CN1433670A

CN1433670A - 菌根真菌在金线莲栽培中的应用技术

Info

Publication number: CN1433670A
Application number: CN 02100779
Authority: CN
Inventors: 郭顺星; 于雪梅; 高微微; 肖培根
Original assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medicinal Plant Development of CAMS and PUMC
Priority date: 2002-01-25
Filing date: 2002-01-25
Publication date: 2003-08-06

Abstract

一种菌根真菌在金线莲栽培中的应用技术，所用的小菇属4种真菌：石斛小菇(Mycena dendrobii)，紫萁小菇(Mycena osmundicola)，兰小菇(Mycena orchidicola)，开唇兰小菇(Mycena anoectochila)；先分别培养菌根真菌和金线莲幼苗，再将菌根真菌与金线莲幼苗共生栽培。采用该项新技术，可大大缩短金线莲的生长周期；提高金线莲产量和有效成分含量。该项技术栽培方法简单、投资少、不施任何肥料和农药，生产出的金线莲为绿色产品。

Description

菌根真菌在金线莲栽培中的应用技术

技术领域

本发明涉及一种金线莲菌根栽培技术，具体地说涉及一种菌根真菌在金线莲栽培中的应用技术，它包括本发明所用的菌根真菌、菌根真菌的培养、金线莲芽增殖分化和丛芽形成苗及苗继代的最佳培养基、菌根真菌在金线莲栽培中的应用技术和对金线莲苗的促生长效果及对金线莲苗有效成分含量的影响。

背景技术

金线莲[Anoectochilus roxburghii(Wall.)Lindl.]为兰科花叶开唇兰属植物，是一种名贵中草药。属陆生兰，全草均可入药，其味甘微苦，性平微寒，具有清热凉血、祛风利湿、强心、降血压、解毒、止痛、镇咳等功效。民间多用于消炎、镇痛、治疗肺结核、肺热咳嗽，风湿性关节炎、小儿惊风、跌打损伤、蛇伤等多种疾病，均有很好疗效。近年来，金线莲用于治疗高血压、糖尿病、肝炎及肿瘤等疑难病症。日益引起医药界的重视。金线莲在民间素有“金草”、“神药”、“乌人参”等美称。在台湾被称为“药王”。经测定发现，金线莲中氨基酸组成、成分、含量及抗衰老活性的微量元素的含量均高于国产和野生西洋参。目前，由于金线莲资源紧缺、价格昂贵，对金线莲的研究仅涉及文献考证、组培及商品调查等方面。

金线莲生于海拔400-1200米之间的阔叶林或针阔叶混交林中，一般生长在通风良好、湿度高、光线较弱的山涧常绿阔叶林下，石壁、沟边、岩缝等阴湿地带。由于该种植物分布范围较窄，储量极为稀少。从1990年开始，福建省科委、教委和林业厅陆续设立专项基金进行金线莲的组织培养及栽培技术研究。目的是为提高金线莲繁殖速度与进行人工栽培奠定基础。试管苗快速繁殖虽然获得了成功，但试管苗出瓶后成活率低、生长缓慢、生长周期长和有效成分含量低成为制约金线莲扩大栽培的主要障碍。为此，目前金线莲仍未大面积人工栽培繁殖。

由于金线莲自然生态条件独特，繁殖率低，生长缓慢，加上鸟类嗜食，特别是近年来对该植物需求量猛增，产区人们过度采控，使得金线莲野生资源日渐枯竭。在金线莲菌根研究方面，仅江海燕等观察到有真菌侵染金线莲种子的现象；我们在野生金线莲的根中也观察到有真菌的存在，并从该类植物中分离出多种内生真菌。实现金线莲栽培从实验室到工厂化到田间的转化的关键技术，是首先需要解决的问题，而利用菌根技术将金线莲与菌根真菌共生培养，筛选出促进金线莲生长发育有效的优良菌株，对保存金线莲种质资源、提高药效，开辟金线莲大面积栽培繁殖的新途径具有重大理论意义和应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种菌根真菌在金线莲栽培中的应用技术，可以解决金线莲繁殖率低、栽培生长缓慢和周期长、有效成分含量低和药效差等问题。

