CN108934768B - 黑孢松露接种菌剂及其处理方法和菌根的培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种黑孢松露接种菌剂及其处理方法和菌根的培育方法，黑孢松露接种菌剂的重量配比如下：黑孢松露子实体10‑20份，农林保水剂2–4份，赤霉素0.008–0.015份，氯吡脲0.001–0.002份，蛭石粉50–80份，石灰石粉10–15份。黑孢松露接种菌剂的处理方法，将黑孢松露接种菌剂装入容器内，首先用液氮淋冻2‑5min，放置在‑80℃保存15‑20天，再放置在‑20℃孵育10‑15天，最后放置在4℃孵育25‑40天，然后接种无菌宿主苗。本发明能提高黑孢松露菌根的浸染率及根系活力。
Description
技术领域
本发明属于植物与微生物技术交叉领域，具体涉及一种黑孢松露接种菌剂及其处理方法和菌根的培育方法。
背景技术
松露(Truffle)又称块菌、块菇、无娘果、猪拱菌等，具有独特的香气，经济价值极高，欧洲、北美、东南亚是松露的主要分布区，在欧洲被誉为“厨房中的钻石”和“上帝的食物”。黑孢松露(Tuber melanosporum)原产法国、意大利、西班牙等地，是一种含有雄性酮及其前体的珍贵菌根性食用菌，我国不产或目前没有发现该块菌的分布。黑孢松露国际市场价格非常昂贵，每500g的价格，达到8000-15000元人民币，在国际上声誉极高。
松露菌根苗的成功培育是实现块菌人工栽培的基础，开展具有巨大商业价值的黑孢松露研究开发工作意义重大。在我国块菌宿主研究主要有栓皮栎(Quercusvariabilis)、白栎(Quercus fabri)、槲栎(Quercus aliena)、刺叶高山栎(Quercusspinosa)、青冈(Cyclobalanopsis glauca)、小叶青冈(Cyclobalanopsis myrsinifolia)、云南松(Pinus yunnanensis Franch.)、桤木(Alnuscremastogyne)、槲栎(Quercus alienaBl.)、高山栲(Castanopsis delavayi Franch.)、锥连栎(Quercus franchetii Skan)、美国山核桃(Carya illinoinensis)等植物，而在这些植物中，美国山核桃最具经济价值。美国山核桃，原产美国，壳薄、出仁率达50％-70％，含油率70％-80％，属世界四大经济型坚果之一，适宜生态为年均温15-20℃，降雨量800-1600mm，1月平均温5-10℃，7月平均温20-30℃，无霜期220-330天，土壤肥沃，pH在6-8的地区，野外大田栽培定殖后5年左右开始挂果，10年开始进入盛产期，一般干品100-200kg/亩，国际市场上6-10美元/kg，国内价格在80-150元/kg。
国外开展松露接种美国山核桃，培育菌根苗的研究较早，国内近十几年才开展相关研究，在块菌领域，目前报道的有美国山核桃接种印度块菌培育菌根苗(杨梅等2015)；美国山核桃接种攀枝花块菌培育菌根苗(攀枝花块菌的菌根苗培育方法，201710413848.0)等，研究相对较少。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：黑孢松露菌根苗培育面临菌根侵染率低，菌根苗培育难度大的问题。
本发明的技术方案为：黑孢松露接种菌剂，它的重量配比如下：黑孢松露子实体10-20份，农林保水剂2-4份，赤霉素0.008-0.015份，氯吡脲0.001-0.002份，蛭石粉50-80份，石灰石粉10-15份。
