CN109906942B - 一种基于三级培养基的蔓越莓快速繁殖再生方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基于三级培养基的蔓越莓快速繁殖再生方法。本发明包括：(1)外植体的选择和消毒；(2)初代诱导培养基的筛选；(3)继代快速增殖培养基的筛选；(4)生根培养基的筛选；(5)培养条件。本发明所提供的基于三级培养基的蔓越莓快速繁殖再生方法，是蔓越莓组织培养的快速繁殖方法，所提供的培养基，是针对蔓越莓不同培养阶段的培养目的来设计的，可以满足不同培养阶段的培养目的对营养成分的需求，符合蔓越莓的生长发育特点，营养元素的配比更为合理，可以有效的诱导不定芽，平均诱导率达到92％。

Description

一种基于三级培养基的蔓越莓快速繁殖再生方法

技术领域

本发明涉及一种基于三级培养基的蔓越莓快速繁殖再生方法。

背景技术

蔓越莓是杜鹃花科越橘属(Vacinium macrocarpon)植物，蔓越莓果实的营养价值和药用价值较高，是一种极具开发前景的小浆果。长期以来蔓越莓在北美的一些地区被广泛种植，而在中国蔓越莓尚处于野生状态，仅在东北等地分布有一些野生种，目前尚无商业化的栽培。近年来，全世界对蔓越莓的需求量呈逐年增长趋势，鲜果价格不断攀升，种苗数量和质量是制约优良品种推广的主要因素之一。蔓越莓播种、扦插等繁殖方法繁殖率均很低，组织培养繁殖速度快于常规的繁殖方法，可以不受季节限制周年生产，因此开展蔓越莓优良品种的组织培养技术研究尤为重要。

越橘组织培养研究开始于1976年由I.Hall最先研究报道，我国最早的相关报道是1990年陈慧都发表的。植物组织培养的培养基的选择非常重要，在已有的报道中越橘组织培养的培养基，因品种不同、外植体的选择不同，差异较大，即使是相同品种的研究得到的结论也不一致，甚至是相反的，例如：Wolf等研究发现Zimmerman培养基不适合高丛越橘快速繁殖，而Chandler和Draper研究发现Zimmerman培养基适合高丛越橘的快速繁殖，马艳丽研究认为改良MS(矿物质含量降低到1/2MS水平)培养基对高丛越橘组培效果好，兔眼越橘组织培养适宜的培养基为改良Knops培养基，游来秋研究得出越橘花药愈伤组织再分化增殖培养基以WPM培养基最优，马怀宇等研究越橘叶片认为改良的WPM培养基为最适培养基。

虽然越橘属其他种的组织培养已积累了一定的经验，但是由于越橘品种间差异很大，对营养成分的需求也不同，特别是对离子浓度非常敏感，不适合的培养基会造成外植体的褐化、干枯，影响植株再生，这可能是与植物本身的遗传特性有关系，因此不定芽的诱导有一定的难度，而目前关于蔓越莓组织培养的研究非常少，因此开展蔓越莓再生体系的研究非常必要。蔓越莓的常规繁殖方式受季节影响较大，且繁殖率很低，繁殖速度慢，种苗退化严重，利用组织培养既可以获得无病毒的种苗，又可以保持原品种的优良特性，加快繁殖速度，满足规模化生产的需求，因此开展蔓越莓快速繁殖生产技术的研究非常迫切，具有广阔的市场前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于三级培养基的蔓越莓快速繁殖再生方法，提供快速繁殖的各个阶段的培养基，可以提高繁殖系数，加快繁殖速度，生根率高，节约培养成本。

本发明的技术方案包括以下步骤：

(1)外植体的选择和消毒：将采集的外植体于超净工作台上消毒后接种在初代诱导培养基上；

(2)初代诱导培养基的筛选：将外植体切成适当大小接种在MY1+ZT0.5～1.0mg/L或者MY+ZT0.5～1.0mg/L培养基上，诱导不定芽；

(3)继代快速增殖培养基的筛选：将步骤(2)诱导出来的不定芽转入继代培养基中进行增殖培养，培养基为:MY+KT1.0～2.0mg/L+ZT 0.5～2.0mg/L+IBA0.1～0.3mg/L或者MY+6-BA1.0～3.0mg/L+ZT0.5～2.0mg/L+NAA0.1～0.3mg/L；

(4)生根培养基的筛选：将步骤(3)获得的丛生苗切成2～3cm的单株转入生根培养基中诱导生根，生根培养基为：1/2MY+NAA 0.1～0.3mg/L或者1/2MY+IBA0.1～0.3mg/L；

(5)培养条件：培养温度白天为23℃±2℃，夜间不低于15℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为1800～2000Lx。

所述的生根培养基中含大黄提取物，大黄提取物的制备方法为：将大黄粉碎，加入质量浓度为12wt％-14wt％的盐酸溶液，大黄粉碎物与所述盐酸溶液的重量体积比为2:7-9g/mL，在50-60℃水解2小时，过滤，滤渣水洗至中性，烘干，用体积分数为85％-95％的乙醇溶液回流提取，所述乙醇溶液与大黄粗粉的体积重量比为10-15:1mL/g，每次提取2-3h，重复提取3-4次，过滤或离心后，液体部分浓缩回收乙醇至含固量为10wt％-15wt％的浓缩液，将浓缩液在160-180℃下喷雾干燥，即成大黄提取物；或者称取大黄50g，每次加入12倍量蒸馏水，煎煮提取3次，煎煮提取时间为1h/次，3次煎煮的大黄提取物溶液分别过滤后合并滤液；在80℃、0.07-0.09Mpa的条件下减压浓缩至100mL；在-40℃到-44℃，真空度在0.2-0.4mbar下冷冻干燥后得到大黄提取物。

