CN111587727A - 一种利用乡土丛枝菌根真菌提高车桑子苗期抗旱性的方法 - Google Patents

一种利用乡土丛枝菌根真菌提高车桑子苗期抗旱性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用乡土丛枝菌根真菌提高车桑子苗期抗旱性的方法,包括:(1)土壤采集:包括根际土壤采集和盆栽土壤采集;(2)盆栽基质制备:将步骤(1)中盆栽土壤经灭菌、混匀后,用于车桑子生长的培养基质;(3)乡土丛枝菌根真菌分离:从步骤(1)中采集的根际土壤样品中分离出乡土丛枝菌根真菌孢子;(4)真菌接种:将分离的真菌孢子接种于培养基质中;(5)种子处理:将采集的种子破除休眠后,播种于步骤(4)制备好的培养基质中,播种后在表面再覆盖上灭菌基质,不露出种子;(6)苗期管理与观察。其优点在于,该方法充分利用植物、丛枝菌根真菌群落与土壤环境间的相互适应关系,对提高车桑子及其它本地植物在干旱条件下的生长发育均具有重要的参考价值。

Description

一种利用乡土丛枝菌根真菌提高车桑子苗期抗旱性的方法
技术领域
本发明属于用于植物培育技术领域,具体为一种利用乡土丛枝菌根真菌提高车桑子抗旱性的方法。
背景技术
车桑子(Dodonaea viscosa Jacq.)为无患子科车桑子属植物,是世界上分布最广的物种之一。我国仅有的车桑子分布于西南部、南部至东南部,又名坡柳、明油子,是西南干热河谷区植被灌木层的建群种。车桑子具有重要的医药价值和农药价值,具耐干旱、萌生力强、根系发达、丛生等习性,是一种良好的固沙保土树种,因此它也是干热河谷区重要的植被恢复树种。但干旱对车桑子幼苗期的过滤效应十分显著,在植被恢复过程中尤其应加强苗期管护。
丛枝菌根真菌是一种内生菌根真菌,能与地球上80%以上的陆生植物形成菌根共生体,是土壤共生真菌中宿主种类最多和分布最广的一类真菌。丛枝菌根真菌与植物共生可增加对低迁移离子的吸收;促进生根和植株的建立;减少病原菌作用;改善土壤结构质量;提高植物群落多样性;改善土壤养分循环;提高植物对生物和非生物胁迫的耐受性,包括对干旱胁迫、重金属胁迫、盐胁迫的抵抗等。
研究表明,菌根共生体对特定的生存环境表现出明显的局域适应性。胁迫环境中的丛枝菌根真菌通常对环境胁迫具有较强的耐受性,对宿主的侵染能力更强,因而对植物的促进作用也更加显著。在干旱胁迫条件下,接种从干旱地区分离出来的乡土耐旱真菌菌株是保证干旱胁迫下植物生长的一项重要策略。从进化的角度来说,植物和丛枝菌根真菌群落是相互适应的,同时,它们也会更加适应原有的土壤环境(co-adaptation model)。
1.目前多数研究主要都是通过接种购买的丛枝菌根真菌商业菌种进行比较,而缺乏对环境中乡土丛枝菌根真菌的研究。丛枝菌根真菌商业菌种的应用不一定适合当地植物和土壤环境,因此,在实际应用中受到限制。
2.现有文献中也有少数研究开始关注乡土丛枝菌根真菌,然而,主要关注乡土菌的少数几个菌种,而对整个乡土丛枝菌根真菌群落缺乏研究。同时,接种特定的丛枝菌根真菌菌种需要将分离出的菌根真菌进行纯化培养,过程更为复杂繁琐。并且多种丛枝菌根真菌之间通常具有协同作用,菌根群落对宿主的作用要强于单个物种。因此,在群落水平上对环境中乡土丛枝菌根真菌进行研究更具有现实意义。
发明内容
为解决现有技术中不能够很好地解决车桑子苗期抗旱性的缺陷,本发明公开了一种利用乡土丛枝菌根真菌提高车桑子苗期抗旱性的方法,实现的目的为直接从干热河谷区车桑子根际土中分离丛枝菌根真菌群落,并将其在当地土壤上接种于车桑子,从而促进丛枝菌根真菌在当地土壤环境中的生态应用。该方法操作方便、成本低、效果好,可用于野外环境车桑子的植被恢复。
为了实现上述目的,本发明公开的技术方案为:本发明提供的一种利用乡土丛枝菌根真菌提高车桑子苗期抗旱性的方法,包括如下步骤:
(1)土壤采集:包括根际土壤采集和盆栽土壤采集,
