CN104206378B - 一种柳树花粉超低温保存方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种柳树花粉超低温保存的条件，包括以下步骤：（1）干燥处理；（2）预冻处理；（3）选择解冻方法。本发明所述的柳树花粉超低温保存方法能有效阻止花粉衰老，降低花粉呼吸强度和酶活性，保证花粉生活力，克服柳树花粉因雌雄异株花期不遇而造成的杂交困难，柳树花粉在液氮超低温中保存至300d时，生活力可高达43%。本发明所述的柳树花粉超低温保存方法，干燥方法为快速干燥法，且干燥时间短，也保证了花粉的生活力，有利于保存。且干燥投入成本、预冻、解冻成本投入也较低。本发明所述的柳树花粉超低温保存方法简单易操作，能有效保证柳树花粉进行杂交的生活力，在柳树繁殖生产上具有重要的实践与推广意义。

Description

一种柳树花粉超低温保存方法
技术领域
本发明涉及一种植物花粉保存方法，具体是涉及一种柳树花粉在超低温保存的方法。
背景技术
柳树属于杨柳科(Salicaceae)，是柳属(Salix)和钻天柳属(Chosenia)的通称。平常所说的柳树(Salix L.)主要指柳属所包括的所有树种。柳树属落叶乔木，种类多，生长快，根系发达，易繁殖，适应性强，是防护林、水土保持林、风景林及用材林的重要组成树种，具有较高的生态和经济价值。
花粉作为柳树种质的形式之一，包含了柳树的所有基因类型，具有丰富的遗传多样性，是柳树种质保存以及杂交育种的重要材料。但柳树雌雄异株，花期不遇，且柳树花粉自然条件下寿命短，这给柳树种质研究及其杂交育种工作带来极大的不便，同时也不利于柳树的遗传性状研究。因此，有必要对柳树花粉开展相关研究。虽然柳树花粉采集和贮藏在欧洲柳树繁殖中已有应用，但对其提取和贮藏得方法没有具体描述。花粉保存研究的目的在于在不破坏种质资源的前提下保持花粉生活力，延长其受精能力，并以此来克服杂交育种中的时间和空间的限制，提高育种效率，为地区间乃至国际间的种质交换提供方便；同时可以避免病虫害的传播。例如柳树雌雄异株，且雌雄开花时间不相同，自然育种造成花期不遇，为了克服这一难题，其花粉的保存便具有现实的必要性。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种柳树花粉超低温度保存方法。
本发明是通过以下技术方案来实现的：一种柳树花粉超低温保存方法，包括如下步骤：
（1）干燥：将柳树花粉与干燥剂放入干燥器中干燥2 ~ 4h；
（2）冷冻：柳树花粉经步骤（1）处理后，投入液氮中保存；
（3）解冻：柳树花粉经步骤（2）液氮保存后，于4 ~37℃解冻。
进一步，步骤（1）中所述干燥剂为变色硅胶，干燥剂与柳树花粉质量比为500：1；干燥时间为2 ~ 4h。
步骤（2）将经干燥处理的柳树花粉于4℃冷藏1h后，再转入-25℃冷冻2h后，置于-70℃冷冻24h后，再投入液氮中保存。
有益效果：
1、采用本发明所述的柳树花粉超低温保存方法能有效阻止花粉衰老，降低花粉呼吸强度和酶活性，保证花粉生活力，克服柳树花粉因雌雄异株花期不遇而造成的杂交困难，柳树花粉在液氮超低温中保存至300d时，生活力可高达43%。
2、采用本发明所述的柳树花粉超低温保存方法，操作简单，易进行。
3、采用本发明所述的柳树花粉超低温保存方法，干燥方法为快速干燥法，干燥时间短，也保证了花粉的生活力，有利于保存。且干燥、预冻、解冻成本投入也较低。
综上所述：本发明所述的柳树花粉超低温保存方法简单易操作，能有效保证柳树花粉进行杂交的生活力，在柳树繁殖生产上具有重要的实践与推广意义。
附图说明