步骤(1)所述过程如下：春季从定植三年的苗木上采集当年生枝条的茎尖、茎段作为外植体，将采集的外植体放入清水中浸泡，加入少量洗衣粉浸泡搅拌2～3min，然后放入流水冲洗4～6h，于超净工作台上用浓度为75％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗3次，再用0.1％的Hgcl₂溶液消毒8～10min，然后用无菌水冲洗6～7次后接种在步骤(2)的培养基上；

所述的初代诱导、继代快速增殖培养基中含有的MY培养基成分构成如下：

①大量元素:NH₄NO₃400mg/L、CaCl₂·2H₂O 74mg/L、MgSO₄·7H₂O 246mg/L、KH₂PO₄114mg/L、K₂SO₄660mg/L、Ca(NO₃)₂·4H₂O 278mg/L组成；

②微量元素:MnSO₄·H₂O 22.3mg/L、H₃BO₃6.2mg/L、ZnSO₄7H₂O 8.6mg/L、Na₂M_oO₄·2H₂O 0.25mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.25mg/L；

③铁盐:FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L和Na₂·EDTA·2H₂O 37.3mg/L的螯合剂NaFe·EDTA组成；

④有机物:C₆H₁₂O₆·2H₂O 100mg/L、NH₂CH₂COOH 2.0mg/L、C₈H₁₁O₃N·HCl 1.6mg/L、NC₅H₄COOH 0.5mg/L、C₁₂H₁₇C₁₀S·2HCl 1.0mg/L；

MY1培养基的成分构成:其中大量元素由浓度为NH₄NO₃ 400mg/L、CaCl₂·2H₂O74mg/L、MgSO₄·7H₂O 246mg/L、KH₂PO₄ 170mg/L、K₂SO₄ 990mg/L、Ca(NO₃)₂·4H₂O 556mg/L组成，微量元素、铁盐、有机物成分与MY培养基相同；

所述的MY、MY1培养基中蔗糖含量为30g/L，1/2MY培养基中蔗糖含量为20g/L，MY、MY1、1/2MY培养基中琼脂粉含量为5～6g/L,pH值为5.5～5.8，培养基经高温灭菌20min，压力为1.1kg/cm²。

步骤(2)所述的初代诱导培养基添加的激素为ZT0.5mg/L，培养7d后腋芽开始萌动，15～20d芽伸长至2～3cm。

步骤(3)所述的继代快速增殖培养基添加的激素为6-BA2.0mg/L、ZT1.0mg/L和NAA0.1mg/L，培养10d左右可产生新的腋芽，不同激素配比芽增殖系数有较大的差异，蔓越莓组培苗在继代20～25d后是最佳的生长、增殖时期，苗高平均可达5cm，增殖系数达到7～8倍，25～30d继代一次。

步骤(4)所述的1/2MY生根培养基的成分构成：大量元素是MY培养基的一半，微量元素、铁盐、有机物成分与MY培养基相同,添加的激素为IBA0.3mg/L，培养10～12d后小苗开始陆续生根，20d后小苗生根数趋于稳定，生根率可达98％。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明所提供的基于三级培养基的蔓越莓快速繁殖再生方法，是蔓越莓组织培养的快速繁殖方法，所提供的培养基，是针对蔓越莓不同培养阶段的培养目的来设计的，可以满足不同培养阶段的培养目的对营养成分的需求，符合蔓越莓的生长发育特点，营养元素的配比更为合理，可以有效的诱导不定芽，平均诱导率达到92％；促进不定芽的分化、快速增殖，缩短培养周期，增殖系数可达7～8倍；提高生根率，生根率可达98％。提供的蔓越莓快速繁殖再生体系的建立方法是快速、有效繁殖蔓越莓的技术流程，提高了增殖系数，加快了繁殖速度，生产的种苗品质高，可以满足蔓越莓规模化生产的需求。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明进行详细的说明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1

蔓越莓初代诱导培养基的筛选：培养基MY1是由大量元素、微量元素、铁盐、有机物组成，其中大量元素由浓度为NH₄NO₃ 400mg/L、CaCl₂·2H₂O 74mg/L、MgSO₄·7H₂O 246mg/L、KH₂PO₄ 170mg/L、K₂SO₄ 990mg/L、Ca(NO₃)₂·4H₂O 556mg/L组成；微量元素由：MnSO₄·H₂O22.3mg/L、H₃BO₃ 6.2mg/L、ZnSO₄7H₂O 8.6mg/L、Na₂M_oO₄·2H₂O 0.25mg/L、CuSO₄·5H₂O0.25mg/L组成；铁盐由：FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L和Na₂·EDTA·2H₂O 37.3mg/L的螯合剂NaFe·EDTA组成；有机物由：C₆H₁₂O₆·2H₂O 100mg/L、NH₂CH₂COOH 2.0mg/L、C₈H₁₁O₃N·HCl1.6mg/L、NC₅H₄COOH 0.5mg/L、C₁₂H₁₇C₁₀S·2HCl 1.0mg/L组成，添加激素为ZT0.5mg/L。