黑孢松露接种菌剂的处理方法，将上述所述的黑孢松露接种菌剂装入容器内，首先用液氮淋冻2-5min，放置在-80℃保存15-20天，再放置在-20℃孵育10-15天，最后放置在4℃孵育25-40天，然后接种无菌宿主苗。
黑孢松露菌根的培育方法，包括如下步骤：
(1)将黑孢松露子实体用双氧水浸泡消毒，蛭石粉、石灰石粉进行高温灭菌；
(2)将步骤(1)处理后的黑孢松露子实体、蛭石粉、石灰石粉粉碎过筛；
(3)将步骤(2)处理后的黑孢松露子实体、蛭石粉、石灰石粉和农林保水剂、赤霉素、氯吡脲按照黑孢松露接种菌剂的配方混合；装入无菌容器，然后进行高温灭菌；
(4)将步骤(3)高温灭菌处理后的容器首先用液氮淋冻2-5min，放置在-80℃保存15-20天，再放置在-20℃孵育10-15天，最后放置在4℃孵育25-40天；
(5)将步骤(4)处理后的黑孢松露接种菌剂接种到无菌宿主幼苗，放置在20-30℃环境中，浇透定根水进行菌根苗的培育。
进一步地：步骤(1)中，双氧水浓度等于或低于3％，浸泡时间为3-5分钟。
进一步地：步骤(1)和步骤(3)中，高温灭菌为121℃，30分钟。
进一步地：步骤(5)中，无菌宿主幼苗苗龄为2-4个月，每株无菌宿主幼苗接种8-15g黑孢松露接种菌剂。
进一步地：步骤(5)中，无菌宿主幼苗通过以下培育：选购新鲜自然晾干、无霉变、无虫蛀、饱满的宿主植物种子，首先用水冲洗干净，然后用赤霉素浸种1-9天，每天翻动1次，以使得水分吸收均匀；接着用高锰酸钾溶液消毒1h-3h；紧接着用灭菌河沙对种子分层沙藏后，表面覆盖2-4cm厚的河沙，最后用次氯酸钠表层消毒，在4℃存放孵育30-45天，当有10％-30％的种子露白时，播种育苗、培育。
进一步地：所述赤霉素浸种的浓度为40-120mg/L，
所述高锰酸钾溶液质量浓度为0.2％-0.8％，所述用灭菌河沙对种子分层沙藏：湿度以手捏成团，松开即散为准，种子分层沙藏为4-6层，种子不重叠，所述次氯酸钠质量浓度为5％-8％。
进一步地：所述播种育苗条件为：开春自然气温回升高于15℃，空气湿度＞50％；所述培育为：放置在消毒铁架或竹架上，离地20cm-100cm隔空培育。
本发明中：无菌宿主幼苗为美国山核桃幼苗、板栗幼苗或华山松幼苗。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、本发明采取的接种菌剂中含促进黑孢松露孢子萌发和促进宿主植物生长的激素物质，对孢子的萌发环境营造和宿主植物的根系快速生长方面效果显著。
2、本发明菌剂采用温度梯度法，对黑孢松露孢子进行催芽萌发，大大的提高了接种宿主植物根系的侵染强度。
3、在宿主无菌苗的培育中，采用严格的培育流程，培育的无菌菌根苗合格率＞90％，根冠比高，培育黑孢松露的美国山核桃菌根侵染率能达到80％-92％。
附图说明
图1为被黑孢松露浸染了的美国山核桃菌根；
具体实施方式
试验例1生长激素影响实验
在该专利方法中，添加的赤霉素和氯吡脲，属于一类植物生长调节剂，关于其促进细胞分裂和扩大、器官形成和蛋白质的合成、提高光合作用效率、增强抗逆性、延缓衰老、在瓜果植物上可促进花芽分化，保花保果，提高坐果率、促进果实膨大等作用已经得到研究证实。恰当的使用对植物而言是正向促进作用。
为证实加入生长激素对于黑孢松露与美国山核桃培育菌根苗的有利影响，设计一组验证实验。
实验组：所述接种菌剂为：黑孢松露子实体10-20份，农林保水剂2-4份，赤霉素0.008-0.015份，氯吡脲0.001-0.002份，蛭石粉50-80份，石灰石粉10-15份。