为实现上述目的，本发明采用的技术是先分别培养菌根真菌和金线莲幼苗，再将菌根真菌与金线莲幼苗共生栽培，能够完成本发明的菌根真菌是一种小菇属(Mycena)真菌，具体为：石斛小菇(Mycena dendrobii)，紫萁小菇(Mycena osmundicola)，兰小菇(Mycena orchidicola)，开唇兰小菇(Mycena anoectochila)等4种。这4种真菌可以从铁皮石斛、天麻、墨兰和花叶开唇兰获得，于2002年1月14日在中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏编号为0685、0689、0688、0687。

具体地说，本发明所述技术的步骤方法如下(除有特殊说明外，本发明中所述的比例均为重量百分比)：

1、菌根真菌的培养

将上述的菌根真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后，分别转接于PDA平皿中，于25℃恒温培养12-20d，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体或固体培养基；

菌根真菌的液体培养为：

培养基的配制：葡萄糖2.5％；KH₂PO₄ 0.15％；K₂HPO₄ 0.1％；MgSO₄ 0.15％；天然物：麦麸3％(煮汁)。高压灭菌后分别接入上述真菌。培养条件：培养基pH5.6；三角瓶摇床培养瓶装量50％；转速120转/分钟；23℃培养30天收获。发酵罐培养接种量10％，其余参数同上。发酵培养结束时收获发酵物，用匀浆机打碎菌体及发酵物备用。

菌根真菌的固体培养为：

培养基的配制：阔叶树锯末∶麦麸∶玉米粒＝1∶1∶0.5，加水量为原料的150-250％。高压灭菌后分别接入上述真菌。待菌丝从培养基顶部长入底部时(2个月左右)取出备用。

本发明可以采用上述4种菌根真菌中的任选一种，也可以是由其中任意两种或两种以上菌种组成。

2、金线莲苗的培养

芽增殖培养基：MS(Murashige and Skoog 1968)培养基加6-BA(6-苄基嘌呤1.2mg/L、NAA(萘乙酸)0.6mg/L；

丛芽增殖培养基：MS为基本培养基6-苄基嘌呤(BA)1.5mg/L，吲哚丁酸(IBA)0.6mg/L，玉米素(ZT)0.15mg/L；

苗继代培养基：1/2MS，200g/L马铃薯提取液，25g/L蔗糖，琼脂9g/L，pH5.8；

3、菌根真菌与金线莲苗共生栽培

(1)金线莲栽培基质

蛭石∶砂子(4∶1)或森林腐殖土∶砂子(6∶1)或泥炭土∶砂子(5∶1)或泥炭土∶砂子∶蛭石(4∶1∶2)。其中以泥炭土∶砂子∶蛭石(4∶1∶2)或森林腐殖土∶砂子(6∶1)为佳。

(2)金线莲菌根共生栽培

栽培工具各种硬质材料的托盘或花盆，立体栽培；硬质材料包括木制、不锈钢、塑料、玻璃、陶瓷等。在其容器的基部平铺一层2-3厘米厚的基质，其上株行距各5-8厘米栽培一株或2-3株一丛的金线莲苗，栽前每一株或一丛苗根的基部放置少量粉碎至0.5-1厘米大小的湿栎树(山毛榉科Fagaceae)树叶，其上再放以上备好的液体菌根真菌2ml或固体菌根真菌1-2g。使金线莲的根与菌接触，用栽培基质将苗埋好，覆盖基质厚度视金线莲幼苗的高度而定，一般2-3厘米厚。栽后浇放置至室温的自来水即可。

(3)栽培条件

一般塑料薄膜温室、玻璃温室、露天栽培遮阳网遮阴均可采用菌根栽培方法栽培金线莲。栽培金线莲适宜的环境温度为18-25℃，光照量为正常日光量的1/3，照度2000Lx。

(4)金线莲的收获

金线莲一般栽后4-6个月收获。收获时即可剪取地上部分，也可一次性连根取出洗净栽培基质。阴干或60℃以下烘干。

本发明提供的栽培技术，金线莲生长周期可由传统栽培的12个月缩短到4至6个月；产量提高20-40％；与不接菌根真菌栽培的金线莲苗(对照)相比，该项技术使金线莲苗中总糖含量提高60％，使苗中皂甙含量提高28％；生物碱含量提高1.4倍。