实施例2

蔓越莓初代诱导培养基的筛选：培养基为MY是由大量元素、微量元素、铁盐、有机物组成，本实施方式与实施例1中培养基MY1不同的是大量元素由浓度为NH₄NO₃ 400mg/L、CaCl₂·2H₂O 74mg/L、MgSO₄·7H₂O 246mg/L、KH₂PO₄ 114mg/L、K₂SO₄ 660mg/L、Ca(NO₃)₂·4H₂O 278mg/L组成，添加激素为ZT 0.5mg/L，其它参数与实施例1相同。

实施例3

蔓越莓初代诱导培养基的筛选：培养基为MY是由大量元素、微量元素、铁盐、有机物组成，本实施方式与实施例2不同的是添加激素为ZT1.0mg/L，其它参数与实施例2相同。

实施例4

蔓越莓继代快速增殖培养基的筛选：培养基为MY是由大量元素、微量元素、铁盐、有机物组成，本实施方式与实施例3不同的是添加激素由KT1.0mg/L和ZT0.5mg/L和IBA0.1mg/L组成，其它参数与实施例3相同。

实施例5

蔓越莓继代快速增殖培养基的筛选：本实施方式与实施例4不同的是添加激素由KT1.5mg/L和ZT1.0mg/L和IBA0.2mg/L组成，其它参数与实施例4相同。

实施例6

蔓越莓继代快速增殖培养基的筛选：本实施方式与实施例5不同的是添加激素由KT2.0mg/L和ZT1.5mg/L和IBA0.3mg/L组成，其它参数与实施例5相同。

实施例7

蔓越莓继代快速增殖培养基的筛选：本实施方式与实施例6不同的是添加激素由KT2.0mg/L和ZT2.0mg/L和IBA0.3mg/L组成，其它参数与实施例6相同。

实施例8

蔓越莓继代快速增殖培养基的筛选：本实施方式与实施例7不同的是添加激素由6-BA1.0mg/L和NAA0.1mg/L和ZT0.5mg/L组成，其它参数与实施例7相同。

实施例9

蔓越莓继代快速增殖培养基的筛选：本实施方式与实施例8不同的是添加激素由6-BA1.5mg/L和NAA0.2mg/L和ZT1.0mg/L组成，其它参数与实施例8相同。

实施例10

蔓越莓继代快速增殖培养基的筛选：本实施方式与实施例9不同的是添加激素由6-BA2.0mg/L和NAA0.3 mg/L和ZT1.5mg/L组成，其它参数与实施例9相同。

实施例11

蔓越莓继代快速增殖培养基的筛选：本实施方式与实施例10不同的是添加激素由6-BA2.0mg/L和NAA0.2mg/L和ZT2.0mg/L组成，其它参数与实施例10相同。

实施例12

蔓越莓继代快速增殖培养基的筛选：本实施方式与实施例11不同的是添加激素由6-BA2.0mg/L和NAA0.1mg/L和ZT1.5mg/L组成，其它参数与实施例11相同。

实施例13

蔓越莓继代快速增殖培养基的筛选：本实施方式与实施例12不同的是添加激素由6-BA2.0mg/L和NAA0.1mg/L和ZT1.0mg/L组成，其它参数与实施例12相同。

实施例14

蔓越莓继代快速增殖培养基的筛选：本实施方式与实施例13不同的是添加激素由6-BA3.0mg/L和NAA0.1mg/L和ZT1.0mg/L组成，其它参数与实施例13相同。

实施例15

蔓越莓生根培养基的筛选：培养基为1/2MY是由大量元素、微量元素、铁盐、有机物组成,其中大量元素由浓度为NH₄NO₃ 200mg/L、CaCl₂·2H₂O 37mg/L、MgSO₄·7H₂O 123mg/L、KH₂PO₄ 57mg/L、K₂SO₄ 330mg/L，Ca(NO₃)₂·4H₂O 139mg/L组成，添加激素为NAA0.1mg/L，其它参数与实施例14相同。

