제제의 기능 및 역할은 추출물 내 쿠메스트린으로부터 당을 제거함으로써 쿠메스트린이 쿠메스트롤로 전환될 수 있도록 하는 것이며, 콩과식물 배양근의 품질을 균일하게 유지하며 대량 생산하는 엑스플랜테이션 방법과 이러한 효소 제제의 기술적 특징을 접목함으로써, 쿠메스트롤의 수율이 현저히 향상되면서도 균일하게 유지될 수 있는 것이다.
다른 구현 예로서, (1) 단계의 상기 콩과식물은 콩일 수 있다.
다른 구현 예로서, (1) 단계의 상기 콩과식물은 대두 또는 납작콩일 수 있다.
다른 구현 예로서, (2) 단계의 상기 추출물은 물, C1 내지 C6의 저급 알코올, 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출한 것일 수 있다.
일 측면에서, 상기 혼합물의 알코올 농도는 60 내지 100%(w/v)일 수 있다. 일 측면에서, 상기 알코올 농도는 60%(w/v)이상, 70%(w/v)이상, 75%(w/v)이상, 80%(w/v)이상, 85%(w/v)이상, 90%(w/v)이상, 또는 95%(w/v)이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 알코올 농도는 100%(w/v)이하, 95%(w/v)이하, 90%(w/v)이하, 85%(w/v)이하, 80%(w/v)이하, 75%(w/v)이하, 70%(w/v)이하, 또는 65%(w/v)이하일 수 있다.
다른 측면에서, 상기 저급 알코올은 에탄올일 수 있다.
다른 측면에서, 상기 (2) 단계는 상기 (1) 단계를 거친 배양근을 건조시킨 후 그 건조된 배양근에 상기 용매를 이용하여 추출물을 얻는 단계일 수 있다.
또 다른 측면에서, (2) 단계의 상기 추출물은 상기 배양근을 건조시킨 배양근 : 추출용매의 중량비율을 1:10 내지 1:70으로 하여 추출한 추출물일 수 있다. 상기 중량비율은 1:10이상, 1:15이상, 1:20이상, 1:25이상, 1:30이상, 1:35이상, 1:40이상, 1:45이상, 1:50이상, 1:55이상, 1:60이상 또는 1:65이상일 수 있다. 또한 상기 중량비율은 1:70이하, 1:65이하, 1:60이하, 1:58이하, 1:55이하, 1:52이하, 1:50이하, 1:48이하, 1:45이하, 1:42이하, 1:40이하, 1:38이하, 1:36이하, 1:35이하, 1:30이하, 1:25이하, 1:20이하 또는 1:15이하일 수 있다.
일 구현 예로서, (1) 단계의 상기 생물반응기는 스터드 탱크 리액터(Stirred Tank Reactor), 버블 컬럼 리액터(Bubble Column Reactor), 에어 리프트 리액터(Air Lift Reactor), 플루다이즈드 베드 리액터(Fludized Bed Reactor), 픽스트/팩드 베드 리액터(Fixed/Packed Bed Reactor), 또는 타워 퍼멘터(Tower Fermenter)일 수 있고, 바람직하게는 벌브형 기포 생물반응기(Bulb Type bubble bioreactor)일 수 있다.
다른 구현 예로서, 상기 (1) 단계의 배지는 IBA(indole-3-butyric acid) 및 탄소원이 첨가된 것일 수 있다. 일 측면에서 상기 탄소원은 포도당, 프럭토스, 만노스, 리보스, 아라비노스, 자일로스, 갈락토스, 수크로스, 셀로비오스, 트레할로스, 락토스, 라피노스, 아밀로스, 스타치, 소르비톨, 만니톨, 및 글리세롤로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
일 구현 예로서, 상기 (1) 단계의 배지는 질산암모늄(NH4NO3)의 농도가 650 mg/l 이상, 660 mg/l 이상, 700mg/l 이상, 740mg/l 이상, 760mg/l 이상, 800mg/l 이상, 825mg/l 이상, 850mg/l 이상, 900mg/l 이상, 1000mg/l 이상, 1200mg/l 이상 또는 1400mg/l 이상일 수 있다. 다른 구현 예로서, 상기 질산암모늄의 농도는 1500mg/l 이하, 1400mg/l 이하, 1200mg/l 이하, 1000mg/l 이하, 990mg/l 이하, 900mg/l 이하, 850mg/l 이하, 825mg/l 이하, 800mg/l 이하, 760mg/l 이하, 740mg/l 이하, 700mg/l 이하 또는 660mg/l 이하일 수 있다.