具体实施方式

实施例一：

1、石斛小菇真菌的培养

(1)将石斛小菇菌自低温保藏的斜面试管菌种活化一次后，分别转接于PDA平皿中，25℃恒温培养12-20d时，用φ8mm的打孔器分别在平皿中的菌落边缘打孔成菌片，分别以小碎块接入下述的液体培养基进行培养。

(2)液体培养基的配制：葡萄糖2.5％；KH₂PO₄ 0.15％；K₂HPO₄ 0.1％；MgSO₄ 0.15％；天然物：麦麸3％(煮汁)。

(3)培养条件：高压灭菌后分别接入上述真菌，其培养条件：培养基pH5.6；三角瓶摇床培养瓶装量50％；转速120转/分钟；温度：23℃；培养30天收获。发酵罐培养接种量10％，其余参数同上。发酵培养结束时收获发酵物，用匀浆机打碎菌体及发酵物备用。

2、金线莲芽分化发生过程

茎段接种7天即可见节部腋叶对侧生出乳白色颗粒，此为气生根原基；少数茎段节间腋内分化出乳白色颗粒，此为腋芽原基。腋芽与根的最初萌生阶段形态极为相似，均为乳白色颗粒，二者在节部相对而生，这一时期茎段有膨大现象。培养10d时多数茎段节部腋内鼓出乳白色颗粒，有的乳白色颗粒长至圆锥状。腋叶对生的乳白色颗粒伸长成为根。当乳白色颗粒长至3mm左右长、1.5mm左右粗时，顶部出现芽尖，下部长成为浅绿茎，此为主芽。随着主芽茎叶的生长，当主芽具有2-3节时，从其基部节开始分化一级侧芽，其上可发出二级侧芽，二级侧芽上又可再生三级侧芽、四级侧芽。侧芽一般先从上一级芽的最下部节发出，其次是下数第二节部。在分化能力强的培养基中，可出现多级侧芽，且可见多级侧芽同时生长分化，茎尖侧芽的发生早于茎段。

3、激素对芽增殖分化的影响

MS培养基不能诱导金线莲芽增殖。当培养115天时，在MS(Murashige and Skoog 1968)培养基附加6-BA(6-苄基嘌呤)1.0mg/L时，诱导金线莲茎段、茎尖芽增殖数最多，其主芽及茎尖一般都能产生2-4级分枝。

在MS培养基附加6-BA 1.2mg/L、NAA(萘乙酸)0.6mg/LNAA诱导的茎段、茎尖芽增殖数最多，分别为对照的3.7倍和3.6倍。截取芽顶部2-2.5cm转接到MS培养基中，10后天即可生根，25天成为完整苗。

4、激素对丛芽形成的影响

以福建野生金线莲的顶芽、侧芽或休眠芽为材料快速繁殖，以MS为基本培养基，附加不同的激素和不同浓度配比，结果表明，当细胞分裂素6-苄基嘌呤(BA)1.5mg/L，生长素吲哚丁酸(IBA)0.6mg/L，再附加玉米素(ZT)0.15mg/L时，对丛芽的形成和生长达最佳效果。以快速繁殖的丛芽作为外植体，切取单芽或丛芽接种生根培养基上，40天后，可生根形成幼芽。

5、金线莲苗的继代培养

金线莲(Anoectochilus roxburghii)材料为组织培养获得的无菌苗，其继代培养为：将金线莲苗转入有培养基的三角瓶中，培养基组成为1/2MS(主要指大量和微量元素)，200g/L马铃薯提取液+25g/L蔗糖，琼脂9g/L，pH5.8。121℃高压灭菌30分钟。每瓶接3株苗，培养温度24℃，每日光照10小时，光强为100Lx。培养至茎粗0.15厘米，株高6厘米以上，具有4片叶，2-3条根长1厘米的壮苗(40天后)即可进行栽培。