实施例16

蔓越莓生根培养基的筛选：本实施方式与实施例15不同的是添加激素为NAA0.2mg/L，其它参数与实施例15相同。

实施例17

蔓越莓生根培养基的筛选：本实施方式与实施例16不同的是添加激素为NAA0.3mg/L，其它参数与实施例16相同。

实施例18

蔓越莓生根培养基的筛选：本实施方式与实施例17不同的是添加激素为IBA0.1mg/L，其它参数与实施例17相同。

实施例19

蔓越莓生根培养基的筛选：本实施方式与实施例18不同的是添加激素为IBA0.2mg/L，其它参数与实施例18相同。

实施例20

蔓越莓生根培养基的筛选：本实施方式与实施例19不同的是添加激素为IBA0.3mg/L，其它参数与实施例19相同。

实施例21

根据实施例1所述的其所述的生根培养基还添加有腐殖化褐煤，腐殖化褐煤的加工步骤包括：

(1)粗加工褐煤：取褐煤静止放置在背光通风处晾干，粉碎研磨过60目筛，在温度变化范围为115-117℃的干燥箱中烘干，将烘干后的褐煤放置于玻璃材质的储物容器中；

(2)硝化粗加工褐煤：取步骤(1)的经过粗加工的褐煤，加入质量份数为21％-24％的硝酸浸泡7-9小时后，将褐煤淋洗至中性，在90℃的干燥箱中烘干；

(3)去矿化褐煤：将步骤(3)的褐煤与6mol/L的盐酸溶液按质量比35:6混合，用玻璃器皿搅拌均匀，在震荡机上震荡1天后进行过滤，使用蒸馏水对褐煤洗涤至中性；将褐煤放置在真空干燥箱中70℃条件下进行干燥，向盐酸处理过的褐煤中加入10倍55％的氢氟酸溶液，使用震荡机进行震荡一天，再次进行过滤，再次将盐酸处理过的褐煤用蒸馏水洗涤至中性，并在90℃干燥箱中烘干；

(4)活性化褐煤：取去矿化的褐煤与含8％硫酸的50％的磷酸溶液按质量比6:1混合，用玻璃器皿搅拌均匀后，在90℃条件下浸渍15小时后进行过滤，将过滤后的原料放入恒温炉中，通入氮气，以20℃/min速度升温使褐煤达到390℃后，烘干1小时，烘干过程中每5分钟通一次氮气，在自然条件下使褐煤的温度降至室温，然后使用85-90℃的蒸馏水洗至中性，并在90℃干燥箱中烘干；

(5)褐煤腐殖化：取步骤(4)烘干的褐煤与质量份数30％的氢氧化钠溶液按质量比6:1混合，用玻璃器皿搅拌均匀，室温静止放置两天，直到混合液分层，取下层沉淀，加蒸馏水，搅拌均匀，室温静止放置两天，取下层沉淀，再加蒸馏水反复冲洗，直到静止放置的混合液不分层后，在90℃干燥箱中烘干得到成品褐煤。

本发明提供的腐殖化褐煤的作用在于吸附重金属离子，重金属离子被吸附的过程可分为四个步骤：重金属离子在溶液中向褐煤迁移扩散；重金属离子与褐煤外表面活性位点的吸附作用；重金属离子在褐煤内部孔道内迁移扩散；以及重金属离子与褐煤内表面活性位点吸附作用。

所述腐殖化褐煤的量与生根培养基的量的关系为：

R_f为吸附平衡时的吸附量，R_m为吸附平衡时的最大吸附容量，C_f为调控剂中腐殖化褐煤的浓度；K_L是与吸附活化能有关的常数；K_f是表征吸附能力的参数，n是吸附剂异质性因子，R是气体常数，T是绝对温度，K_T是最大吸附量时的平衡常数。

通过上述关系可以在培养蔓越莓之前通过合理测量种植土地的重金属含量合理设置调控剂中的褐煤浓度，达到节约成本同时有效吸附重金属。

实施例22

本发明的生根培养基中添加有大黄提取物，所述的大黄提取物的制备方法为：将大黄粉碎，加入质量浓度为12wt％-14wt％的盐酸溶液，大黄粉碎物与所述盐酸溶液的重量体积比为2:7-9g/mL，在50-60℃水解2小时，过滤，滤渣水洗至中性，烘干，用体积分数为85％-95％的乙醇溶液回流提取，所述乙醇溶液与大黄粗粉的体积重量比为10-15:1mL/g，每次提取2-3h，重复提取3-4次，过滤或离心后，液体部分浓缩回收乙醇至含固量为10wt％-15wt％的浓缩液，将浓缩液在160-180℃下喷雾干燥，即成大黄提取物。

或者称取大黄50g，每次加入12倍量蒸馏水，煎煮提取3次，煎煮提取时间为1h/次，3次煎煮的大黄提取物溶液分别过滤后合并滤液；在80℃、0.07-0.09Mpa的条件下减压浓缩至100mL；在-40℃到-44℃，真空度在0.2-0.4mbar下冷冻干燥后得到大黄提取物。

其中大黄为大黄属植物的根、茎、叶中的至少一种。

大黄提取物为蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄或药用大黄的干燥根及根茎提取物。掌叶大黄和唐古特大黄药材称北大黄，主产于青海、甘肃、四川等地。药用大黄药材称南大黄，主产于四川、湖北等地。大黄味苦寒，归胃、肝大肠经，有效成分为蒽醌类化合物，包括大黄酸、大黄素、大黄酚、芦荟大黄素、大黄素甲醚等，有清除氧自由基、抗氧化、抗菌、抗病毒等功效。

