CN105104361A - 一种油茶花粉超低温保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种油茶花粉超低温保存方法，包括如下步骤：1、脱水：将收集的油茶花粉放在恒温箱内干燥；2、预冻：油茶花粉经步骤1处理后预冻；3、冷冻：油茶花粉经步骤2后投放液氮中保存；4、解冻：油茶花粉经步骤3液氮保存后解冻。本发明的有益效果为：本发明的油茶花粉超低温保存方法能有效抑制花粉衰老，降低其呼吸强度和酶活性，延长油茶花粉寿命，克服油茶种间因花期不遇而造成的杂交育种困难，油茶花粉在液氮中保存半年后，活力仍高达47.05％。干燥时间短，保证花粉活力，利于保存。烘干干燥法投入成本、预冻、解冻成本投入也较低。简单易操作，能有效保证油茶花粉进行杂交的活力，对油茶杂交育种及生产实践具有重要的推广价值。

Description

一种油茶花粉超低温保存方法
技术领域
本发明涉及植物花粉的保存方法，具体涉及一种油茶花粉超低温保存方法。
背景技术
油茶(Camelliaoleifera)属山茶科(Theaceae)山茶属(Camellia)植物，常绿灌木或小乔木，适应性强，耐贫瘠，抗干旱，是我国特有的木本油料树种之一，也是改造红壤的主要树种，被西方誉为“东方橄榄树”。油茶已被我国列为重点研发的食用油料树种。茶油色清味香，营养丰富，且含天然维生素A和E，耐贮藏，易被人体吸收，能预防和治疗高血压、心血管疾病，是绿色保健食用油。综上，油茶兼具较高的生态和经济价值。
花粉作为油茶种质的主要形式之一，携带油茶全部基因，具有遗传多样性，是油茶种质保存以及杂交育种的重要途径。油茶属于自交不亲和植物，种间花期不遇，自然条件下油茶花粉寿命短，这不利于油茶种质资源研究及其杂交育种，同时也给油茶遗传性状研究带来许多困难。因此，有必要对油茶花粉进行进一步深入研究。
进行花粉保存研究，是为了在不破坏种质资源的前提下保持花粉活力，延长其寿命，并以此来克服杂交育种中的时空限制，提高育种效率，有利于新品种的培育，同时为不同地区种质资源的交换提供了便利。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种油茶花粉超低温保存方法。
本发明的目的是通过如下技术方案来完成的。这种油茶花粉超低温保存方法，该方法包括如下步骤：
(1)脱水：将收集的油茶花粉放在30℃恒温箱内干燥至含水量为11％～20％；
(2)预冻：油茶花粉经步骤(1)处理后，于-80℃～4℃预冻；
(3)冷冻：油茶花粉经步骤(2)后投放液氮中保存；
(4)解冻：油茶花粉经步骤(3)液氮保存后，于-80℃～38℃解冻。
作为优选，将经脱水处理的油茶花粉选择26℃或4℃预冻1h，再投入液氮中保存。
作为优选，将经脱水处理的油茶花粉于4℃预冻1h，转入-20℃预冻1h，再置于-80℃预冻1h，再投入液氮中保存。
作为优选，所述步骤(4)中的解冻方法为：于-80℃复苏1h，转入-20℃冷冻1h，再置于4℃冷藏1h。
作为优选，所述步骤(4)中的解冻方法为：11℃室温恒温解冻30min。
作为优选，所述步骤(4)中的解冻方法为：38℃水浴解冻3min。
作为优选，所述步骤(4)中的解冻方法为：4℃恒温解冻30min。
本发明的有益效果为：本发明所述的油茶花粉超低温保存方法能有效抑制花粉衰老，降低其呼吸强度和酶活性，延长油茶花粉寿命，克服油茶种间因花期不遇而造成的杂交育种困难，油茶花粉在液氮中保存半年后，活力仍高达47.05％。本发明所述的油茶花粉超低温保存方法，干燥方法为烘干干燥法，干燥时间短，保证花粉活力，利于保存。烘干干燥法投入成本、预冻、解冻成本投入也较低。本发明所述的油茶花粉超低温保存方法简单易操作，能有效保证油茶花粉进行杂交的活力，对油茶杂交育种及生产实践具有重要的推广价值。
附图说明
图1是本发明中预冻及解冻方式对油茶花粉超低温保存的影响示意图。
分别表示预冻及解冻方式对油茶花粉超低温保存的影响，其中，预冻方式横坐标中1代表不预冻，2代表-26℃预冻1h,3代表4℃预冻1h,4表示4℃(1h)→-26℃(1h)→-80℃(1h)逐级降温预冻。解冻方式横坐标中1表示38℃温水浴解冻3min,2表示11℃室温解冻30min,3表示-80℃(1h)→-26℃(1h)→4℃(1h)逐级升温解冻，4代表4℃恒温解冻30min。
图2是本发明中“长林4号”油茶花粉不同含水量保存半年后萌发率；