6、石斛小菇真菌与金线莲幼苗共生栽培

(1)金线莲栽培基质：泥炭土∶砂子∶蛭石(4∶1∶2)；

(2)栽培方法：栽培工具为15厘米高的不锈钢托盘，立体栽培；在其容器的基部平铺一层2-3厘米厚的基质，其上株行距各5-8厘米栽培一株或2-3株一丛的金线莲苗，栽前每一株或一丛苗根的基部放置少量粉碎至0.5-1厘米大小的湿栎树(山毛榉科Fagaceae)树叶，其上再放以上备好的液体石斛小菇真菌2ml，使金线莲的根与菌接触，用栽培基质将苗埋好，覆盖基质厚度视金线莲幼苗的高度而定，一般2-3厘米厚。栽后浇放置至室温的水。

(3)栽培条件：塑料薄膜温室，环境温度为18-25℃，光照量为正常日光量的1/3，最忌夏秋中午前后的直射光，栽培地需架设遮阳网。金线莲生长需较高的空气湿度，土壤不宜积水。其空气温度夏天应控制在25℃以下，冬天应控制在18℃以上。每天光照11h，光照量为正常日光量的1/3；避免直射光；照度2000Lx。

(4)金线莲的收获：栽后5个月收获，收获时即可剪取地上部分，也可一次性连根取出洗净栽培基质。阴干或60℃以下烘干。

实施例二：

本实施例操作条件基本同实施例一，不同之处是：

1、本实施例所用的菌根真菌为石斛小菇、紫萁小菇、兰小菇和开唇兰小菇。

2、采用固体培养基，该培养基的配制：阔叶树锯末∶麦麸∶玉米粒＝1∶1∶0.5，加水量为原料的200％。高压灭菌后分别接入上述4种真菌。待菌丝从培养基顶部长入底部时(1.5个月左右)取出备用。

比较例：

1、菌根真菌对金线莲苗的促生长效果

菌根真菌对金线莲苗的促生长作用：菌根真菌促进金线莲苗增高作用：与未接菌的金线莲苗(对照)相比，所有小菇属这些菌根真菌均有促进金线莲苗增高作用，增高效果在30％-60％；增重在20％-40％。

真菌以菌丝结形式定殖于根表皮细胞及少数皮层最外一层细胞内，植株根浅黄褐色，为兰科植物菌根特征，真菌与金线莲建立了良好的共生关系，并形成了菌根。菌根真菌不但可促进植物生长，同时还可防止植物致病菌对其污染，因为这些真菌常可产生抗生素类物质，为金线莲植株的生长创造一个良好微环境。

2、菌根真菌对金线莲苗有效成分含量的影响

我们根据兰科植物几乎均与真菌形成菌根关系的特点，自1994年开始，从自然生长的金线莲根中分离了多种菌根真菌，经筛选发现有两种真菌对金线莲苗生长有显著促进作用。在此基础上，为确保金线莲药材质量，我们较系统对金线莲与菌根真菌共培养不同时期苗中所含的几种主要化学成分进行了含量分析，结果表明：在栽培方法完全一致的情况下，与不接菌根真菌栽培的金线莲苗(对照)相比，菌根真菌使金线莲苗中总糖含量提高60％，使苗中皂甙含量提高28％；生物碱含量提高1.4倍。菌根真菌对金线莲苗吸收其余8种元素的量均有提高作用。上述结果为在菌根真菌促进金线莲苗生长作用基础上，为今后菌根真菌在金线莲大规模栽培中应用，保证药材质量提供了科学依据。

糖类成分是金线莲药材质量优劣的评价指标之一。不论葡萄糖还是总糖含量，接菌根真菌均明显促进金线莲苗中糖的含量，而且随培养时间的延长呈明显的递增关系，表明菌根真菌不但促进金线莲生长，而且对糖类成分的合成也有正效应。值得注意的是，这两种促生菌根真菌对金线莲苗的次生代谢产物皂甙和生物碱合成也有显著促进作用，有资料报道这两种化合物是金线莲药材的主要成分之一。

从上述比较例可以显然看出，本发明有如下优点：小菇属这4种真菌对金线莲的生长发育均有明显促进作用；采用该项新技术，可大大缩短金线莲的生长周期；提高金线莲产量和有效成分含量。另外，该项技术栽培方法简单、投资少、不施任何肥料和农药，为绿色产品；还为今后金线莲大规模产业化生产提供了科学依据。