对比组：所述接种菌剂为：黑孢松露子实体10-20份，农林保水剂2-4份，蛭石粉50-80份，石灰石粉10-15份。用等量超纯水洗并高温灭菌后的河沙代贴赤霉素和氯吡脲。
两组菌剂同时制作，制作完成后，立即开展接种工作，均接种美国山核桃无菌宿主幼苗。接种6个月时对实验组和对比组的菌根苗合成情况进行数据检测分析，测定菌根合成侵染率、根系活力、株高、茎围、根冠比、根总面积、根系直径，取各指标的10个生物学重复的平均值为代表。结果汇总如下表：
表1生长激素对菌根苗的影响
从表1中检测数据可知，采用本发明方法，在菌剂制作时添加赤霉素和氯吡脲后所形成的菌根侵染率相比对照方法高，根系活力更强，移栽菌根苗后的成功率也更高，从株高、茎围、根冠比可知，本发明方法能让宿主植物的生物量得到更多的积累，接种黑孢松露的菌根苗，地下部分生物量的积累相对国内块菌更多，根系的总面积也相对更大，根系平均直径有所增粗。结果表明：添加适量的植物生长激素调节剂类物质，能有效提高松露菌根苗的菌根侵染率，有利于宿主养分积累，壮苗指数增加。
试验例2温度梯度法影响实验
为证实温度梯度法对于黑孢松露与美国山核桃培育菌根苗的影响，根据常规菌种放置条件，即4℃和25℃为对照组，设计两组验证实验，并同时开展三组菌剂的制：
实验组：所述接种菌剂为：黑孢松露子实体10-20份，农林保水剂2–4份，赤霉素0.008–0.015份，氯吡脲0.001–0.002份，蛭石粉50–80份，石灰石粉10–15份。将按照所述菌剂制作方法得到的菌剂用蓝盖试剂瓶装好，进行梯温保藏。首先用液氮淋冻2-5min，放置在-80℃的超低温冰箱中活力保存15-20天，再放置在-20℃的冰箱孵育10-15天，最后放置在4℃的冰箱25-40天，待用。
对比组1：所述接种菌剂为：黑孢松露子实体黑孢松露子实体10-20份，农林保水剂2–4份，赤霉素0.008–0.015份，氯吡脲0.001–0.002份，蛭石粉50–80份，石灰石粉10–15份将按照所述菌剂制作方法得到的菌剂用蓝盖试剂瓶装好，放置在4℃的冰箱中50-75天，待用。
对比组2：所述接种菌剂为：黑孢松露子实体黑孢松露子实体10-20份，农林保水剂2–4份，赤霉素0.008–0.015份，氯吡脲0.001–0.002份，蛭石粉50–80份，石灰石粉10–15份。将按照所述菌剂制作方法得到的菌剂用蓝盖试剂瓶装好，放置在常温(25℃)中50-75天，待用。
在三组菌剂制作并按要求处理后的第60天，同时开展美国山核桃无菌宿主幼苗的接种工作，接种6个月时对实验组和对比组的菌根苗合成情况进行数据检测分析，测定菌根合成侵染率、根系活力、株高、茎围、根冠比、根总面积、根系直径，取各指标的10个生物学重复的平均值为代表。结果汇总如下表：
表2菌剂孵育温度对块菌菌根苗的影响
从上表2测定数据可知，采用本发明方法，在菌剂制作时添加赤霉素和氯吡脲后，将菌剂进行梯温保藏后再接种，所形成的菌根侵染率相比传统方法高，根系活力更强，在进行移栽后菌根苗的成活率更高，从株高、茎围、根冠比可知，本发明方法能让宿主植物的生物量得到更多的积累，接种黑孢松露的菌根苗，地下部分生物量的积累相对国内块菌更多，根系的总面积也相对更大，根系平均直径有所增粗。并且如果将菌剂保存在常温中较长时间，会引发发霉、杂菌感染等病害，会严重影响后续的接种工作。采取梯温保藏的菌剂可以完全避免这种问题的发生，使菌剂的保藏时间延长，保证后续接种工作的顺利进行。
实施例1用本发明方法开展美国山核桃菌根苗的培育，具体如下：