일 구현 예로서, 상기 (1) 단계의 배지는 염화칼슘(CaCl2·2H2O)의 농도가 175mg/l 이상, 176mg/l 이상, 190mg/l 이상, 200mg/l 이상, 220mg/l 이상, 240mg/l 이상, 260mg/l 이상, 264mg/l 이상, 270mg/l 이상, 280mg/l 이상, 300mg/l 이상, 350mg/l 이상 또는 380mg/l 이상일 수 있다. 다른 구현 예로서, 상기 염화칼슘의 농도는 400mg/l 이하, 380mg/l 이하, 350mg/l 이하, 300mg/l 이하, 280mg/l 이하, 270mg/l 이하, 264mg/l 이하, 260mg/l 이하, 240mg/l 이하, 220mg/l 이하, 200mg/l 이하, 190mg/l 이하 또는 176mg/l 이하일 수 있다.
일 구현 예로서, 상기 (1) 단계의 배지는 황산마그네슘(MgSO4·7H2O)의 농도가 145mg/l 이상, 148mg/l 이상, 150mg/l 이상, 160mg/l 이상, 180mg/l 이상, 185mg/l 이상, 190mg/l 이상, 200mg/l 이상, 215mg/l 이상, 222mg/l 이상, 240mg/l 이상, 280mg/l 이상 또는 300mg/l 이상일 수 있다. 다른 구현 예로서, 상기 황산마그네슘의 농도는 320mg/l 이하, 300mg/l 이하, 280mg/l 이하, 240mg/l 이하, 222mg/l 이하, 215mg/l 이하, 200mg/l 이하, 190mg/l 이하, 185mg/l 이하, 180mg/l 이하, 160mg/l 이하, 150mg/l 이하 또는 148mg/l 이하일 수 있다.
일 구현 예로서, 상기 (1) 단계의 배지는 인산칼륨(KH2PO4)의 농도가 65 mg/l 이상, 68mg/l 이상, 70mg/l 이상, 75mg/l 이상, 80mg/l 이상, 85mg/l 이상, 90mg/l 이상, 95mg/l 이상, 100mg/l 이상, 102mg/l 이상, 120mg/l 이상 또는 140mg/l 이상일 수 있다. 다른 구현 예로서, 상기 인산칼륨의 농도는 150　mg/l 이하, 140mg/l 이하, 120mg/l 이하, 110mg/l 이하, 102mg/l 이하, 100mg/l 이하, 95mg/l 이하, 90mg/l 이하, 85mg/l 이하, 80mg/l 이하, 75mg/l 이하, 70mg/l 이하 또는 68mg/l 이하일 수 있다.
일 구현 예로서, 상기 (1) 단계의 배지는 질산칼륨(KNO3)의 농도가 750mg/l 이상, 760mg/l 이상, 800mg/l 이상, 850mg/l 이상, 900mg/l 이상, 950mg/l 이상, 1000mg/l 이상, 1140mg/l 이상, 120mg/l 이상 또는 1400mg/l 이상일 수 있다. 다른 구현 예로서 상기 질산칼륨은 1500mg/l 이하, 1400mg/l 이하, 1300mg/l 이하, 1140mg/l 이하, 1000mg/l 이하, 980mg/l 이하, 950mg/l 이하, 900mg/l 이하, 850mg/l 이하, 800mg/l 이하 또는 760mg/l 이하일 수 있다.
