CN111296260B - 一种提升盆栽香腮杜鹃品质的培育方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种提升盆栽香腮杜鹃品质的培育方法，属于杜鹃栽培技术领域，包括移栽香腮杜鹃扦插苗，施加生物复合肥，接种ERM菌剂，盆栽香腮杜鹃的管理；其中，ERM菌剂的制备方法为：将ERM的菌株活化后接种至液体培养基中，在温度23‑26℃转速140‑160r/min的摇床中培养8‑12d，过滤，菌丝经无菌水冲洗多次后，分散在含有葡醛酸钠和右旋糖酐40的无菌水中。该方法能够促进根尖分生组织进行平周分裂，增加皮层厚度，提高香腮杜鹃的ERM菌根侵染率，提高盆栽杜鹃的生长品质；能够促进香腮杜鹃苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的表达，提高PAL活性，促进植保素的合成，提高盆栽香腮杜鹃的抗病性。

Description

一种提升盆栽香腮杜鹃品质的培育方法
技术领域
本发明属于杜鹃栽培技术领域，具体涉及一种提升盆栽香腮杜鹃品质的培育方法。
背景技术
菌根是自然界普遍存在的一种植物根系与土壤真菌的共生现象，地球上97％的有花植物都能形成菌根。杜鹃花类植物在自然条件下形成杜鹃花类菌根(ericoidmycorrhizas，ERM)，是内生菌根中的一个特殊类型。1974年，Read分离出杜鹃花类菌根菌Pezizella ericae，并对其结构和功能进行了研究，从此开启了杜鹃花科植物的菌根研究，至今已有大量菌根真菌菌株被分离出来。目前杜鹃花类菌根功能的研究主要集中在营养吸收、抗逆性增加、抗重金属污染等基础研究。杜鹃花科植物在全球范围内广泛分布，是重要的植被组成部分，从澳洲干旱沙地到北半球的灌丛荒地、地中海林地及热带雨林都有分布。这些生境的共同持点是营养贫瘠、土壤矿化率低，或土壤中有机质降解后的主要矿质营养以复杂的有机态存在，植物根系很难吸收利用。杜鹃花科植物在较为恶劣的生境中可以正常生长的重要的原因就是ERM共生体的存在，在很大程度上缓解了环境压力，改善了植物营养获取的方式，以及吸收复杂有机态氮(N)、磷(P)等营养成分。
现有技术如授权公告号为CN 105493726 B的中国发明专利，该发明公开了北美冬青盆栽增大果实及提高品质的施肥方法：1)北美冬青小苗上盆：第一年开春前，留基部主杆20cm截杆，当分枝5cm时，喷施多效唑500倍稀释液3次，每次间隔7天，分枝长度20-30cm，8月底施复合肥5克每株；2)第二年开春前再次修剪，留一年生枝5cm，开春后，喷施多效唑500倍稀释液3次，每次间隔7天；3)第三年盆栽开花前不施肥；4)第三年开花时，在雌株当中配置20％数量的雄株；5)雌株授粉座果后，浇施全元素水溶性肥两次；6)步骤5)第二次施肥15天后，测量果实果径，当果实达到7mm以上时，不再施肥；若在7mm以下时，施步骤5)的肥；7)第三年7-8月中旬，不施肥；8)第三年8月底至9月上旬，施步骤5)的肥2-3次，每次间隔10天。
发明内容
本发明的目的在于一种提升盆栽香腮杜鹃品质的培育方法，该方法能够促进根尖分生组织进行平周分裂，增加皮层厚度，提高香腮杜鹃的ERM菌根侵染率，提高盆栽杜鹃的生长品质；能够促进香腮杜鹃苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的表达，提高PAL活性，促进植保素的合成，提高盆栽香腮杜鹃的抗病性。
本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
提供一种盆栽香腮杜鹃的培育方法，包括以下步骤：
选择1年生香腮杜鹃扦插苗，株高16-20cm，茎粗4-6mm，插入盆栽基质中，每盆施生物复合肥26-30g；
上述盆栽基质至少包括以下两种：泥炭、椰糠、珍珠岩、堆腐木屑、煤渣、河沙、蔗渣、草炭；