1、黑孢松露接种菌剂的制备和孵育保藏
黑孢松露接种菌剂的制备，是按照质量份数参照黑孢松露子实体的质量配制，制作完成的菌剂先放置在-80℃超低温冰箱活力保存，再放置在-20℃冰箱孵育，最后放置在4℃的冰箱孵育，促使块菌孢子萌发。
a.种属鉴定、消毒和灭菌。在黑孢松露充分成熟的季节，选购个大、香气浓郁、成熟度非常高的新鲜块菌子实体，经过光学显微镜观察孢子的成熟度，通过DNA分子鉴定技术，鉴定100％为黑孢松露，然后用双氧水，浸泡3分钟，进行表面消毒。菌剂合成材料蛭石粉、石灰石粉用聚乙烯口袋装好，进行湿热灭菌。
所述双氧水为：浓度等于3％。
所述湿热灭菌为：高压蒸汽灭菌锅121℃，保持30分钟。
b.粉碎。准备粉碎机，其不锈钢上盖下体粉碎室和配套筛网，用浓度等于3％的双氧水进行消毒3分钟，随后将a处理后的黑孢松露子实体、蛭石粉、石灰石粉，粉碎过筛。
所述筛网为30目，粉碎粒径为≤0.6mm。所得黑孢松露子实体、蛭石粉、石灰石粉，在无菌袋中分类分开存放备用。
c.配制。按照质量份数，参照黑孢松露子实体的质量配制接种菌剂，配制完成后，用无菌搅拌机充分混匀，分装在带盖子的无菌蓝盖试剂瓶中，盖紧瓶盖。
所述接种菌剂为：黑孢松露子实体10份，农林保水剂2份，赤霉素0.008份，氯吡脲0.001份，蛭石粉50份，石灰石粉15份。
所述分装带盖子的无菌蓝盖试剂瓶为：经过121℃，30min湿热灭菌的棕色或透明蜀牛高硼硅丝口蓝盖试剂瓶，容积为200-500ml，菌剂不宜装得过满。
d.梯温保藏。将c分装得到的蓝盖试剂瓶装菌剂，首先用液氮淋冻2min，放置在-80℃的超低温冰箱中活力保存15天，再放置在-20℃的冰箱孵育10天，最后放置在4℃的冰箱30天，然后用于接种块菌无菌宿主苗。
2、无菌宿主植物苗的培育及菌根苗的接种培养
培育美国山核桃无菌宿主植物，开展菌根苗的接种培育、检测。
e.宿主无菌苗的培育。选购新鲜自然晾干、无霉变、无虫蛀、个头大、千粒重14.6kg的美国山核桃植物种子，首先用自来水冲洗干净，然后用赤霉素浸种7-9天，每天翻动1次，以使得水分吸收均匀；用高锰酸钾溶液消毒2h；用灭菌河沙对种子分层沙藏后，表面覆盖3cm厚的河沙，最后用次氯酸钠表层消毒，在4℃存放孵育30天，当有10％-30％的种子“露白”时，播种育苗、培育。
所述赤霉素浓度为：100mg/L。
所述高锰酸钾溶液浓度为：0.6％。
所述灭菌河沙：湿度以手捏成团，松开即散为准；种子分层沙藏为4-6层，种子不重叠；
所述次氯酸钠浓度为：5％。
所述育苗条件为：开春自然气温回升高于15℃，空气湿度＞50％。
所述培育为：放置在消毒铁架或竹架上，离地80cm隔空培育。
f.移栽、接种。将e得到的宿主植物无菌苗，挑选长势良好、无病变、长势相当的用于移栽并接种，选用基质没有被其它竞争性杂菌侵染，接种完毕后，放置在20-30℃的环境中，浇透定根水，后续进行菌根苗的培育，并注意防止高温伤害。
所述移栽苗为：苗龄3月。
所述接种为：将d在孵育达到要求后的蓝盖试剂瓶装菌剂，用无菌锄头，挖取10g，块菌有效接种量＜1.0g，放置在移栽宿主植物无菌苗的根部。
所述浇透定根水为：根据移栽容器的大小，浇适量地下水，以栽培基质土壤完全浸水而不滴下为宜。
所述高温伤害为：菌根苗培育环境温度高于35℃，对菌根的形成不利的高温条件。