图3是本发明中“赣5”油茶花粉不同含水量保存半年后萌发率；
图4是本发明中“91号”油茶花粉不同含水量保存半年后萌发率。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明作进一步阐述，实施例将帮助更好地理解本发明，但本发明并不仅仅局限于下述实施例。
实施例1：一种油茶花粉超低温保存方法，包括如下步骤：
步骤(1)脱水处理：将恒温箱调制30℃恒温，将收集的500mg“长林4号”油茶新鲜花粉均匀平铺在硫酸纸上，放入恒温箱内，烘干干燥至含水量13.48％；
步骤(2)预冻处理：将脱水后的“长林4号”油茶花粉，分别经过-26℃预冻1h、4℃预冻1h、4℃(1h)→-26℃(1h)→-80℃(1h)逐级降温预冻以及不预冻，投入液氮中保存；
步骤(3)解冻处理：“长林4号”油茶花粉液氮保存30天后，38温℃水浴解冻3min，测花粉生活力，确定“长林4号”油茶花粉的最佳预冻方法为-26℃预冻1h。
表1“长林4号”油茶花粉经不同预冻方式预冻，超低温保存30天后花粉萌发率。
预冻方式 不预冻 -26℃预冻1h 4℃预冻1h 逐级降温预冻
萌发率 33.06 47.04 40.19 35.84
标准差 2.16 2.46 3.59 2.88
实施例2：
步骤(1)脱水处理：将恒温箱调制30℃恒温，将收集的500mg“赣5”油茶新鲜花粉均匀平铺在硫酸纸上，放入恒温箱内，烘干干燥至含水量于14.17％；
步骤(2)预冻处理：将脱水后的“赣5”油茶花粉，分别经过-26℃预冻1h、4℃预冻1h、4℃(1h)→-26℃(1h)→-80℃(1h)逐级降温预冻以及不预冻，投入液氮中保存；
步骤(3)解冻处理：“赣5”油茶花粉液氮保存30天后，38℃水浴解冻3min，测花粉生活力，确定“赣5”油茶花粉的最佳预冻方法为-26℃预冻1h。
表2“赣5”油茶花粉经不同预冻方式预冻，超低温保存30天后花粉萌发率。
预冻方式 不预冻 -26℃预冻1h 4℃预冻1h 逐级降温预冻
萌发率 29.03 49.34 41.71 29.92
标准差 3.19 3.74 2.39 4.16
实施例3：
步骤(1)脱水处理：将恒温箱调制30℃恒温，将收集的500mg“91号”油茶新鲜花粉均匀平铺在硫酸纸上，放入恒温箱内，烘干干燥至含水量于15.52％；
步骤(2)预冻处理：将脱水的“91号”油茶花粉，分别经过-26℃预冻1h、4℃预冻1h、4℃(1h)→-26℃(1h)→-80℃(1h)逐级降温预冻以及不预冻，投入液氮中保存；
步骤(3)解冻处理：“91号”油茶花粉液氮保存30天后，38℃水浴解冻3min，测花粉生活力，确定“91号”油茶花粉的最佳预冻方法为-26℃预冻1h。
表3“91号“油茶花粉经不同预冻方式预冻，超低温保存30天后花粉萌发率。
预冻方式 不预冻 -26℃预冻1h 4℃预冻1h 逐级降温预冻
萌发率 31.06 47.41 38.05 33.84
标准差 4.23 2.47 2.49 1.53
实施例4
步骤(1)脱水处理：将恒温箱调制30℃恒温，将收集的500mg“长林4号”油茶新鲜花粉均匀平铺在硫酸纸上，放入恒温箱内，烘干干燥至含水量于13.48％；
步骤(2)冷冻处理：将干燥的“长林4号”油茶花粉，经-26℃预冻1h后，投入液氮中保存；步骤(3)解冻处理：“长林4号”油茶花粉液氮保存40天后，分别以38℃温水浴解冻3min、4℃恒温解冻30min、室温11℃解冻30min、-80℃(1h)→-26℃(1h)→4℃(1h)逐级升温解冻，测花粉生活力，确定“长林4号”最佳解冻方法为38℃温水浴解冻3min、4℃恒温解冻30min或者11℃解冻30min。
表4“长林4号”保存40天后不同解冻方式解冻后萌发率
实施例5
步骤(1)脱水处理：将恒温箱调制30℃恒温，将收集的500mg“赣5”油茶新鲜花粉均匀平铺在硫酸纸上，放入恒温箱内，烘干干燥至含水量于14.17％；
步骤(2)冷冻处理：将干燥的“赣5”油茶花粉，经-26℃预冻1h后，投入液氮中保存；
步骤(3)解冻处理：“赣5”油茶花粉液氮保存40天后，分别以38℃温水浴解冻3min、4℃恒温解冻30min、室温11℃解冻30min、-80℃(1h)→-26℃(1h)→4℃(1h)逐级升温解冻，测花粉生活力，确定“赣5”最佳解冻方法为38℃温水浴解冻3min、4℃恒温解冻30min或者11℃解冻30min。
表5“赣5”保存40天后不同解冻方式解冻后萌发率