本发明的大黄提取物中，总蒽醌类化合物含量为40-50wt％。提取物制成的干粉中，结合型蒽醌与游离型蒽醌的质量比为1:7-10。

所述大黄提取物在调控剂的浓度为：

Q_t＝K_tt^0.5+C；

K_t为粒子内扩散速率常数，C是与土壤层厚度有关的常数，t为调控剂有效时间。

实施例22

本发明的生根培养基中包含有冷杉针叶提取物，冷杉针叶提取物的制备方法为：

取冷杉针叶清洗并放置在阴凉处干燥后，用粉碎机粉碎成末；将冷杉针叶粉末过0.3目筛后装入塑封袋，在4℃条件下保存；

取冷杉针叶粉末，每5g用50mL蒸馏水80℃条件下进行热回流提取2小时以上；过滤提取液，收集滤液并用纯净水定容至50mL，减压抽滤得到冷杉针叶提取物；或者取冷杉针叶粉末每5g用50mL质量分数为50％的乙醇溶液通过80℃热回流提取2小时以上，过滤提取液，收集滤液并用质量分数为50％的乙醇溶液定容至50mL，减压抽滤得到冷杉针叶提取物；或者取冷杉针叶粉末，每5g用50mL蒸馏水进行超声波提取30分钟以上，过滤提取液，收集滤液并用纯净水定容至50mL，减压抽滤得到冷杉针叶提取物。

冷杉属于高纬度、高海拔的松树科植物，在几百年前，当地人就认识到了冷杉的药用和保健价值。冷杉精华是基于100％冷杉新鲜针叶细胞液的提取物，采用液化二氧化碳萃取及先进的微囊包裹技术制作而成。经过检测，在西伯利亚冷杉精华中发现了一种极为珍稀的成分——聚戊烯醇。除聚戊烯醇，冷杉精华还含有铁–麦芽酚、氨基醋酸、磷脂酰丝氨酸、酚酸、维生素E乙酸盐等成分。铁–麦芽酚是极其珍稀的元素，因含铁–麦芽酚，使冷杉精华呈深红色。麦芽酚是一种天然的天然抗氧化剂，一方面，它阻断自由基，防止其破坏细胞和机体纤维组织的完整性。而另一方面，能够促进植物对铁元素更好的吸收和消化。

本发明以冷杉针叶为原料，提取分离冷杉针叶中的三萜酸和聚戊烯醇等提取物，开发这些生物活性物质的药用价值，使针叶脂溶性物质得到更为合理利用。采用溶剂萃取法和层析法，提取的选择性和提取率大大提高，所得产品纯度也较高，而且溶剂可回收重复利用，环境较为友好。本发明充分利用针叶脂溶性物质中的三萜酸和聚戊烯醇等，提高了产品的总得率，降低了生产成本，是一种具有推广应用前景的提取分离方法。从冷杉提取分离的针叶三萜酸，使用非常小的剂量，即可影响蔓越莓生长和发育的生理过程，主要表现在提高蔓越莓的产量，具有明显的促进增产作用，与现有其他农药联合使用时，增产效果非常明显。

实施例22

本发明的生根培养基中还包含有人参内生菌提取物，人参内生菌提取物的制备方法为：

用氯化汞、次氯酸钠和无水乙醇对人参根系表面进行消毒，采用组织印迹法检查人参表面消毒是否彻底；用组织分离法对人参内生菌进行分离，用高氏1号培养基对内生放线菌进行分离、用PDA培养基对内生真菌进行分离、用NA培养基对内生细菌进行分离；

配置发酵液培养基，本培养基包括酵母浸膏质量为3.5g、Na₂HPO₄质量为17g、MgSO₄质量为0.2g、可溶性淀粉质量为3.5g、Na₂SO₄质量为1.5g、蛋白胨质量为17g、H₂O容量为1000mL，按顺序的放入高压灭菌锅内，并在100℃，30分钟条件下开始灭菌。待灭菌完毕后，在无菌超净工作台中取直径为7-9mm大小的内生放线菌、内生真菌或内生细菌的菌落2-3块接入发酵液培养基中，密封培养基后放置于温度为30℃的摇床上培养36小时，在转速为125转/分条件下，震荡培养6天，得到发酵液。然后用抽滤机对发酵液进行过滤，并将过滤后得到的发酵液和菌丝体分别用容器收集起来。

将菌丝体和发酵液用乙酸乙酯溶剂分别反复萃取后将滤液与菌丝体混合在一起。该混合物用旋转蒸发仪进行旋蒸浓缩到原体积的50％，收集到浓缩液，将浓缩液引流流入已装好硅胶的硅胶柱，然后用质量配比为1:50乙酸乙酯和石油醚溶剂进行梯度洗脱，采用薄层层析法进行比对，合并其中相同的组分，得到3个组分，将第一组分经过质量配比为15：13：2的乙酸乙酯、乙醇和水进行梯度洗脱、重结晶，得出第一化合物。第二组分经过质量配比为25：1的三氯甲烷和甲醇进行梯度洗脱、重结晶，得出第二化合物。第三组分使用无水乙醇进行洗脱、重结晶，得出第三化合物。