采用根部浇施法接种ERM菌剂，每盆接种800-1100个孢子；
将盆栽香腮杜鹃放置在温度22-28℃，空气湿度65-72％的半阴环境中培养；
上述ERM菌剂的制备方法为：将ERM的菌株活化后接种至液体培养基中，在温度23-26℃转速140-160r/min的摇床中培养8-12d，过滤，菌丝经无菌水冲洗多次后，分散在含有葡醛酸钠和右旋糖酐40的无菌水中。根皮层组织具有较高的养分浓度和生理代谢速率，对于根系水分和养分的吸收和储存，以及真菌侵染均具有重要作用。皮层通常是由多层薄壁细胞构成，在根系资源吸收功能中发挥重要作用，因此皮层被看作是吸收根的主要特征，而皮层厚度也是衡量根系吸收和运输能力的重要指标之一。植物根系对菌根真菌的依赖性是建立在成本-效益理论的基础之上的，当植物皮层厚度较小时，根系扎根穿透能力强，横向运输能力强，根系较容易从土壤中获得充足的养分时，对菌根真菌的依赖性降低，会减少了根表面上的侵染位点数量，导致菌根真菌侵染率降低。菌剂中加入葡醛酸钠和右旋糖酐40能够促进根尖分生组织进行平周分裂，增加皮层厚度，提高对菌根真菌的依赖性，提高香腮杜鹃的ERM菌根侵染率，进而提高盆栽杜鹃的生长品质。
在某些实施方案中，上述生物复合肥包括腐熟的猪粪和浒苔混合物、硅藻土、糠醛渣。
在某些实施方案中，上述盆栽基质至少包括以下三种：泥炭、椰糠、珍珠岩、堆腐木屑、煤渣。
在某些实施方案中，上述盆栽基质组成及其重量份为：1-2份泥炭、2-4份椰糠、1-3份珍珠岩、3-4份堆腐木屑。
在某些实施方案中，上述盆栽香腮杜鹃的ERM菌根侵染率至少为70.7％。
在某些实施方案中，上述腐熟畜粪的发酵方法为：
将米根霉、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、白腐菌复配，得发酵菌剂；
将猪粪，浒苔按照2-1:1的比例混合，堆制，温度在50-54℃时进行第一次翻堆，待温度再次升至50-54℃时进行第二次翻堆，重复至堆料不再升至50℃及以上时，得发酵底物；
向发酵底物中加入N-[2-(4-对羟基苯酚)乙基]乙酰胺，接种发酵菌剂，发酵，得腐熟的猪粪和浒苔混合物。苯丙氨酸解氨酶(PAL)能够参与植保素的合成，植保素是植物受侵染或胁迫而产生的一类低分子量抗微生物的化合物，主要包括酚类植保素、异黄酮类植保素和萜烯类植保素，其中前两类都是PAL的直接或间接产物，其生成量与PAL活性成正相关关系。通过向发酵底物中加入N-[2-(4-对羟基苯酚)乙基]乙酰胺后，再用米根霉、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、白腐菌组成的复配菌剂进行发酵，得到的腐熟的猪粪和浒苔混合物中含有某种物质能够促进香腮杜鹃苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的表达，提高PAL的活性，促进盆栽香腮杜鹃植保素的合成，进而提高盆栽香腮杜鹃抗病性。
本发明提供葡醛酸钠和右旋糖酐40在提高盆栽香腮杜鹃的ERM菌根侵染率中的用途。
本发明提供一种上述培育方法在提高盆栽香腮杜鹃品质中的用途。
本发明提供一种生物复合肥，包括腐熟的猪粪和浒苔混合物、硅藻土、糠醛渣，上述腐熟的猪粪和浒苔混合物的发酵方法为：
将米根霉、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、白腐菌复配，得发酵菌剂；
将猪粪，浒苔按照2-1:1的比例混合，堆制，温度在50-54℃时进行第一次翻堆，待温度再次升至50-54℃时进行第二次翻堆，重复至堆料不再升至50℃及以上时，得发酵底物；
向发酵底物中加入N-[2-(4-对羟基苯酚)乙基]乙酰胺，接种发酵菌剂，发酵，得腐熟的猪粪和浒苔混合物。
本发明提供一种上述生物复合肥在提高香盆栽腮杜鹃抗病性中的用途。
本发明的有益效果为：