다른 구현 예로서, 상기 (1) 단계의 배지는 무라시게/스쿡(Murashige and Skoog) 배지일 수 있다.
일 측면에서, 상기 (1) 단계의 배지 내 성분의 종류는 무라시게/스쿡(Murashige and Skoog) 배지 내 성분의 종류와 동일하고, 상기 성분의 농도는 무라시게/스쿡 배지 내 성분 농도의 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 또는 58% 이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 (1) 단계의 배지 내 성분의 농도는 무라시게/스쿡 배지 내 성분 농도의 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하 또는 45% 이하일 수 있다.
다른 구현 예로서, 상기 (1) 단계에서 상기 배양근을 배지에 위치시킬 때의 배지 pH는 4.8 내지 6.8일 수 있다. 일 측면에서 상기 pH는 4.8이상, 5이상, 5.2이상, 5.4이상, 5.6이상, 5.8이상, 6.0이상, 6.2이상, 6.4이상, 또는 6.6이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 pH는 6.8이하, 6.6이하, 6.4이하, 6.2이하, 6.0이하, 5.8이하, 5.6이하, 5.4이하, 5.2이하, 5.0이하일 수 있다.
다른 구현 예로서, 상기 (1) 단계에서 상기 배양근을 배지에 위치시킬 때 밀도는 2 내지 6 g/L일 수 있다. 일 측면에서 상기 밀도는 2g/L이상, 3g/L이상, 4g/L이상, 또는 5g/L이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 밀도는 6g/L이하, 5g/L이하, 4g/L이하, 또는 3g/L이하일 수 있다.
다른 구현 예로서, 상기 (1) 단계의 증식은 암조건에서 실시하는 것일 수 있다.
다른 구현 예로서, 상기 (1) 단계는 19 내지 25℃에서 실시하는 것일 수 있다. 일 측면에서 상기 온도는 19℃이상, 20℃이상, 21℃이상, 22℃이상, 23℃이상, 또는 24℃이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 온도는 25℃이하, 24℃이하, 23℃이하, 22℃이하, 21℃이하, 또는 20℃이하일 수 있다.
또 다른 구현 예로서, 상기 (1) 단계의 공기공급량은 0.05 내지 0.4 vvm(air volume/culture volume per min)일 수 있다. 일 구현 예로서 상기 공기공급량은 0.05vvm이상, 0.08vvm이상, 0.1vvm이상, 0.12vvm이상, 0.14vvm이상, 0.16vvm이상, 0.18vvm이상, 0.2vvm이상, 0.22vvm이상, 0.24vvm이상, 0.26vvm이상, 0.28vvm이상, 0.3vvm이상, 0.32vvm이상, 0.34vvm이상, 0.36vvm이상, 또는 0.38vvm이상 일 수 있다. 다른 구현 예로서 상기 공기공급량은 0.4vvm이하, 0.38vvm이하, 0.36vvm이하, 0.34vvm이하, 0.32vvm이하, 0.3vvm이하, 0.28vvm이하, 0.26vvm이하, 0.24vvm이하, 0.22vvm이하, 0.2vvm이하, 0.18vvm이하, 0.16vvm이하, 0.14vvm이하, 0.12vvm이하, 0.1vvm이하, 0.08vvm이하, 또는 0.06vvm이하일 수 있다.
다른 구현 예로서, 상기 (1) 단계의 증식은 2 내지 5주간 실시하는 것일 수 있다. 일 측면에서 상기 (1) 단계의 증식은 2주 이상, 3주 이상 또는 4주 이상 실시하는 것일 수 있다. 다른 측면에서 상기 (1) 단계의 증식은 5주 이하, 4주 이하 또는 3주 이하 실시하는 것일 수 있다.
다른 구현 예로서, 상기 (2) 단계의 추출 시간은 20 내지 28시간일 수 있다. 일 측면에서 상기 추출 시간은 20시간 이상, 22시간 이상, 24시간 이상, 25시간 이상, 또는 26시간 이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 추출 시간은 28시간 이하, 26시간 이하, 25시간 이하, 24시간 이하, 22시간 이하, 또는 21시간 이하일 수 있다.