或者将发酵液和菌丝体用正丁醇溶剂分别反复萃取，将滤液与菌丝体合并起来。合并后的混合物用旋转蒸发仪进行旋蒸浓缩收集到浓缩液20g，浓缩液用玻璃棒引流流入已装好硅胶的硅胶柱，然后用质量配比为1:75的乙酸乙酯和石油醚溶剂进行梯度洗脱，采用TLC进行比对，合并其中相同的组分，从中获得4个组分，第四组分有沉淀析出，用乙酸乙酯溶解第四组分，制备薄层，将质量配比为7:1的氯仿和甲醇溶液展开，出现两个色带，刮取两个色带，分别得到第八组分和第九组分，用质量配比为17:5:2的氯仿、甲醇和水继续梯度洗脱第八和第九组分，多次重结晶后分别得出第四化合物和第五化合物；将第五组分用TLC进行比对，合并其中相同的组分，再用质量配比为30:1的氯仿和甲醇溶液继续进行梯度洗脱，洗脱后进行结晶和重结晶，得出第六化合物；第六组分用TLC进行比对，合并其中相同的组分，再用质量配比为50:1的氯仿和甲醇溶液继续进行梯度洗脱，洗脱后进行结晶和重结晶，得出第七化合物；第七组分先用乙酸乙酯溶剂洗脱得出第十组分，再用甲醇、乙酸乙酯和三氯甲烷的混合物进行梯度洗脱，洗脱后对其结晶和重结晶，得出第八化合物。

将上述八种化合物按照比例混合研磨成粉末获得人参内生菌提取物。

人参根中分离的内生菌中可得到苍耳素、异丹参酮II、人参炔醇、2,4,5-三甲基-1,3-苯二酚、2,4-二羟基-3,5,6-三甲基苯甲酸甲酯、甘露醇、青霉酸、麦角甾醇、过氧麦角甾醇、对羟乙基苯酚等化合物，该内生菌提取物可通过不同方式刺激植物生长，可以自身合成或促进宿主植物合成植物必需的生长激素并促进宿主根系以及各器官的生长，协助宿主植物在土壤中吸收有营养的矿质元素，也可通过增强寄主植物对恶劣生长环境和有害病原体的防御能力等方面来使植物稳定生长，而且具有的生物活性也多种多样，如抗病毒活性、酶抑制活性、免疫抑制活性、杀虫活性、抗微生物活性、抗氧化活性、抗原生动物活性。

实施例23

本发明的生根培养基中还添加有紫茉莉甲醇提取物，所述的紫茉莉甲醇提取物的提取方法包括：

取紫茉莉粉碎物，用10倍质量的甲醇对紫茉莉粉碎物提取48小时以上，对上述溶液进行抽滤，过滤得到的残渣继续使用同样的方法通过甲醇对紫茉莉粉碎物提取48小时，并将两次抽滤得到的提取液合并浓缩到原体积的1/2,回收有机溶剂，获得紫茉莉甲醇提取物。

紫茉莉(Mirabilis jalapa L.)，又叫草茉莉、胭脂花或粉豆花，属于紫茉莉科，紫茉莉属，是一种多年生观赏花卉，常作一年生栽培，高度可达1m。原产于南美，具有生态适应广、耐贫瘠、生长速度快、繁殖力强等生物特性，在我国很多地区均有栽培。根部含有氨基酸、有机酸和大量淀粉，花含多种甜菜黄素等黄色素，根和叶可以入药，具有清热解毒、活血调经和滋补的功效。近年来，紫茉莉的研究得到重视，其在医药、植物保护、环境保护方面也显示出了研究价值。发明人研究发现，紫茉莉具有制备植物源农药的潜力。本发明的发现紫茉莉甲醇提取物有抗植物病毒作用。

实施例24

本发明的生根培养基中还包含有植物内生菌提取物，植物内生菌提取物的制作方法为：

取植物的叶子，用纯净水冲洗干净叶片上的杂质，在阴凉处晾干叶片表面水分；进行页面消毒处理：用浓度70％酒精漂洗植物叶子5min以上，用纯净水漂洗植物叶子3次以上；然后用浓度3％的次氯酸钠溶液漂洗5min以上，再用纯净水漂洗植物叶子3次以上，在阴凉处晾干叶片表面水分，将上述表面消毒后的叶片切割成小块置于PDA培养基上，在30℃的恒温环境下培养8天。

待叶片小块边缘长出菌丝后用消毒的镊子将菌丝转入另一PDA培养基内，采用平板划线方法纯化菌落，待纯化完全后，取纯化后的菌株，对菌株进行液体发酵，过滤发酵液，取滤液加乙酸乙酯进行萃取，萃取2次。合并萃取液在40℃条件下减压蒸干，得到粗浸膏即次级代谢产物。

或者取菌丝转入装有100ml的PDB培养液的250ml容量的锥形瓶中，进行30℃、160rpm的恒温振荡培养，培养时间60小时。将锥形瓶中的菌液接种于装有500ml的PDB培养液的1000ml容量的锥形瓶中，进行30℃、160rpm的恒温振荡培养，培养时间240小时。分别对上述两种菌液和菌丝用乙酸乙酯进行萃取，萃取5次。将萃取液在40℃条件下进行减压蒸干，得到发酵粗提物。甲醇溶解菌液和菌丝，加等量硅胶搅拌，用石油醚湿法装柱，采用石油醚:丙酮为5:0.7-1:9和二氯甲烷:甲醇12:1-0:1的溶液进行不同浓度梯度洗脱得到提取物组分，采用TLC进行比对，合并其中相同的组分，得到一个粗组分提取物，用氯仿和甲醇溶解后静置，溶液中析出透明结晶，清洗结晶表面杂质后得到植物内生菌提取物。