1)本发明通过在ERM菌剂中加入葡醛酸钠和右旋糖酐40能够促进根尖分生组织进行平周分裂，增加皮层厚度，提高对菌根真菌的依赖性，提高香腮杜鹃的ERM菌根侵染率，进而提高盆栽杜鹃的生长品质；
2)本发明通过向发酵底物中加入N-[2-(4-对羟基苯酚)乙基]乙酰胺后，再用米根霉、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、白腐菌组成的复配菌剂进行发酵，得到的腐熟的猪粪和浒苔混合物中含有某种物质能够促进香腮杜鹃苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的表达，提高PAL的活性，促进盆栽香腮杜鹃植保素的合成，进而提高盆栽香腮杜鹃抗病性；
3)本发明通过对香腮杜鹃的盆栽基质进行优化，提高基质水分、养分的吸附能力和通风透气性，促进香腮杜鹃的良好生长。
附图说明
图1为本发明试验例1中菌根皮层厚度和菌根感染率；
图2为本发明试验例1中菌根皮层细胞显微图；
图3为本发明试验例2中PAL基因的转录水平；
图4为本发明试验例2中PAL的酶活；
图5为本发明试验例3中鞣质、木质素、绿原酸、大黄素的含量；
图6为本发明试验例4中总生物量和根系发病率；
图7为本发明试验例5中株高、地径、叶面积、总分枝长以及叶绿素含量。
具体实施方式
除非另外说明，本文所提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都以整体援引的方式并入本文中，如同将其全文进行阐述。
除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。在相抵触的情况下，则以本说明书中的定义为准。
当以范围、优选范围或一系列上限优选值和下限优选值给出数量、浓度或其他数值或参数时，应理解其具体公开了由任何较大的范围限制或优选值和任何较小的范围限制或优选值的任何一对数值所形成的所有范围，而无论这些范围是否分别被公开。例如，当描述“1至5”的范围时，所描述的范围应解释为包括“1至4”、“1至3”、“1至2”、“1至2和4至5”、“1至3和5”等范围。除非另有说明，在本文描述数值范围之处，所述的范围意图包括范围端值和范围内的所有整数和分数。
另外，在本发明的要素或组分之前的词语“一”和“一种”意图表示对于该要素或组分的出现(即发生)次数没有限制性。因此，“一”或“一种”应理解为包括一种或至少一种，除非明确表示数量为单数，否则单数形式的所述要素或组分也包括复数的情况。
本发明的实施方式，包括在发明内容部分中所述本发明的实施方式以及本文下述的任何其他的实施方式，均可任意地进行组合。
以下详述本发明。
提供一种盆栽香腮杜鹃的培育方法，包括以下步骤：
选择1年生香腮杜鹃扦插苗，株高16-20cm(优选地，例如16cm、17cm、18cm、20cm等)，茎粗4-6mm(优选地，例如4mm、4.5mm、6mm等)，插入盆栽基质中，花盆大小为10-15cm×12-18cm(优选地，例如10cm×12cm、10cm×14cm、12cm×16cm、15cm×18cm等)，每盆施生物复合肥26-30g(优选地，例如26g、27g、28g、29g、30g等)；
上述盆栽基质至少包括以下两种：泥炭、椰糠、珍珠岩、堆腐木屑、煤渣、河沙、蔗渣、草炭；
采用根部浇施法接种ERM菌剂，每盆接种800-1100个(优选地，例如800个、860个、900个、980个、1000个、1100个)孢子；