또 다른 구현 예로서, 상기 방법은 상기 (3) 단계의 결과물에 증류수를 가하여 상기 결과물의 농도가 0.5중량%이상, 1중량%이상, 1.5중량%이상, 2 중량%이상, 2.5중량%이상, 3중량%이상, 5중량%이상 또는 8중량%이상인 반응물을 제조하는 (4) 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 일 측면에서 상기 농도는 10중량% 이하, 8중량% 이하, 5중량% 이하, 3중량% 이하, 2.5중량% 이하, 2중량% 이하, 1.5중량% 이하, 1중량% 이하 또는 0.8중량% 이하일 수 있다.
또 다른 구현 예로서, 상기 (3) 단계 또는 (4) 단계 이후에 40 내지 50도씨 및 60 내지 100 rpm의 조건에서 38 내지 58시간 동안 유지 후 원심분리하여 침전물을 회수하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다. 일 측면에서, 상기 온도는 40도씨 이상, 42도씨 이상, 44도씨 이상, 46도씨 이상 또는 48도씨 이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 온도는 50도씨 이하, 48도씨 이하, 46도씨 이하, 44도씨 이하 또는 42도씨 이하일 수 있다. 일 측면에서 상기 rpm은 60이상, 70이상, 80이상, 90이상 또는 95이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 rpm은 100이하, 95이하, 90이하, 85이하, 80이하, 75이하, 70이하 또는 65이하일 수 있다. 일 측면에서 상기 시간은 38시간 이상, 40시간 이상, 42시간 이상, 44시간 이상, 46시간 이상, 48시간 이상, 50시간 이상, 52시간 이상, 54시간 이상 또는 56시간 이상일 수 있다. 다른 측면에서 상기 시간은 58시간 이하, 56시간 이하, 54시간 이하, 52시간 이하, 50시간 이하, 48시간 이하, 46시간 이하, 44시간 이하, 42시간 이하 또는 40시간 이하일 수 있다.
상기 방법을 이용하여 성장촉진제나 비료, 농약 등의 사용 없이 친환경적이고도 균일하게 콩과식물 배양조직을 대량으로 수득하여, 친환경적이고도 균일한 효과를 발휘하는 상기 추출물 및 조성물을 대량으로 제조할 수 있다.
다른 구현 예로서, 상기 침전물 내 쿠메스트롤의 함량은 침전물 1g 대비 100 mg 이상일 수 있다. 일 측면에서, 상기 함량은 상기 침전물 1g 대비 100 mg 이상, 110mg 이상, 120mg 이상, 130mg 이상, 140mg 이상, 142mg 이상, 143mg 이상, 144mg 이상, 144.27mg 이상, 145mg 이상, 145.5mg 이상, 146mg 이상, 146.4mg 이상, 147mg 이상, 147.5mg 이상, 148mg 이상, 148.5mg 이상, 148.53mg 이상, 149mg 이상, 150mg 이상, 155mg 이상, 160mg 이상, 또는 170mg 이상일 수 있다. 다른 측면에서, 상기 함량은 상기 침전물 1g 대비 180 mg 이하, 170mg 이하, 160mg 이하, 155mg 이하, 150mg 이하, 149mg 이하, 148.6mg 이하, 148.53mg 이하, 148.5mg 이하, 148mg 이하, 147.5mg 이하, 147mg 이하, 146.4mg 이하, 146mg 이하, 145.5mg 이하, 145mg 이하, 144.5mg 이하, 144.27mg 이하, 144mg 이하, 143mg 이하, 142mg 이하, 140mg 이하, 130mg 이하, 120mg 이하 또는 110mg 이하일 수 있다. 예시적으로 바람직한 상기 함량은 상기 침전물 1g 대비 140 내지 150 mg일 수 있다. 상기 함량은 노지에서 재배한 일반 콩뿌리 추출물에 효소 제제 처리를 하지 않은 경우(추출물 1g 당 1.7 내지 1.9 mg 이하)에 비해, 약 100배에 가깝도록 현저하게 증가된 함량이다. 또한, 통상의 무라시게/스쿡 배지를 사용한 경우보다 약 3배 이상 높은 함량이기도 하다.