结果：接种2个月，在Leica体式显微镜下，可以看见菌根初步形成，整个侵染根呈透明状，末端透明、淡黄色，3个月及以后，菌根完全形成，呈淡黄色至黄褐色，单枝棒状或珊瑚网状，有白色的尖端，菌根压片可见哈蒂氏网，存在大量的发散菌丝，菌丝排列紧密，挑取侵染菌根进行DNA分子鉴定，确认与黑孢松露DNA相似度为100％。接种12个月时，随机挑选10株，采用Leica体视镜、WinRHIZO根系分析系统等测定指标数据。
实施例2用本发明方法开展板栗菌根苗的培育，具体如下：
1、黑孢松露接种菌剂的制备和梯温保藏
黑孢松露接种菌剂的制备，是按照质量份数参照黑孢松露子实体的质量配制，制作完成的菌剂先放置在-80℃超低温冰箱活力保存，再放置在-20℃冰箱孵育，最后放置在4℃的冰箱孵育，促使块菌孢子萌发。
a.种属鉴定、消毒和灭菌。在黑孢松露充分成熟的季节，选购个大、香气浓郁、成熟度非常高的新鲜块菌子实体，经过光学显微镜观察孢子的成熟度，通过DNA分子鉴定技术，鉴定100％为黑孢松露，然后用双氧水，浸泡3分钟，进行表面消毒。菌剂合成材料蛭石粉、石灰石粉用聚乙烯口袋装好，进行湿热灭菌。
所述双氧水为：浓度等于3％。
所述湿热灭菌为：高压蒸汽灭菌锅121℃，保持30分钟。
b.粉碎。准备粉碎机，其不锈钢上盖下体粉碎室和配套筛网，用浓度等于3％的双氧水进行消毒3分钟，随后将a处理后的黑孢松露子实体、蛭石粉、石灰石粉，粉碎过筛。
所述筛网为30目，粉碎粒径为≤0.6mm。所得黑孢松露子实体、蛭石粉、石灰石粉，在无菌袋中分类分开存放备用。
c.配制。按照质量份数，参照黑孢松露子实体的质量配制接种菌剂，配制完成后，用无菌搅拌机充分混匀，分装在带盖子的无菌蓝盖试剂瓶中，盖紧瓶盖。
所述接种菌剂为：黑孢松露子实体20份，农林保水剂4份，赤霉素0.015份，氯吡脲0.002份，蛭石粉80份，石灰石粉10份。
所述分装带盖子的无菌蓝盖试剂瓶为：经过121℃，30min湿热灭菌的棕色或透明蜀牛高硼硅丝口蓝盖试剂瓶，容积为200-500ml，菌剂不宜装得过满。
d.梯温保藏。将c分装得到的蓝盖试剂瓶装菌剂，首先用液氮淋冻5min，放置在-80℃的超低温冰箱中活力保存20天，再放置在-20℃的冰箱孵育15天，最后放置在4℃的冰箱25天，然后用于接种块菌无菌宿主苗。
2、无菌宿主植物苗的培育及菌根苗的接种培养
培育板栗无菌宿主植物，开展菌根苗的接种培育、检测。
e.宿主无菌苗的培育。选购新鲜自然晾干或新鲜、无霉变、无虫蛀、个头大的板栗植物种子，首先用自来水冲洗干净，然后用赤霉素浸种3天，每天翻动1次，以使得水分吸收均匀；用高锰酸钾溶液消毒2h；用灭菌河沙对种子分层沙藏后，表面覆盖2-4cm厚的河沙，最后用次氯酸钠表层消毒，在4℃存放孵育30天，当有10％-30％的种子“露白”时，播种育苗、培育。
所述赤霉素浓度为：100mg/L。
所述高锰酸钾溶液浓度为：0.6％。
所述灭菌河沙：湿度以手捏成团，松开即散为准；种子分层沙藏为4-6层，种子不重叠；
所述次氯酸钠浓度为：5％。
所述育苗条件为：开春自然气温回升高于15℃，空气湿度＞50％。
所述培育为：放置在消毒铁架或竹架上，离地80cm隔空培育。
f.移栽、接种。将e得到的宿主植物无菌苗，挑选长势良好、无病变、长势相当的用于移栽并接种，选用基质没有被其它竞争性杂菌侵染，接种完毕后，放置在20-30℃的环境中，浇透定根水，后续进行菌根苗的培育，并注意防止高温伤害。
所述移栽苗为：苗龄3月。
所述接种为：将d在孵育达到要求后的蓝盖试剂瓶装菌剂，用无菌锄头，挖取10g，块菌有效接种量＜1.0g，放置在移栽宿主植物无菌苗的根部。
所述浇透定根水为：根据移栽容器的大小，浇适量地下水，以栽培基质土壤完全浸水而不滴下为宜。
所述高温伤害为：菌根苗培育环境温度高于35℃，对菌根的形成不利的高温条件。