将盆栽香腮杜鹃放置在温度22-28℃(优选地，例如22-25℃、22-28℃、24-26℃、24-25℃等)，空气湿度65-72％(优选地，例如65-68％、66-69％、68-70％、69-72％等)的半阴环境中培养；根皮层组织具有较高的养分浓度和生理代谢速率，对于根系水分和养分的吸收和储存，以及真菌侵染均具有重要作用。皮层通常是由多层薄壁细胞构成，在根系资源吸收功能中发挥重要作用，因此皮层被看作是吸收根的主要特征，而皮层厚度也是衡量根系吸收和运输能力的重要指标之一。植物根系对菌根真菌的依赖性是建立在成本-效益理论的基础之上的，当植物皮层厚度较小时，根系扎根穿透能力强，横向运输能力强，根系较容易从土壤中获得充足的养分时，对菌根真菌的依赖性降低，会减少了根表面上的侵染位点数量，导致菌根真菌侵染率降低。上述ERM菌剂的制备方法为：将ERM的菌株活化后接种至液体培养基中，在温度23-26℃(优选地，例如23℃、24℃、25℃、26℃等)转速140-160r/min、(优选地，例如140r/min、146r/min、150r/min、158r/min、160r/min等)的摇床中培养8-12d(优选地，例如8d、9d、10d、11d、12d等)，过滤，菌丝经无菌水冲洗多次后，分散在含有葡醛酸钠和右旋糖酐40的无菌水中。优选地，上述葡醛酸钠的含量为9.6-11.4mg/L，上述右旋糖酐40的含量为22-34.5mg/L。更为优选地，上述葡醛酸钠的含量为10.2mg/L，上述右旋糖酐40的含量为26.8mg/L。菌剂中加入葡醛酸钠和右旋糖酐40能够促进根尖分生组织进行平周分裂，增加皮层厚度，使皮层厚度增加151％以上，提高对菌根真菌的依赖性，使得香腮杜鹃的ERM菌根侵染率提高72.5％以上，进而使得与菌剂中未加入葡醛酸钠和右旋糖酐40培育1年的盆栽香腮杜鹃相比，株高增加38％以上、地径增加16％以上、叶面积增加33％以上、总分枝长增加92％以上、叶绿素含量增加51％以上。
在某些实施方案中，上述生物复合肥包括腐熟的猪粪和浒苔混合物、硅藻土、糠醛渣。
在某些实施方案中，上述盆栽基质至少包括以下三种：泥炭、椰糠、珍珠岩、堆腐木屑、煤渣。
在某些实施方案中，上述盆栽基质组成及其重量份为：1-2份泥炭、2-4份椰糠、1-3份珍珠岩、3-4份堆腐木屑。优选地，上述盆栽基质组成及其重量份为1份泥炭、2份椰糠、1份珍珠岩、3份堆腐木屑。
在某些实施方案中，上述盆栽香腮杜鹃的ERM菌根侵染率至少为70.7％。
在某些实施方案中，上述腐熟畜粪的发酵方法为：
将米根霉、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、白腐菌复配，得发酵菌剂；
将猪粪，浒苔按照2-1:1(优选地，例如1:1，2:1等)的比例混合，堆制5-7d，温度在50-54℃(优选地，例如50℃、51℃、52℃、53℃、54℃等)时进行第一次翻堆，待温度再次升至50-54℃(优选地，例如50℃、51℃、52℃、53℃、54℃等)时进行第二次翻堆，重复至堆料不再升至50℃及以上时，静置8-14d至堆料的含水量为42-56wt％，得发酵底物；
苯丙氨酸解氨酶(PAL)能够参与植保素的合成，植保素是植物受侵染或胁迫而产生的一类低分子量抗微生物的化合物，主要包括酚类植保素、异黄酮类植保素和萜烯类植保素，其中前两类都是PAL的直接或间接产物，其生成量与PAL活性成正相关关系。向发酵底物中加入0.08-0.15wt％N-[2-(4-对羟基苯酚)乙基]乙酰胺，接种4-6wt％发酵菌剂，发酵10-12d，得腐熟的猪粪和浒苔混合物。通过向发酵底物中加入N-[2-(4-对羟基苯酚)乙基]乙酰胺后，再用米根霉、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、白腐菌组成的复配菌剂进行发酵，得到的腐熟的猪粪和浒苔混合物中含有某种物质能够使香腮杜鹃苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的相对表达量至少提高2.87倍，使得PAL的活性至少提高1.8倍，使盆栽香腮杜鹃的鞣质含量至少提高90％、木质素含量至少提高65％、绿原酸含量至少提高55％、大黄素含量至少提高48％，进而使香腮杜鹃的根腐病的发病率至少降低58％。
本发明提供葡醛酸钠和右旋糖酐40在提高盆栽香腮杜鹃的ERM菌根侵染率中的用途。