이하, 실시예 등을 들어 본 발명 일측면의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예 등은 본 발명의 일 측면에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1] 콩 종자발아 및 기내 식물체 유도
콩 종자(Glycine max, 바람직하게는 신화콩 품종) 및 납작콩 각각을 2중량% 차아염소산나트륨(Sodium Hypochlorite) 수용액으로 20분간 표면을 살균한 뒤 멸균수로 3회 세척하였다. 그 후 콩 종류별로 각각 수크로스 30g/L가 첨가된 0.5 ~ 1.0 MS 배지(Murashige and Skoog Medium, Haarlem, 네덜란드)을 이용하여 기내에서 25±1℃가 유지되는 명조건으로 2주간 식물체의 발아를 유도하였다.
[실시예 2] 콩 배양근 유도 및 증식
기내에서 발아된 식물체의 유근으로부터 배양근을 유도한 뒤, 공기용적이 3L인 벌브형(Bulb Type) 생물반응기(시중에서 일반적으로 입수 가능, 도 1 참조) 내에서 IBA(indole-3-butyric acid, Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, 독일) 4mg/L, 수크로스 30g/L가 첨가된 2L의 0.5 MS 배지(Murashige and Skoog medium, Duchefa, 네덜란드)를 이용하여 배양근을 4주간 증식시켰다. 또한, 상기와 같은 조건으로 및 1.0 MS 배지를 이용하여 배양근을 4주간 증식시켰다. 상기 0.5 MS 배지는 배지에 사용되는 무기질 등 원료의 농도를 통상의 MS 배지의 1/2로 하여 제조한 배지이고, 1.0 MS 배지는 상기 원료의 농도가 통상의 MS 배지와 같은 배지를 말한다. 배지는 1N NaOH를 이용하여 pH 5.8로 조정 후 121℃, 1.2기압에서 35분간 멸균한 것을 사용하였다. 상기 배양근은 1-1.5cm로 절단하여 생체중을 기준으로 4g/L 접종밀도로 상기 배지에 접종한 후 22±1℃가 유지되는 암조건에서 배양하였다. 이러한 과정에서, 농약, 비료 등은 일체 사용하지 않았다. 공기공급량은 배양 전 기간 동안 에어플로우 미터(air flow meters, RMA series; Dwyer Instruments, Inc., 미국)를 이용하여 0.1vvm(air volume/culture volume per min)으로 일정하게 조절하였으며, 생물반응기 내부로 공급하는 공기는 일정한 온도 유지를 위하여 압축공기를 응축시킬 수 있는 공기응축기와 불순물을 제거할 수 있는 필터 및 공기 건조기 등을 순차적으로 통과시킨 후 기름을 사용하지 않는 공기 압축기를 이용하여 생물반응기 내부로 공급하였다.
상기와 같은 생물반응기 등을 사용할 경우의 콩 배양근이 증식하는 모습은 도 1과 같고, 이 경우 노지나 야외에서 재배한 통상의 콩(종자, 식물체 유래) 추출물과는 달리, 연중 균일한 품질의 콩 배양근 추출물을 생산할 수 있음을 성분 분석 등을 통해 확인하였다
[실시예 3] 추출물 제조 및 효소 처리
　　1. 추출물 제조
상기 실시예 1 및 2에 따라 수득하여 건조시킨 콩 배양근을 80%(w/v) 에탄올 수용액에 배양근 : 에탄올 수용액 중량비율이 1:30 내지 1:50(바람직하게는 1:30)이 되도록 침지하여 상온에서 24시간 추출하였다. 추출액은 여과지를 이용하여 여과한 다음 용매를 증발 건조시켜 분말(추출물)을 수득하였다. 또한, 반복 추출 실험을 통해, 상기 실시예 1을 통해 생산된 배양근을 이용하여 추출물을 제조할 경우 추출물 내 성분들이 균일하게 유지됨을 확인할 수 있었고, 계대배양 등을 접목한 상기 추출물 제조방식으로 대량 양산이 가능함을 확인하였다.