Claims

1、一种菌根真菌在金线莲栽培中的应用技术，采用小菇属4种真菌：石斛小菇(Mycena dendrobii)、紫萁小菇(Mycenaosmundicola)、兰小菇(Mycena orchidicola)、开唇兰小菇(Mycena anoectochila)中的任选一种或由其中任意两种或两种以上组成，其主要步骤及条件如下(所述比例均为重量百分比)：

(1)菌根真菌的培养

将上述的菌根真菌自低温保藏的斜面试管菌种活化后，分别转接于PDA平皿中，于25℃恒温培养12-20d，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基进行培养和发酵或接入固体培养基进行培养；

(2)金线莲苗的培养

芽增殖培养基：MS(Murashige and Skoog 1968)培养基，附加6-BA(6-苄基嘌呤1.2mg/L、NAA(萘乙酸)0.6mg/L；

丛芽增殖培养基：MS为基本培养基，附加6-苄基嘌呤(BA)1.5mg/L，吲哚丁酸(IBA)0.6mg/L，玉米素(ZT)0.15mg/L；

(3)菌根真菌与金线莲苗共生栽培

(a)金线莲栽培基质

蛭石∶砂子＝4∶1或森林腐殖土∶砂子＝6∶1或泥炭土∶砂子＝5∶1或泥炭土∶砂子∶蛭石＝4∶1∶2；

(b)金线莲菌根共生栽培

在硬质材料的托盘或盆中立体栽培，其容器的基部平铺一层金线莲栽培基质，其上按株行距栽培一株或一丛的金线莲苗，在苗根的基部放置少量粉碎的湿栎树(山毛榉科Fagaceae)树叶，其上再放以上备好的液体菌根真菌2ml或固体菌根真菌1-2g，使金线莲的根与菌接触，用栽培基质将苗覆盖2-3厘米厚，浇放置至室温的水；

(c)栽培条件

采用塑料薄膜温室、玻璃温室、露天栽培遮阳网遮阴，环境温度为18-25℃，光照量为正常日光量的1/3，照度2000Lx；

(d)金线莲的收获

收获时可剪取地上部分，也可一次性连根取出洗净栽培基质；阴干或60℃以下烘干；

其中所述的菌根真菌的液体培养为：

培养基的配制：葡萄糖2.5％；KH₂PO₄ 0.15％；K₂HPO₄ 0.1％；MgSO₄ 0.15％；天然物：麦麸3％(煮汁)，高压灭菌后分别接入上述真菌；培养条件：培养基pH5.6；三角瓶摇床培养瓶装量50％；转速120转/分钟；23℃培养30天；

发酵罐培养接种量10％，其余参数同上；发酵培养结束时将发酵物用匀浆机打碎菌体及发酵物备用；

其中所述的菌根真菌的固体培养为：

培养基的配制：阔叶树锯末∶麦麸∶玉米粒＝1∶1∶0.5，加水量为原料的150-250％，高压灭菌后分别接入上述真菌，待菌丝从培养基顶部长入底部时取出备用。

2、如权利要求1所述的菌根真菌在金线莲栽培中的应用技术，其特征在于，所述金线莲栽培基质为泥炭土∶砂子∶蛭石＝4∶1∶2或森林腐殖土∶砂子＝6∶1。

3、如权利要求1所述的菌根真菌在金线莲栽培中的应用技术，其特征在于，所述栽培工具为各种硬质材料的托盘或花盆。

4、如权利要求1或3所述的菌根真菌在金线莲栽培中的应用技术，其特征在于，所述硬质材料包括木制、不锈钢、塑料、玻璃或陶瓷。

5、如权利要求1所述的菌根真菌在金线莲栽培中的应用技术，其特征在于，所述容器基部平铺金线莲栽培基质为2-3厘米厚。

6、如权利要求1所述的菌根真菌在金线莲栽培中的应用技术，其特征在于，所述株行距为各5-8厘米栽培一株或2-3株一丛。

7、如权利要求1所述的菌根真菌在金线莲栽培中的应用技术，其特征在于，所述粉碎的湿栎树叶为0.5-1厘米大小。

8、如权利要求1所述的菌根真菌在金线莲栽培中的应用技术，其特征在于，所述室温的水为放置至室温的自来水。

9、如权利要求1所述的菌根真菌在金线莲栽培中的应用技术，其特征在于，所述金线莲的收获为栽培后的4-6个月。