根际土壤采集:在干热季节,采集车桑子根际土壤样品,将根际土壤采集于自封袋中,并用冰盒运回实验室,保存于4℃的冰箱中备用;
盆栽土壤采集:在车桑子生长区采集表层土壤,将采集的土壤运回实验室,过2mm筛后作为后续盆栽车桑子的土壤备用;
(2)盆栽基质制备:将步骤(1)中盆栽土壤经灭菌、混匀后,用于车桑子生长的培养基质;
(3)乡土丛枝菌根真菌分离:从步骤(1)中采集的根际土壤样品中分离出乡土丛枝菌根真菌孢子,以该乡土丛枝菌根真菌孢子为接种物;
(4)真菌接种:在上述步骤(2)培养基质中加入步骤(3)分离出的乡土丛枝菌根真菌接种物;
(5)种子处理:在车桑子种子成熟季节,选择自然植被受人类干扰相对较小,性状优良的母树采集成熟饱满的车桑子种子,采集的种子装于布袋,带回实验室自然风干保存,播种前,将采集的成熟种子破除休眠后,播种于步骤(4)制备好的培养基质中,播种后在表面再覆盖上灭菌基质,不露出种子;
(6)苗期管理与观察:车桑子生长培养期间将培养基质放于温度为25/35℃,夜/昼培养:8h/16h的气候培养箱或野外大棚置物架上进行培养,待车桑子种子发芽,长出4-5片子叶后,间苗,观测植物生长状况。
进一步的,所述步骤(2)中盆栽基质灭菌采用高温高压的方法,具体操作方法如下:121℃、103.5kPa条件下,用高压灭菌锅湿热灭菌1h,反复灭菌3次,灭菌时间间隔为24h,以完全消除土壤微生物孢子。
进一步的,所述步骤(3)中乡土丛枝菌根真菌孢子分离采用湿筛倾析-蔗糖离心法进行,即:将根际土壤按照质量1:10的比例放在灭菌水中,用离心机在2000转/分钟下离心5分钟,去除漂浮物,再加入质量浓度为50%蔗糖溶液将沉积物混匀,在2000转/分钟下离心1分钟,将溶液倒入50μm的土筛中过滤,用清水洗除蔗糖,最后用滤膜在真空下过滤,过滤得到的孢子用质量浓度为5%次氯酸钠灭菌5分钟,最后用灭菌水洗净。
进一步的,所述步骤(5)中车桑子种子休眠破除是将种子浸泡在质量浓度为98%硫酸溶液中,浸泡10min后,去除浓硫酸,并用清水洗净。
综上,本发明所具有的有益效果包括:1.采用浓硫酸处理方法破除车桑子种子休眠,播种一个月左右,车桑子种子发芽率达到90%以上。种子发芽率高,浪费少。
2.本发明可以快速获得当地乡土丛枝菌根真菌群落,用于接种的丛枝菌根真菌孢子包括多种耐旱性丛枝菌根真菌菌种,多种菌种发挥协同促进作用,从而可显著增强当地车桑子耐旱性。在干旱胁迫条件下,车桑子对乡土丛枝菌根真菌群落具有较高的依赖性,接种乡土丛枝菌根真菌促进了车桑子幼苗生长和生物量积累。
3.本发明利用植物、丛枝菌根真菌与土壤环境之间的局域适应性关系,可推广到其它本地物种在植被恢复中的应用。同时,在接种量较大时,可将分离的菌根孢子借助玉米作为寄主进行扩繁,扩繁后以包含植物根系和菌根孢子的土壤为接种剂,应用于野外植被恢复实践。
4.本发明就地取材、操作方便,同时不用购买商业丛枝菌根真菌菌种,成本低,并且促生效果更加显著,可发挥良好的经济效益和生态效益。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。在没有特殊说明的情况下,本发明的操作采用的均是现有技术。
实施例一:本发明提供的一种利用乡土丛枝菌根真菌提高车桑子苗期抗旱性的方法包括:(1)土壤采集:A.根际土采集:在云南省元谋县干热河谷区于5月份雨季来临前,采用抖土法采集车桑子根际土壤样品,即轻轻抖动植株后依然保留在根部的土壤即为根际土,用毛刷将根际土壤采集于自封袋中,并用冰盒运回实验室,保存于4℃的冰箱中备用。
B.盆栽土壤采集:选择野外条件车桑子生长良好的区域,采用多点混合取样的方法采集燥红土表层土壤(0-20cm),将采集的土壤去除枯落物和大块砾石后,运回实验室,过2mm筛后备用。
(2)盆栽基质制备:
将步骤(1)中过2mm筛的燥红土进行高温高压灭菌,具体方法为:121℃、103.5kPa条件下,用高压灭菌锅湿热灭菌1h,反复灭菌3次,灭菌时间间隔为24h,以完全消除土壤微生物孢子。灭菌后混合均匀,等量装入各盆钵中,大约装至盆钵的2/3处,用于车桑子生长的培养基质。
(3)乡土菌根真菌分离:
从步骤(1)中采集的车桑子根际土壤样品中采用湿筛倾析-蔗糖离心法分离出丛枝菌根真菌孢子。即:将土壤按照质量1:10的比例放在灭菌水中,用离心机在2000转/分钟下离心5分钟,去除漂浮物,再加入质量浓度50%蔗糖溶液将沉积物混匀,在2000转/分钟下离心1分钟,将溶液倒入50μm的土筛中过滤,用清水洗除蔗糖。最后用滤膜在真空下过滤。过滤得到的孢子用质量浓度5%次氯酸钠灭菌5分钟,最后用灭菌水洗净。
(4)真菌接种:
在上述步骤(2)培养基质中分别加入乡土丛枝菌根真菌接种物。选择当地土壤分离出的乡土丛枝菌根真菌,并不是一个新种,只是当地的乡土菌根真菌由于对当地环境产生了一种适应性,因此对植物生长更有利。
(5)种子处理:在车桑子种子成熟季节,选择自然植被受人类干扰相对较小,性状优良的母树采集成熟饱满的车桑子种子,采集的种子装于布袋,带回实验室自然风干保存,播种前,将采集的成熟种子破除休眠后,播种于步骤(4)制备好的培养基质中,播种后在表面再覆盖上灭菌基质,不露出种子;所述步骤(5)中车桑子种子休眠破除是将种子浸泡在质量浓度为98%硫酸溶液中,浸泡10min后,去除浓硫酸,并用清水洗净。
(6)苗期管理与观察:车桑子生长培养期间将培养基质放于温度为25/35℃,夜/昼培养:8h/16h的气候培养箱进行培养,待车桑子种子发芽,长出4-5片子叶后,间苗,观测植物生长状况。当然在实际培养时,也可在自然条件下大棚置物架上进行培养。
为了用以说明本发明的技术方案能够提高车桑子苗期抗旱性的有益效果,同时,以不接种的灭菌处理和以接种非乡土丛枝菌根真菌的处理为对照。接种乡土菌根真菌时,即接种上述步骤(3)的菌根真菌孢子。为了明确用于接种的乡土丛枝菌根真菌群落特征,将接种样品送至上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序。经测定,用于接种的样品中共获得了14个OTU(Operational Taxonomic Units),其物种丰富度为9,主要从属于球囊霉属。物种多样性的香农指数和辛普森指数分别为0.76和0.58。接种非乡土丛枝菌根真菌为接种购买的摩西球囊酶(Glomus mosseae)和幼套球囊酶(Glomus etunicatum),通过北京市农林科学院植物与资源研究所“丛枝菌根真菌种质资源库”购买获得,其国家微生物资源平台编号分别为:1511C0001BGCAM0062和1511C0001BGCAM0015。接种时,在土面覆大约10g菌剂(5g Glomusmosseae和5g Glomus etunicatum)。在不接种的盆钵中则不做处理。
将各个处理的培养盆钵放于25/35℃(8h/16h)的气候培养箱中进行培养。在车桑子生长培养期间做干旱和湿润处理,干旱处理控制土壤含水量为35-40%田间持水量,湿润处理控制土壤含水量为75–80%田间持水量。待车桑子种子发芽,长出4-5片子叶后,间苗至每盆10棵,每天进行称重并补充灭菌水以维持含水量。培养期间观测车桑子生长状况,检测各处理下车桑子基本性状和生物量积累特征。
表1给出了水分处理15天后两种水分条件下不同丛枝菌根真菌接种处理的车桑子叶片大小特征:水分处理半个月后,水分处理和菌根真菌处理就对车桑子叶长和叶宽造成了显著影响。干旱处理显著降低了车桑子叶片长度和宽度。湿润条件下,不同菌根真菌处理没有显著性差异;干旱条件下,接种菌根真菌处理显著促进了车桑子叶片生长,并且接种乡土菌根真菌显著优于接种非乡土菌根真菌。
表1
Figure BDA0002405672490000061
注:表中数值为平均值±标准误,n=6。不同小写字母表示不同处理间差异显著,p<0.05;下同。