本发明提供一种上述培育方法在提高盆栽香腮杜鹃品质中的用途。
本发明提供一种生物复合肥，包括腐熟的猪粪和浒苔混合物、硅藻土、糠醛渣，上述腐熟的猪粪和浒苔混合物的发酵方法为：
将米根霉、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、白腐菌复配，得发酵菌剂；
将猪粪，浒苔按照2-1:1(优选地，例如1:1，2:1等)的比例混合，堆制5-7d，温度在50-54℃(优选地，例如50℃、51℃、52℃、53℃、54℃等)时进行第一次翻堆，待温度再次升至50-54℃(优选地，例如50℃、51℃、52℃、53℃、54℃等)时进行第二次翻堆，重复至堆料不再升至50℃及以上时，静置8-14d至堆料的含水量为42-56wt％，得发酵底物；
向发酵底物中加入0.08-0.15wt％N-[2-(4-对羟基苯酚)乙基]乙酰胺，接种4-6wt％发酵菌剂，发酵10-12d，得腐熟的猪粪和浒苔混合物。
本发明提供一种上述生物复合肥在提高香盆栽腮杜鹃抗病性中的用途。
以下结合实施例对本发明作进一步详细描述：
实施例1：
一种生物复合肥的制备方法，包括：
腐熟的猪粪和浒苔混合物的制备：将米根霉、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、白腐菌按照1:1:1:1的比例复配，得发酵菌剂；
将猪粪，浒苔按照1:1的比例混合，堆制7d，温度在50℃时进行第一次翻堆，待温度再次升至50℃时进行第二次翻堆，重复至堆料不再升至50℃及以上时，静置12d至堆料的含水量为48wt％，得发酵底物；
向发酵底物中加入0.12wt％N-[2-(4-对羟基苯酚)乙基]乙酰胺，接种6wt％发酵菌剂，发酵12d，得腐熟的猪粪和浒苔混合物。
生物复合肥的制备：将腐熟的猪粪和浒苔混合物、硅藻土、糠醛渣按照5:2:4的比例混匀，得生物复合肥。
实施例2：
腐熟的猪粪和浒苔混合物的制备过程中未加入N-[2-(4-对羟基苯酚)乙基]乙酰胺，其余部分和实施例1完全一致。
实施例3：
一种盆栽香腮杜鹃的培育方法，包括：
盆栽基质的配制：将1重量份的泥炭、2重量份的椰糠、1重量份的珍珠岩、3重量份的堆腐木屑混合均匀，放入15cm×18cm的花盆中，每盆施加本发明实施例1制备的生物复合肥28g。
ERM菌剂的制备：所用ERM的菌株为Oidiodendron maius，购自北京百欧博伟生物技术有限公司。将菌株接种至MEA固体培养基活化，然后把菌块接种至MEA液体培养基中，在温度24℃转速150r/min的摇床中培养10d，过滤，将得到的菌丝用无菌水冲洗3次后，分散在含有10.2mg/L葡醛酸钠和26.8mg/L右旋糖酐40的无菌水中。
香腮杜鹃扦插苗的移栽：2018年3月选择1年生香腮杜鹃扦插苗，株高16cm，茎粗4.5mm，插入盆栽基质中，插入深度为2.5cm。
菌剂的接种：在植株两侧根系外围浇施菌剂，每盆接种的菌剂中含有800个孢子。
盆栽香腮杜鹃的管理：将盆栽香腮杜鹃放置在温度25℃，空气湿度68％，透光率65％的环境中培养。
实施例4：
每盆施加的生物复合肥为实施例2制备的生物复合肥，其余部分和实施例3完全一致。
对比例1：
ERM菌剂中不含有葡醛酸钠，其余部分和实施例3完全一致。
对比例2：
ERM菌剂中不含有右旋糖酐40，其余部分和实施例3完全一致。
对比例3：
ERM菌剂中不含有葡醛酸钠和右旋糖酐40，其余部分和实施例3完全一致。
对比例4：
ERM菌剂中不含有葡醛酸钠和右旋糖酐40，其余部分和实施例4完全一致。
试验例1：
2018年10月采集香腮杜鹃的根样，把根系上的基质轻轻抖落，清水洗净，取幼嫩的根段。