所述的植物内生菌提取物包括青霉酸、麦角甾醇、二氢青霉酸、胸腺嘧啶、吲哚-3-甲酸。

所述的植物包括短叶紫衫树皮、黄杨叶子、披碱草叶子、九里香叶子、番茄叶子、韭菜叶子、山药叶子、石榴叶子和石榴皮。

植物内生菌是指那些其全部或部分生活史在健康植物的各种组织或细胞内部度过的真菌或细菌(包括放线菌)，其存在不引起明显的宿主感染症状，但可通过组织学方法或从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内部植物扩增出微生物DNA的方法来证明其内生性。其广泛分布在植物的根、茎、叶、花、果实中，对宿主植物无害，宿主植物为其提供生长所需的营养物质，其促进宿主植物合成活性成分，并且帮助宿主植物代谢毒素，抵抗外界的攻击和侵食。两者互利共生，拮抗平衡。植物内生菌的种类和数量受宿主植物种类和外在环境影响很大。不同植物菌种不同，同种植物不同地点、不同温度、不同环境菌种不同，即使同一植物不同时间菌种也会不同。作为一种微生物新资源，其生长周期短、代谢易于控制、菌种易于选育及可通过大规模发酵实现工业化生产等的优点使人们对其日益关注。

实施例25

本发明在生根培养基中增加了纤维素降解菌，具体的培养方法为：

在已灭菌的110ml的富集培养基中加入10g纤维素降解菌，在220r/min，35℃下恒温振荡240天。然后取100ml的菌液在3000r/min的条件下离心20min，用纯净书将5ml上清液进行梯度稀释，分别吸取0.1ml的稀释液在CMC平板上进行涂布操作，每个梯度重复3次。在35℃恒温下培养120小时后，挑取单菌落在CMC培养基上进一步分离、纯化培养，纯化的菌落分别点种在CMC平板上，重复3次，35℃下培养144小时，用2g/L的刚果红染液，染色1小时，滤掉染液，再加入1mol/L的NaCl溶液，洗涤1小时。

检测菌落处有无明显的透明圈并测量统计透明圈直径和菌落直径。将透明圈直径和菌落直径的比值最大的菌株制备菌悬液，分别移取3ml接种到滤纸条培养基中，在35℃恒温培养箱中培养240小时，观察滤纸条的变化，选择滤纸条被降解程度最高的细菌菌株接种到LB培养基，于240r/min、35℃条件下恒温振荡培养25小时后，进行DNA提取和PCR扩增，然后用质量分数1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测PCR产物。菌株经6SrDNA测序，利用BLAST功能组件将测得的基因序列进行同源性比较，选取相似性更高的菌株作为纤维素降解菌。

在蔓越莓栽培的堆肥过程中，离不开各种微生物的主导作用。虽然秸秆堆肥本身含有一些微生物，但由于秸秆成分中木质纤维素的复杂结构限制分解速度，只有少数微生物起到分解的作用，因此研究学者为了提高堆肥效率，在堆肥过程中加入促腐菌剂，来补充堆肥中的微生物种类，增加微生物数量，微生物产生的酶类更丰富，各菌种各司其职又协调配合，在堆肥中使有机物快速腐解，堆肥腐熟更快。

实施例26

所述的生根培养基中添加有大蒜根系腐解液，腐解液的制作方法为：

称取20g剪碎成0.5cm长度的大蒜根系放置于3L玻璃器皿中，加入2L土壤稀释溶液，放入30℃恒温培养箱中避光培养。25天后提取腐解液：过滤2次后进行真空抽滤，用乙酸乙酯充分萃取分液之后40℃旋转蒸发浓缩至15mL得到大蒜根系腐解液，置于5℃冰箱保存。

土壤酶是土壤组分中的活跃成分，其参与土壤中众多代谢活动，与土壤肥力密切相关。大蒜能够提高土壤中磷酸酶活性，促进磷素周转、循环，原因是它能够促进根际微生物多样性增加。

本发明公开了蔓越莓快速繁殖再生体系的建立方法，包括蔓越莓外植体的选择、消毒，初代诱导、继代快速增殖、生根培养基的筛选。其中初代诱导培养基为：MY+ZT0.5mg/L,平均诱导率达到92％，继代快速增殖培养基为MY+6-BA2.0mg/L+ZT1.0mg/L+NAA0.1mg/L，增殖系数达到7～8倍，生根培养为:1/2MY+IBA0.3mg/L，生根率为98％。本发明的MY培养基可以提高增殖系数，加快繁殖速度，生根率高，节约组织培养的成本，生产周期只需45d左右，可以满足规模化生产的需求，为蔓越莓组培苗的工厂化生产提供依据。这里必须指出的是，本发明给出的其他未说明的技术因为都是本领域的公知技术，根据本发明所述的名称或功能，本领域技术人员就能够找到相关记载的文献，因此未做进一步说明。本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。

Claims (5)

1.一种基于三级培养基的蔓越莓快速繁殖再生方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)外植体的选择和消毒：将采集的外植体于超净工作台上消毒后接种在初代诱导培养基上；

(2)初代诱导培养基的筛选：将外植体切成适当大小接种在MY1+ZT0.5～1.0mg/L或者MY+ZT0.5～1.0mg/L培养基上，诱导不定芽；

(3)继代快速增殖培养基的筛选：将步骤(2)诱导出来的不定芽转入继代培养基中进行增殖培养，培养基为:MY+KT1.0～2.0mg/L+ZT 0.5～2.0mg/L+IBA0.1～0.3mg/L或者MY+6-BA1.0～3.0mg/L+ZT0.5～2.0mg/L+NAA0.1～0.3mg/L；