结果：接种2个月，在Leica体式显微镜下，可以看见菌根初步形成，整个侵染根呈透明状，末端透明、淡黄色，3个月及以后，菌根完全形成，呈淡黄色至黄褐色，单枝棒状或珊瑚网状，有白色的尖端，菌根压片可见哈蒂氏网，存在大量的发散菌丝，菌丝排列紧密，挑取侵染菌根进行DNA分子鉴定，确认与黑孢松露DNA相似度为100％。接种12个月时，随机挑选10株，采用Leica体视镜、WinRHIZO根系分析系统等测定指标数据。
实施例3用本发明方法开展华山松菌根苗的培育，具体如下：
1、黑孢松露接种菌剂的制备和孵育保藏
黑孢松露接种菌剂的制备，是按照质量份数参照黑孢松露子实体的质量配制，制作完成的菌剂先放置在-80℃超低温冰箱活力保存，再放置在-20℃冰箱孵育，最后放置在4℃的冰箱孵育，促使块菌孢子萌发。
a.种属鉴定、消毒和灭菌。在黑孢松露充分成熟的季节，选购个大、香气浓郁、成熟度非常高的新鲜块菌子实体，经过光学显微镜观察孢子的成熟度，通过DNA分子鉴定技术，鉴定100％为黑孢松露，然后用双氧水，浸泡3分钟，进行表面消毒。菌剂合成材料蛭石粉、石灰石粉用聚乙烯口袋装好，进行湿热灭菌。
所述双氧水为：浓度等于3％。
所述湿热灭菌为：高压蒸汽灭菌锅121℃，保持30分钟。
b.粉碎。准备粉碎机，其不锈钢上盖下体粉碎室和配套筛网，用浓度等于3％的双氧水进行消毒3分钟，随后将a处理后的黑孢松露子实体、蛭石粉、石灰石粉，粉碎过筛。
所述筛网为30目，粉碎粒径为≤0.6mm。所得黑孢松露子实体、蛭石粉、石灰石粉，在无菌袋中分类分开存放备用。
c.配制。按照质量份数，参照黑孢松露子实体的质量配制接种菌剂，配制完成后，用无菌搅拌机充分混匀，分装在带盖子的无菌蓝盖试剂瓶中，盖紧瓶盖。
所述接种菌剂为：黑孢松露子实体15份，农林保水剂3份，赤霉素0.011份，氯吡脲0.0015份，蛭石粉60份，石灰石粉12份。
所述分装带盖子的无菌蓝盖试剂瓶为：经过121℃，30min湿热灭菌的棕色或透明蜀牛高硼硅丝口蓝盖试剂瓶，容积为200-500ml，菌剂不宜装得过满。
d.梯温保藏。将c分装得到的蓝盖试剂瓶装菌剂，首先用液氮淋冻3min，放置在-80℃的超低温冰箱中活力保存18天，再放置在-20℃的冰箱孵育12天，最后放置在4℃的冰箱40天，然后用于接种块菌无菌宿主苗。
2、无菌宿主植物苗的培育及菌根苗的接种培养
培育华山松无菌宿主植物，开展菌根苗的接种培育、检测。
e.宿主无菌苗的培育。选购新鲜自然晾干或新鲜、无霉变、无虫蛀、个头大的华山松植物种子，首先用自来水冲洗干净，然后用赤霉素浸种3天，每天翻动1次，以使得水分吸收均匀；用高锰酸钾溶液消毒2h；用灭菌河沙对种子分层沙藏后，表面覆盖2-4cm厚的河沙，最后用次氯酸钠表层消毒，在4℃存放孵育30天，当有10％-30％的种子“露白”时，播种育苗、培育。
所述赤霉素浓度为：100mg/L。
所述高锰酸钾溶液浓度为：0.6％。
所述灭菌河沙：湿度以手捏成团，松开即散为准；种子分层沙藏为4-6层，种子不重叠；
所述次氯酸钠浓度为：5％。
所述育苗条件为：开春自然气温回升高于15℃，空气湿度＞50％。
所述培育为：放置在消毒铁架或竹架上，离地80cm隔空培育。
f.移栽、接种。将e得到的宿主植物无菌苗，挑选长势良好、无病变、长势相当的用于移栽并接种，选用基质没有被其它竞争性杂菌侵染，接种完毕后，放置在20-30℃的环境中，浇透定根水，后续进行菌根苗的培育，并注意防止高温伤害。
所述移栽苗为：苗龄3月。