表2给出了水分处理两个月后两种水分条件下不同丛枝菌根真菌接种处理的车桑子生物量特征:干旱处理显著降低了地上生物量和根生物量,而接种菌根真菌处理显著促进了生物量的积累。水分和菌根真菌处理具有极显著的交互作用。湿润处理时,接种乡土菌根真菌和非乡土菌根真菌对生物量的积累无显著差异;而在干旱条件下,接种乡土菌根真菌的地上生物量和根生物量均显著高于接种非乡土菌根真菌处理。
表2
Figure BDA0002405672490000062
干旱显著增加了车桑子对菌根的依赖性。干旱条件下,车桑子对乡土菌根真菌的依赖性达到70%,显著高于非乡土菌根真菌;而在湿润条件下,车桑子对乡土菌和非乡土菌的依赖性无显著差异。
以上本发明乡土丛枝菌根真菌对车桑子生长和抗旱性的实验结果表明:
1.经过长期的适应和选择,干热河谷车桑子与乡土丛枝菌根真菌在当地土壤环境中已形成了十分紧密的共生关系。接种乡土菌根真菌对车桑子生长和抗旱具有更加明显的促进作用。
2.本发明提供的方法具有一定的普适性,可以推广应用到其它本地树种的生长培育过程中,利用乡土菌根真菌促进本地植物生长是一种生态、高效的方法。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种利用乡土丛枝菌根真菌提高车桑子苗期抗旱性的方法,其特征在于,该方法包括如下步骤:
(1)土壤采集:包括根际土壤采集和盆栽土壤采集,
根际土壤采集:在干热季节,采集车桑子根际土壤样品,将根际土壤采集于自封袋中,并用冰盒运回实验室,保存于4℃的冰箱中备用;
盆栽土壤采集:在车桑子生长区采集表层土壤,将采集的土壤运回实验室,过2mm筛后作为后续盆栽车桑子的土壤备用;
(2)盆栽基质制备:将步骤(1)中盆栽土壤经灭菌、混匀后,用于车桑子生长的培养基质;
(3)乡土丛枝菌根真菌分离:从步骤(1)中采集的根际土壤样品中分离出乡土丛枝菌根真菌孢子,以该乡土丛枝菌根真菌孢子为接种物;
(4)真菌接种:在上述步骤(2)培养基质中加入步骤(3)分离出的乡土丛枝菌根真菌接种物;
(5)种子处理:在车桑子种子成熟季节,选择自然植被受人类干扰相对较小,性状优良的母树采集成熟饱满的车桑子种子,采集的种子装于布袋,带回实验室自然风干保存,播种前,将采集的成熟种子破除休眠后,播种于步骤(4)制备好的培养基质中,播种后在表面再覆盖上灭菌基质,不露出种子;
(6)苗期管理与观察:车桑子生长培养期间将培养基质放于温度为25/35℃,夜/昼培养:8h/16h的气候培养箱或野外大棚置物架上进行培养,待车桑子种子发芽,长出4-5片子叶后,间苗,观测植物生长状况。
2.根据权利要求1所述的利用乡土丛枝菌根真菌提高车桑子苗期抗旱性的方法,其特征在于,所述步骤(2)中盆栽基质灭菌采用高温高压的方法,具体操作方法如下:121℃、103.5kPa条件下,用高压灭菌锅湿热灭菌1h,反复灭菌3次,灭菌时间间隔为24h,以完全消除土壤微生物孢子。
3.根据权利要求1所述的利用乡土丛枝菌根真菌提高车桑子苗期抗旱性的方法,其特征在于,所述步骤(3)中乡土丛枝菌根真菌孢子分离采用湿筛倾析-蔗糖离心法进行,即:将根际土壤按照质量1:10的比例放在灭菌水中,用离心机在2000转/分钟下离心5分钟,去除漂浮物,再加入质量浓度为50%蔗糖溶液将沉积物混匀,在2000转/分钟下离心1分钟,将溶液倒入50μm的土筛中过滤,用清水洗除蔗糖,最后用滤膜在真空下过滤,过滤得到的孢子用质量浓度为5%次氯酸钠灭菌5分钟,最后用灭菌水洗净。
4.根据权利要求1所述的利用乡土丛枝菌根真菌提高车桑子苗期抗旱性的方法,其特征在于,所述步骤(5)中车桑子种子休眠破除是将种子浸泡在质量浓度为98%硫酸溶液中,浸泡10min后,去除浓硫酸,并用清水洗净。
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