(4)生根培养基的筛选：将步骤(3)获得的丛生苗切成2～3cm的单株转入生根培养基中诱导生根，生根培养基为：1/2MY+NAA 0.1～0.3mg/L或者1/2MY+IBA0.1～0.3mg/L；

(5)培养条件：培养温度白天为23℃±2℃，夜间不低于15℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为1800～2000Lx；

步骤(1)所述过程如下：春季从定植三年的苗木上采集当年生枝条的茎尖、茎段作为外植体，将采集的外植体放入清水中浸泡，加入少量洗衣粉浸泡搅拌2～3min，然后放入流水冲洗4～6h，于超净工作台上用浓度为75％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗3次，再用0.1％的HgCl₂溶液消毒8～10min，然后用无菌水冲洗6～7次后接种在步骤(2)的培养基上；

所述的初代诱导、继代快速增殖培养基中含有的MY培养基成分构成如下：

①大量元素:NH₄NO₃ 400mg/L、CaCl₂·2H₂O 74mg/L、MgSO₄·7H₂O 246mg/L、KH₂PO₄114mg/L、K₂SO₄ 660mg/L、Ca(NO₃)₂·4H₂O 278mg/L组成；

②微量元素:MnSO₄·H₂O 22.3mg/L、H₃BO₃ 6.2mg/L、ZnSO₄7H₂O 8.6mg/L、Na₂M_oO₄·2H₂O0.25mg/L、CuSO₄·5H₂O 0.25mg/L；

③铁盐:FeSO₄·7H₂O 27.8mg/L和螯合剂为Na₂·EDTA·2H₂O 37.3mg/L的螯合物NaFe·EDTA 组成；

④有机物:C₆H₁₂O₆·2H₂O 100mg/L、NH₂CH₂COOH 2.0mg/L、C₈H₁₁O₃N·HCl 1.6mg/L、NC₅H₄COOH 0.5mg/L、C₁₂H₁₇C₁₀S·2HCl 1.0mg/L；

MY1培养基的成分构成:其中大量元素由浓度为NH₄NO₃ 400mg/L、CaCl₂·2H₂O 74mg/L、MgSO₄·7H₂O 246mg/L、KH₂PO₄ 170mg/L、K₂SO₄ 990mg/L、Ca(NO₃)₂·4H₂O 556mg/L组成，微量元素、铁盐、有机物成分与MY培养基相同；

所述的MY、MY1培养基中蔗糖含量为30g/L，1/2MY培养基中蔗糖含量为20g/L，MY、MY1、1/2MY培养基中琼脂粉含量为5～6g/L,pH值为5.5～5.8，培养基经高温灭菌20min，压力为1.1kg/cm²。

2.根据权利要求1所述的一种基于三级培养基的蔓越莓快速繁殖再生方法，其特征在于：所述的生根培养基中含有大黄提取物，大黄提取物的制备方法为：将大黄粉碎，加入质量浓度为12wt％-14wt％的盐酸溶液，大黄粉碎物与所述盐酸溶液的重量体积比为2:7-9g/mL，在50-60℃水解2小时，过滤，滤渣水洗至中性，烘干，用体积分数为85％-95％的乙醇溶液回流提取，所述乙醇溶液与大黄粗粉的体积重量比为10-15:1mL/g，每次提取2-3h，重复提取3-4次，过滤或离心后，液体部分浓缩回收乙醇至含固量为10wt％-15wt％的浓缩液，将浓缩液在160-180℃下喷雾干燥，即成大黄提取物；或者称取大黄50g，每次加入12倍量蒸馏水，煎煮提取3次，煎煮提取时间为1h/次，3次煎煮的大黄提取物溶液分别过滤后合并滤液；在80℃、0.07-0.09Mpa的条件下减压浓缩至100mL；在-40℃到-44℃，真空度在0.2-0.4mbar下冷冻干燥后得到大黄提取物。

3.根据权利要求1所述的一种基于三级培养基的蔓越莓快速繁殖再生方法，其特征在于，步骤(2)所述的初代诱导培养基添加的激素为ZT0.5mg/L，培养7d后腋芽开始萌动，15～20d芽伸长至2～3cm。

4.根据权利要求1所述的一种基于三级培养基的蔓越莓快速繁殖再生方法，其特征在于：步骤(3)所述的继代快速增殖培养基添加的激素为6-BA2.0mg/L、ZT1.0mg/L和NAA0.1mg/L，培养10d左右可产生新的腋芽，不同激素配比芽增殖系数有较大的差异，蔓越莓组培苗在继代20～25d后是最佳的生长、增殖时期，苗高平均可达5cm，增殖系数达到7～8倍，25～30d继代一次较为适宜。

5.根据权利要求1所述的一种基于三级培养基的蔓越莓快速繁殖再生方法，其特征在于：步骤(4)所述的1/2MY生根培养基的成分构成：大量元素是MY培养基的一半，微量元素、铁盐、有机物成分与MY培养基相同,添加的激素为IBA0.3mg/L，培养10～12d后小苗开始陆续生根，20d后小苗生根数趋于稳定，生根率可达98％。