所述接种为：将d在孵育达到要求后的蓝盖试剂瓶装菌剂，用无菌锄头，挖取10g，块菌有效接种量＜1.0g，放置在移栽宿主植物无菌苗的根部。
所述浇透定根水为：根据移栽容器的大小，浇适量地下水，以栽培基质土壤完全浸水而不滴下为宜。
所述高温伤害为：菌根苗培育环境温度高于35℃，对菌根的形成不利的高温条件。
结果：接种2个月，在Leica体式显微镜下，可以看见菌根初步形成，整个侵染根呈透明状，末端透明、淡黄色，3个月及以后，菌根完全形成，呈淡黄色至黄褐色，单枝棒状或二叉分支状，有白色的尖端，菌根压片可见哈蒂氏网，存在大量的发散菌丝，菌丝排列紧密，挑取侵染菌根进行DNA分子鉴定，确认与黑孢松露DNA相似度为100％。接种12个月时，随机挑选10株，采用Leica体视镜、WinRHIZO根系分析系统等对指标的数据进行测定。
对比例1培育无菌苗，不开展接种工作。对无菌苗指标进行检测，培育流程如下：
培育美国山核桃无菌宿主植物，开展菌根苗的接种培育、检测。
a.宿主无菌苗的培育。选购新鲜自然晾干或新鲜、无霉变、无虫蛀、个头大的美国山核桃植物种子，首先用自来水冲洗干净，然后用赤霉素浸种3天，每天翻动1次，以使得水分吸收均匀；用高锰酸钾溶液消毒2h；用灭菌河沙对种子分层沙藏后，表面覆盖2-4cm厚的河沙，最后用次氯酸钠表层消毒，在4℃存放孵育30天，当有10％-30％的种子“露白”时，播种育苗、培育。
所述赤霉素浓度为：100mg/L。
所述高锰酸钾溶液浓度为：0.6％。
所述灭菌河沙：湿度以手捏成团，松开即散为准；种子分层沙藏为4-6层，种子不重叠；
所述次氯酸钠浓度为：5％。
所述育苗条件为：开春自然气温回升高于15℃，空气湿度＞50％。
所述培育为：放置在消毒铁架或竹架上，离地80cm隔空培育。
b.移栽、接种。将e得到的宿主植物无菌苗，挑选长势良好、无病变、长势相当的用于移栽并接种，选用基质没有被其它竞争性杂菌侵染，接种完毕后，放置在20-30℃的环境中，浇透定根水，后续进行菌根苗的培育，并注意防止高温伤害。
所述移栽苗为：苗龄3月。
所述接种为：将d在孵育达到要求后的蓝盖试剂瓶装菌剂，用无菌锄头，挖取10g，块菌有效接种量＜1.0g，放置在移栽宿主植物无菌苗的根部。
所述浇透定根水为：根据移栽容器的大小，浇适量地下水，以栽培基质土壤完全浸水而不滴下为宜。
结果：美国山核桃实生苗生长15个月时，采用Leica体视镜、WinRHIZO根系分析系统等对美国山核桃根系进行观察，随机挑选10株，测定相关生物指标。
对比例2实施专利CN201510847702.8的技术方法
按照专利申请号为CN201510847702.8中，所述的发明方法严格开展印度块菌菌剂的制作并按专利方法接种板栗，最后对指标进行测定。
对比例3实施专利CN200810058447.9的技术方法
按照专利申请号为CN200810058447.9中，所述的发明方法严格开展印度块菌菌剂的制作并按专利方法接种华山松，最后对指标进行测定。
对实施例和对比例的菌根苗合成情况进行数据检测分析，测定菌根合成侵染率、根系活力、株高、茎围、根冠比、根总面积、根系直径，取各指标的10个生物学重复的平均值为代表。结果汇总如下表3：
表3实施例和对比例的数据分析比对表