1.皮层厚度的测定：取幼嫩根段剪成2mm的小段，放入卡诺氏固定液中固定1.5h，然后在85％、95％的乙醇中进行梯度脱水，各梯度脱水10min，最后均在99％乙醇中脱水两次，第一次10min，第二次5min，然后依次转入二甲苯和99％乙醇之比为1:2、1:1、2:1的混合液中分别透明10min，最后转入纯二甲苯中透明2次，每次约5min，至根尖透明为止，石蜡提取融化冷却至65℃，将经透明处理的根尖样本先后2次放入融化石蜡液中，分别浸润1h，包埋后的蜡块冷却后可直接切片或保存于4℃冰箱备用，用轮转式石蜡切片机进行连续切片，厚度5μm，切片50℃烤干。取干燥的切片进行脱蜡、反水、HE染色。切片放入二甲苯脱蜡15min，两次脱蜡后，依次放入100％、95％、80％、70％乙醇中各2min，在蒸馏水中洗3-5s，放入Ehrlich苏木精染色10min；1％氨水分色35s后流水冲洗30min，70％和90％乙醇中各脱水10min，伊红染色5min后以90％乙醇分色40s，中性树胶封片后，切片在配备有LCD的光学显微镜下观察拍照，根段在FAA固定液中固定24h，乙醇梯度脱水后储存于70％乙醇中，取出固定好的根段，在110倍体视显微镜下用双面刀片切成薄片，在光学显微镜下观察、拍照、测量。
2.香腮杜鹃ERM菌根侵染率的测定：取幼嫩根段剪成5mm的根段，固定在FAA中24h以上或4％戊二醛固定液中2-4h以上。将FAA固定的根段经10％KOH透明处理，用0.1mol/LHCL酸化处理后用0.2％锥虫蓝染液染色、分色，在光学显微镜下观察幼根表皮及皮层细胞中是否有菌丝结或菌丝，并估算菌根感染率：
菌根感染率(％)＝菌根感染的根段长度/检查的菌根根段总长度×100。
菌根皮层厚度和菌根感染率的测定结果见图1。菌根皮层细胞显微图见图2。
由图1、图2可以看出，实施例3和实施例4培育的盆栽香腮杜鹃的菌根皮层厚度和菌根感染率明显高于对比例1、对比例2、对比例3、对比例4，这说明，菌剂中加入葡醛酸钠和右旋糖酐40能够促进根尖分生组织进行平周分裂，增加皮层厚度，提高对菌根真菌的依赖性，提高香腮杜鹃的ERM菌根侵染率。
试验例2：
1.苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的转录水平：
2018年10月取盆栽香腮杜鹃的叶片0.2g，参照RNA simple Total RNA Kit试剂盒提取叶片总RNA。
参照生工生物工程(上海)有限公司的M-MuLV First Stand DNA Synthesis Kit使用方法反转录合成cDNA。
RT-PCR扩增：以cDNA为模板，17S为内参基因，参考上海生工的Green-2-Go qPCRMastermix说明书，使用Stratagene Mx3000pTMReal-time PCR System，采用两步法进行RT-PCR扩增，扩增程序为：95℃10min，95℃15s，62℃60s，40个循环，根据得到的Ct值，利用Kenneth和Thomas的2-△△Ct方法计算PAL基因的相对表达量。PAL基因引物为：
F：TTGACTCTTCTGTGTGGAGTGA；
R：CCTTGGAGATGATTTTCTGAGA
17S内参基因：
F：TGCGACAATCGATCTGGTATG；
R：CATGTCTTGGTAAGTTCGGAG。
2.苯丙氨酸解氨酶(PAL)活力的测定：
2018年10月取盆栽香腮杜鹃的叶片0.5g，参照苯丙氨酸解氨酶试剂盒的使用说明进行酶活测定。PAL基因的转录水平见图3。PAL酶活的测定结果见图4。
由图3，图4可以看出，实施例3、对比例1、对比例2和对比例3培育的盆栽香腮杜鹃的PAL的基因转录水平和酶活菌明显高于实施例4和对比例4，这说明，制备生物复合肥时通过向发酵底物中加入N-[2-(4-对羟基苯酚)乙基]乙酰胺后，再用米根霉、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、白腐菌组成的复配菌剂进行发酵，得到的腐熟的猪粪和浒苔混合物中含有某种物质能够促进香腮杜鹃PAL基因的表达，提高PAL的活性。