实施例6
步骤(1)脱水处理：将恒温箱调制30℃恒温，将收集的500mg“91号”油茶新鲜花粉均匀平铺在硫酸纸上，放入恒温箱内，烘干干燥至含水量于15.52％；
步骤(2)冷冻处理：将干燥的“91号”油茶花粉，经-26℃预冻1h后，投入液氮中保存；
步骤(3)解冻处理：“91号”油茶花粉液氮保存40天后，分别以38℃温水浴解冻3min、4℃恒温解冻30min、室温11℃解冻30min、-80℃(1h)→-26℃(1h)→4℃(1h)逐级升温解冻，测花粉生活力，确定“91号”最佳解冻方法为38℃温水浴解冻3min和4℃解冻30min。
表6“91号”保存40天后不同解冻方式解冻后萌发率
实施例7
步骤(1)脱水处理：将恒温箱调制30℃恒温，分别将收集的1g“长林4号”油茶新鲜花粉不作烘干处理，以及均匀平铺于硫酸纸上，放入恒温箱内，烘干脱水至不同含水量；
步骤(2)将未经脱水及脱水后的“长林4号”油茶花粉分别置于-26℃预冻1h后，投放液氮中保存半年；
步骤(3)“长林4号”油茶花粉经液氮保存半年后，采用38℃温水浴化冻3min,测定萌发率，确定“长林4号”油茶花粉超低温保存的适宜含水率为12.79-20.75％。
实施例8
步骤(1)脱水处理：将恒温箱调制30℃恒温，分别将收集的1g“赣5”油茶新鲜花粉不作脱水处理，以及均匀平铺于硫酸纸上，放入恒温箱内，烘干脱水至不同含水量；
步骤(2)将未脱水的及脱水后的“赣5”油茶花粉分别置于-26℃预冻1h后，投放液氮中保存半年；
步骤(3)“赣5”油茶花粉经液氮保存半年后，采用38℃温水浴化冻3min,测定萌发率，确定“长林4号”油茶花粉超低温保存的适宜含水率为11.65-17.15％。
实施例9
步骤(1)脱水处理：将恒温箱调制30℃恒温，分别将收集的1g“91号”油茶新鲜花粉不作烘干处理，以及均匀平铺于硫酸纸上，放入恒温箱内，烘干脱水至不同含水量；
步骤(2)将未经脱水及脱水后的“91号”油茶花粉分别置于-26℃预冻1h后，投放液氮中保存半年；
步骤(3)“91号”油茶花粉经液氮保存半年后，采用38℃温水浴化冻3min,测定萌发率，确定“长林4号”油茶花粉超低温保存的适宜含水率为12.51-20.37％。
本发明的特点：
1、采用本发明所述的油茶超低温保存方法进行花粉保存，能有效阻止花粉衰老，延长花粉寿命，降低其酶活性，保证花粉生活力，克服油茶自交不亲和造成的结实率低及种间花期不遇造成的杂交育种障碍，油茶花粉在液氮超低温中保存至半年时，生活力可高达47.05％。
2、采用本发明所述的油茶花粉超低温保存方法，进行花粉保存，其操作流程简单易行。
3、采用本发明所述的油茶花粉超低温保存方法，其脱水方法为烘干干燥法，干燥时间短，有利于保证花粉的活力。另外，干燥、预冻、解冻过程投入很低。
除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (7)

1.一种油茶花粉超低温保存方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(1)脱水：将收集的油茶花粉放在30℃恒温箱内干燥至含水量为11％～20％；
(2)预冻：油茶花粉经步骤(1)处理后，于-80℃～4℃预冻；
(3)冷冻：油茶花粉经步骤(2)后投放液氮中保存；
(4)解冻：油茶花粉经步骤(3)液氮保存后，于-80℃～38℃解冻。
2.根据权利要求1所述的油茶花粉超低温存方法，其特征在于：将经脱水处理的油茶花粉选择26℃或4℃预冻1h，再投入液氮中保存。
3.根据权利要求1所述的油茶花粉超低温存方法，其特征在于：将经脱水处理的油茶花粉于4℃预冻1h，转入-20℃预冻1h，再置于-80℃预冻1h，再投入液氮中保存。
4.根据权利要求1所述的油茶花粉超低温存方法，其特征在于：所述步骤(4)中的解冻方法为：于-80℃复苏1h，转入-20℃冷冻1h，再置于4℃冷藏1h。
5.根据权利要求1所述的油茶花粉超低温存方法，其特征在于：所述步骤(4)中的解冻方法为：11℃室温恒温解冻30min。
6.根据权利要求1所述的油茶花粉超低温存方法，其特征在于：所述步骤(4)中的解冻方法为：38℃水浴解冻3min。
7.根据权利要求1所述的油茶花粉超低温存方法，其特征在于：所述步骤(4)中的解冻方法为：4℃恒温解冻30min。
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