由上述表3实施结果可知，采用本发明方法，所形成的菌根侵染率相比传统方法高，根系活力更强，说明移栽菌根苗的成功率更高，从株高、茎围、根冠比可知，本发明方法用于块菌菌根苗的培育能显著提高宿主植物的生物量积累，提高壮苗指数。接种黑孢松露的菌根苗，有利于宿主植物地下部分生物量的积累，根系的总面积相对更大，根系平均直径有所增粗，培育出的黑孢松露菌根苗侵染率高。从实施例1与对比例1对比可知，接种黑孢松露后，美国山核桃的根系直径增粗约41.82％，根总面积增大约13.25％，根系活力提高了139.40％，株高、茎围增加了近25％，从上述3个实施例和3个对比例综合比较分析，可以得知，本发明黑孢松露菌根苗培育方法，能得到理想的黑孢松露菌根苗，且培育出来的不同宿主的黑孢块菌菌根苗侵染率差距不大，相对稳定。
Claims (8)
1.黑孢松露菌根的培育方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）将黑孢松露子实体用双氧水浸泡消毒，蛭石粉、石灰石粉进行高温灭菌；
（2）将步骤（1）处理后的黑孢松露子实体、蛭石粉、石灰石粉粉碎过筛；
（3）将步骤（2）处理后的黑孢松露子实体、蛭石粉、石灰石粉和农林保水剂、赤霉素、氯吡脲按照重量配比黑孢松露子实体10-20份，农林保水剂2-4份，赤霉素0.008-0.015 份，氯吡脲0.001-0.002 份，蛭石粉50-80份，石灰石粉10-15份的配方混合，得到黑孢松露接种菌剂；装入无菌容器，然后进行高温灭菌；
（4）将步骤（3）高温灭菌处理后的容器首先用液氮淋冻2-5min，放置在-80 ℃保存15-20天，再放置在- 20 ℃孵育10-15天，最后放置在4 ℃孵育25-40天；
（5）将步骤（4）处理后的黑孢松露接种菌剂接种到无菌宿主幼苗，放置在20-30℃环境中，浇透定根水进行菌根苗的培育。
2.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于：步骤（1）中，双氧水浓度等于或低于3%，浸泡时间为3-5分钟。
3.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于：步骤（1）和步骤（3）中，高温灭菌为121℃，30分钟。
4.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于：步骤（5）中，无菌宿主幼苗苗龄为2-4个月，每株无菌宿主幼苗接种8-15g黑孢松露接种菌剂。
5.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于：步骤（5）中，无菌宿主幼苗通过以下培育：选购新鲜自然晾干、无霉变、无虫蛀、饱满的宿主植物种子，首先用水冲洗干净，然后用赤霉素浸种1-9天，每天翻动1次，以使得水分吸收均匀；接着用高锰酸钾溶液消毒1 h-3 h；紧接着用灭菌河沙对种子分层沙藏后，表面覆盖2-4 cm厚的河沙，最后用次氯酸钠表层消毒，在4 ℃存放孵育30-45天，当有10 %-30 %的种子露白时，播种育苗、培育。
6.根据权利要求5所述的培育方法，其特征在于：所述赤霉素浸种的浓度为40-120 mg/L，
所述高锰酸钾溶液质量浓度为0.2 %-0.8 %，所述用灭菌河沙对种子分层沙藏：湿度以手捏成团，松开即散为准，种子分层沙藏为4-6层，种子不重叠，所述次氯酸钠质量浓度为5% - 8 %。
7.根据权利要求5所述的培育方法，其特征在于：所述播种育苗条件为：开春自然气温回升高于15 ℃，空气湿度＞ 50%；所述培育为：放置在消毒铁架或竹架上，离地20 cm-100cm隔空培育。
8.根据权利要求1所述的培育方法，其特征在于：无菌宿主幼苗为美国山核桃幼苗、板栗幼苗或华山松幼苗。
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