试验例3：
植保素的含量测定：
2018年10月采集香腮杜鹃的根样，把根系上的基质轻轻抖落，清水洗净，自然风干，100℃水蒸气固定2.5min，70℃干燥12h，研磨后过0.25mm网筛，干燥保存。
鞣质的测定：取0.1g样品，加水25mL，微火煮沸30min，放冷过滤至干燥锥形瓶中，加水定容至25mL，取1mL，加入24mL蒸馏水，再加入两滴5％靛红溶液，用0.01mol/L高锰酸钾溶液滴定，溶液从蓝色变成绿色再变为黄色为终点。
木质素的测定：取1g样品，用滤纸包好后放在索氏抽提器中，用2:1苯-乙醇混合液抽提6h，取出风干后将试样转入具塞锥形瓶中，25℃用15mL 7.5％(v/v)硫酸反应2.5h，加水稀释至硫酸的体积分数为3％，煮沸回流4h，过滤，用蒸馏水洗涤至中性，然后将滤纸连同残渣移入坩埚中，105℃烘干至恒重，即得木质素含量。
绿原酸的测定：取0.1g样品，加入95％乙醇回流提取0.5h，定容至25mL，取1mL，置于25mL容量瓶中，加入0.2mol/L盐酸定容至刻度，摇匀，以试剂空白为对照，在327nm出测定吸光度。
大黄素的测定：取0.1g样品，加入0.5mol/L盐酸4mL，氯仿3mL，60℃回流1h，倒入离心管，再加入3mL氯仿洗涤，4000rpm离心，取氯仿层置25mL容量瓶中，水浴蒸干，加入50g/kgNaOH溶液定容至25mL，黑暗放置30min，以50g/kg NaOH溶液为空白对照，测定517nm处吸光度。鞣质、木质素、绿原酸、大黄素的含量见图5。
由图5可以看出，实施例3、对比例1、对比例2和对比例3培育的盆栽香腮杜鹃的鞣质、木质素、绿原酸、大黄素的含量明显高于实施例4和对比例4，这说明，制备生物复合肥时通过向发酵底物中加入N-[2-(4-对羟基苯酚)乙基]乙酰胺后，再用米根霉、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、白腐菌组成的复配菌剂进行发酵，得到的腐熟的猪粪和浒苔混合物中含有某种物质能够促进鞣质、木质素、绿原酸、大黄素的合成。
试验例4：
盆栽香腮杜鹃抗病性的测定：
根腐病为杜鹃常见病害，本试验测定盆栽香腮杜鹃对根腐病的抗性。
所用根腐病菌菌株为大双孢柱孢(Neonectria macrodidyma)，由甘肃农业大学植物病原实验室提供。培养基为PDA培养基。
根腐病菌在PDA培养基上培养10d后，用0.025％的吐温80溶液和无菌水洗下孢子，用玻棒搅拌均匀，Neubauer血球计数板观察计数。配制成1×107cfu/mL分生孢子悬浮液备用。2019年4月初，采取伤根灌注法接种根腐病菌，接种量为5mL/盆，接种2个月后挖取植株，统计根系发病率，测定根鲜重，将香腮杜鹃整株于60℃条件下烘干至恒重测定植株总生物量，计算根系发病率：
根系发病率(％)＝(发病根系鲜重/根系总鲜重)×100％。
总生物量和根系发病率的测定结果见图6。
由图6可以看出，实施例3、对比例1、对比例2和对比例3培育的盆栽香腮杜鹃的总生物量明显高于实施例4和对比例4，发病率明显低于实施例4和对比例4，这说明，制备生物复合肥时通过向发酵底物中加入N-[2-(4-对羟基苯酚)乙基]乙酰胺后，再用米根霉、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、白腐菌组成的复配菌剂进行发酵，得到的腐熟的猪粪和浒苔混合物中含有某种物质能够促进香腮杜鹃的生长，提高香腮杜鹃对根腐病的抗性。
试验例5：
盆栽香腮杜鹃品质的测定：
2019年3月测量生长指标。株高用卷尺测量植物地上基部到顶芽的高度，地径采用游标卡尺在根茎部上面1cm处测量，叶面积是摘取均匀一致的成熟叶片用叶面积仪(Yaxin-1241)测量，叶绿素是使用便携式叶绿素仪SPAD-502测量叶片的值(避开叶边和叶脉)。株高、地径、叶面积、总分枝长以及叶绿素含量的测定结果见图7。