2. 효소 처리
상기와 같은 방법으로, 수득한 콩 배양근 추출물 분말과 같은 중량의 액상 펙티나아제(pectinase) 효소 제제(pectinex ultra SP-L, 노보자임, 덴마크)를 상기 추출물 분말에 처리 후, 증류수를 이용하여 2중량% 농도(효소제제와 추출물 분말의 혼합물 2 중량% 및 증류수 98 중량%)로 반응물을 제조하였다(상기 효소 제제는 펙티나아제로서 폴리갈락투로나제를 1 내지 5 중량% 포함하는 것이고, 효소 활성 기준으로 폴리갈락투로나제를 3800 units/ml 이상 포함하는 것이다). 상기 반응물은　45℃, 80rpm 조건에서 48시간 유지(반응)시킨 후 원심분리기를 이용하여 침전물을 회수하였다. 회수한 침전물은 동결 건조시켜 분말화하였다.
[실험예 1] 쿠메스트롤 분석
콩 배양근 추출물 내 쿠메스트롤 함량은 효소 반응 전(상기 실시예 3의 1.의 추출물), 후(상기 실시예 3의 2.의 침전물) 추출물을 0.45μm Filter로 여과한 다음 UV Detector가 장착된 High Performance Liquid Chromatography(HPLC)에 10μL씩 주입하며 분석하였다. 컬럼은 Mightysil RP-18 GP 250-4.6 (5 μm, KANTO CHEMICALS, JAPAN)을 사용하였으며, 추출물 내 쿠메스트롤 함량은 342nm 파장에서 측정하였다.
하기 표 1은 효소 반응 전후의 콩 배양근 추출물 내 쿠메스트롤 함량을 비교한 것이다. 표 1에서 수율이라 함은 콩 배양근 투입 중량 대비 상기 실험예 3의 1.에 의한 추출물의 중량, 그리고 콩 배양근 투입 중량 대비 상기 실험예 3의 2.에 의한 침전물의 중량을 각각 백분율(%)로 나타낸 것이다.
Samples 효소 반응 전 효소 반응 후
수율(%) Coumestrol(mg/g extract) 수율(%) Coumestrol(mg/g extract)
0.5 MS 33.7±0.04 1.8±0.10 5.6±0.20 146.4±2.13
1.0 MS 35.6±0.33 1.0±0.07 3.4±0.04 51.0±0.79
(상기 표 1에서 MS는 무라시게/스쿡 배지의 약자이고, 상기 0.5 MS 배지는 배지에 사용되는 무기질 등 원료의 농도를 통상의 MS 배지의 1/2로 하여 제조한 배지이고, 1.0 MS 배지는 상기 원료의 농도가 통상의 MS 배지와 같은 배지를 말한다)
또한, 도 2a 및 도 2b는 효소 반응 전후의 콩 배양근 추출물 내 쿠메스트린과 쿠메스트롤에 대해 HPLC 크로마토그램으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
상기 표 1, 도 2a 및 도 2b로부터, 효소 처리에 의해 추출물 내 쿠메스트린의 당이 제거되어 쿠메스트롤로 전환됨을 알 수 있고, 쿠메스트롤로 변환되는 양이 기존의 방법에 의한 양보다 현저하게 증가하였음을 확인하였다. 아울러, 생물반응기 등을 사용할 경우, 노지나 야외에서 재배한 통상의 콩(종자, 식물체 유래) 추출물과는 달리, 연중 균일한 품질의 콩 배양근 추출물을 생산할 수 있으므로, 그러한 엑스플랜테이션 기술을 효소 반응과 접목시키면, 이러한 고함량의 쿠메스트롤을 균일하고도 지속적으로 생산할 수 있음을 알 수 있다.