图1为解冻方式对柳树花粉萌发率的影响图；图中， 横坐标中CK 代表不解冻，1代表自来水冲洗解冻、2 代表4℃过渡解冻、3 代表25℃恒温解冻、4 代表37℃水浴解冻。
P63表示簸箕柳；P102表示银柳；2333表示蒿柳×毛枝柳；2383表示簸箕柳 × 蒿柳。
图2为柳树花粉超低温保存；图中，P63表示簸箕柳；P102表示银柳；2333表示蒿柳×毛枝柳；2383表示簸箕柳×蒿柳。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：一种柳树花粉超低温保存方法，包括如下步骤：
步骤（1）干燥处理：将500g变色硅胶放于干燥器中，离变色硅胶2cm处放一隔板，再将收集的1g银柳新鲜花粉花粉置于隔板上，干燥4h；
步骤（2）冷冻处理：将干燥的银柳花粉，经4℃(1h) → -25℃(2h) → -70℃(24h)预冻后，投入液氮中保存；
步骤（3）解冻处理：银柳花粉液氮保存300天后，分别以自来水冲洗解冻、4℃恒温解冻、25℃恒温解冻、37℃水浴解冻各解冻15min，测花粉生活力，确定银柳的最佳解冻方法为25℃恒温解冻15min。
表1 银柳保存300天后不同解冻方式解冻后萌发率
实施例2
步骤（1）干燥处理：将500g变色硅胶放于干燥器中，离变色硅胶2cm处放一隔板，再将收集的1g簸箕柳新鲜花粉花粉置于隔板上，干燥4h；
步骤（2）冷冻处理：将干燥的簸箕柳花粉，经4℃(1h) → -25℃(2h) → -70℃(24h)预冻后，投入液氮中保存；
步骤（3）解冻处理：簸箕柳花粉液氮保存300天后，分别以自来水冲洗解冻、4℃恒温解冻、25℃恒温解冻、37℃水浴解冻各解冻15min，测花粉生活力，确定银柳的最佳解冻方法为25℃恒温解冻15min。
表2 簸箕柳保存300天后不同解冻方式解冻后萌发率
实施例3
步骤（1）干燥处理：将500g变色硅胶放于干燥器中，离变色硅胶2cm处放一隔板，再将收集的1g蒿柳×毛枝柳新鲜花粉花粉置于隔板上，干燥4h；
步骤（2）冷冻处理：将干燥的蒿柳×毛枝柳花粉，经4℃(1h) → -25℃(2h) → -70℃(24h)预冻后，投入液氮中保存；
步骤（3）解冻处理：蒿柳×毛枝柳花粉液氮保存300天后，分别以自来水冲洗解冻、4℃恒温解冻、25℃恒温解冻、37℃水浴解冻各解冻15min，测花粉生活力，确定银柳的最佳解冻方法为25℃恒温解冻15min。
表3蒿柳×毛枝柳保存300天后不同解冻方式解冻后萌发率
解冻方式 不解冻 自来水冲洗解冻 4℃过渡解冻 25℃恒温解冻 37℃水浴解冻
萌发率（%） 38.2 50.6 44.6 55.1 49.8
标准差 5.3 5.3 4.3 5.2 6.0
以上所述以较佳实施例公开了本发明。然其并非用以限制本发明，凡采用等同替换或者等效变换方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种柳树花粉超低温保存方法，其特征是，步骤如下：
（1）干燥：将柳树花粉与干燥剂放入干燥器中干燥2 ~4h；所述干燥剂为变色硅胶，干燥剂与柳树花粉质量比为500：1；
（2）冷冻：柳树花粉经步骤（1）处理后，投入液氮中保存；具体为：将经干燥处理的柳树花粉于4℃冷藏1h后，再转入-25℃冷冻2h后，置于-70℃冷冻24h后，再投入液氮中保存；
（3）解冻：柳树花粉经步骤（2）液氮保存后，于4 ~37℃解冻；解冻方法为用自来水冲洗解冻15min，4℃恒温解冻15min，25℃恒温解冻15min，37℃水浴解冻15min这四种方法中的一种或几种。
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