由图7可以看出，实施例3和实施例4的株高、地径、叶面积、总分枝长、叶绿素含量明显高于对比例1、对比例2、对比例3、对比例4，这说明，菌剂中加入葡醛酸钠和右旋糖酐40能够提高盆栽杜鹃的株高、地径、叶面积、总分枝长、叶绿素含量。
上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
序列表
<110> 元成环境股份有限公司
<120> 一种提升盆栽香腮杜鹃品质的培育方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttgactcttc tgtgtggagt ga 22
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccttggagat gattttctga ga 22
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcgacaatc gatctggtat g 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
catgtcttgg taagttcgga g 21

Claims (8)

1.一种盆栽香腮杜鹃的培育方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）选择1年生香腮杜鹃扦插苗，株高16-20cm，茎粗4-6mm，插入盆栽基质中，每盆施生物复合肥26-30g；
所述盆栽基质至少包括以下两种：泥炭、椰糠、珍珠岩、堆腐木屑、煤渣、河沙、蔗渣、草炭；
2）采用根部浇施法接种ERM菌剂，每盆接种800-1100个孢子；
3）将盆栽香腮杜鹃放置在温度22-28℃，空气湿度65-72%的半阴环境中培养；
所述ERM菌剂的制备方法为：将ERM的菌株活化后接种至液体培养基中，在温度23-26℃转速140-160r/min的摇床中培养8-12d，过滤，菌丝经无菌水冲洗多次后，分散在含有葡醛酸钠和右旋糖酐40的无菌水中。
2.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于：所述生物复合肥包括腐熟的猪粪和浒苔混合物、硅藻土、糠醛渣。
3.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于：所述盆栽基质至少包括以下三种：泥炭、椰糠、珍珠岩、堆腐木屑、煤渣。
4.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于：所述盆栽基质组成及其重量份为：1-2份泥炭、2-4份椰糠、1-3份珍珠岩、3-4份堆腐木屑。
5.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于：所述盆栽香腮杜鹃的ERM菌根侵染率至少为70.7%。
6.根据权利要求2所述的培育方法，其特征在于：所述腐熟的猪粪和浒苔混合物的发酵方法为：
1）将米根霉、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、白腐菌复配，得发酵菌剂；
2）将猪粪，浒苔按照2-1:1的比例混合，堆制，温度在50-54℃时进行第一次翻堆，待温度再次升至50-54℃时进行第二次翻堆，重复至堆料不再升至50℃以上时，得发酵底物；
3）向发酵底物中加入N-[2-(4-对羟基苯酚)乙基]乙酰胺，接种发酵菌剂，发酵，得腐熟的猪粪和浒苔混合物。
7.一种ERM菌剂在提高盆栽香腮杜鹃的ERM菌根侵染率中的用途，其特征在于：所述ERM菌剂中含有葡醛酸钠和右旋糖酐40。
8.权利要求1-6任一项中所述的培育方法在提高盆栽香腮杜鹃品质中的用途。
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