Claims (25)

  1. (1) 콩과식물 배양근을 생물반응기 내의 배지에 위치시켜 상기 생물반응기 내에서 공기공급량을 일정하게 유지하며 증식시키는 단계;
    (2) 상기 (1) 단계를 거친 배양근으로부터 추출물을 얻는 단계; 및
    (3) 상기 추출물에 효소 또는 이를 생산하는 미생물을 첨가하는 단계
    를 포함하는, 쿠메스트롤 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, (3) 단계의 상기 효소는 펙티나아제(pectinase)인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  3. 제1항에 있어서, (3) 단계의 상기 효소는 폴리갈락투로나제(Polygalacturonase)인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  4. 제1항에 있어서, (3) 단계의 상기 미생물은 아스퍼질러스 아큘레아투스(Aspergillus aculeatus)인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  5. 제1항에 있어서, (3) 단계의 상기 효소의 첨가량은 상기 (2) 단계를 거친 추출물 100중량부 대비 0.8 내지 8중량부인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  6. 제1항에 있어서, (3) 단계의 상기 효소의 첨가량은 효소 활성을 기준으로 상기 (2) 단계를 거친 추출물 1g 대비 2000 내지 5000 units인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  7. 제1항에 있어서, (1) 단계의 상기 콩과식물은 콩인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  8. 제1항에 있어서, (1) 단계의 상기 콩과식물은 대두 또는 납작콩인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  9. 제1항에 있어서, (2) 단계의 상기 추출물은 물, C1 내지 C6의 저급 알코올, 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 추출한 것인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 혼합물의 알코올 농도는 60 내지 100%(w/v)인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 저급 알코올은 에탄올인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  12. 제1항에 있어서, (1) 단계의 상기 생물반응기는 벌브형 기포 생물반응기(Bulb Type bubble bioreactor)인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계의 배지 내 질산암모늄(NH4NO3)의 농도는 650 내지 1500 mg/l 이고, 염화칼슘(CaCl2·2H2O)의 농도는 175 내지 400 mg/l 이며, 황산마그네슘(MgSO4·7H2O)의 농도는 145 내지 320 mg/l 이고, 인산칼륨(KH2PO4)의 농도는 65 내지 150 mg/l 이며, 질산칼륨(KNO3)의 농도는 750 내지 1500 mg/l 인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계의 배지는 IBA(indole-3-butyric acid) 및 탄소원이 첨가된 것인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  15. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계의 배지는 무라시게/스쿡(Murashige and Skoog) 배지인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  16. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계의 배지 내 성분의 종류는 무라시게/스쿡(Murashige and Skoog) 배지 내 성분의 종류와 동일하고, 상기 성분의 농도는 무라시게/스쿡 배지 내 성분 농도의 40 내지 60%인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  17. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계에서 상기 배양근을 배지에 위치시킬 때의 배지 pH는 4.8 내지 6.8인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  18. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계에서 상기 배양근을 배지에 위치시킬 때 밀도는 2 내지 6 g/L인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계의 증식은 암조건에서 실시하는 것인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  20. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계는 19 내지 25℃에서 실시하는 것인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  21. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계의 공기공급량은 0.05 내지 0.4 vvm(air volume/culture volume per min)인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  22. 제1항에 있어서, 상기 (1) 단계의 증식은 3 내지 5주간 실시하는 것인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  23. 제1항에 있어서, 상기 (2) 단계의 추출 시간은 20 내지 28시간인, 쿠메스트롤 생산 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 (3) 단계 이후에 40 내지 50도씨 및 60 내지 100 rpm의 조건에서 38 내지 58시간 동안 유지 후 원심분리하여 침전물을 회수하는 단계를 더 포함하는, 쿠메스트롤 생산 방법.
  25. 제1항의 단계 (1) 내지 단계 (3)을 포함하는, 쿠메스트롤 함량이 증진된 콩과식물 추출물의 제조방법.
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