CN111493065B - 一种辣木花粉的超低温保存方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种辣木花粉的超低温保存方法，包括以下步骤：(1)选择上午9点至11点，采集有花粉的花朵；(2)将步骤(1)的花朵放在密封袋中，干燥，密封，预冻后，再置于(‑80)℃‑(‑200)℃中保存，备用；(3)将步骤(2)中得到的花朵解冻，得到所述的辣木花粉。本发明中的超低温保存方法可以将完整的辣木花朵保存起来，并且可将花粉活力的保持时间由正常的1‑2天延长至2‑3个月，延长了花粉的寿命；本发明中的解冻方式可以避免在化冻过程中产生细胞内的次生结冰，并且防止在化冻过程中水的渗透冲击对细胞膜体系的破坏，从而有效的保证花粉超低温冻存的效果。

Description

一种辣木花粉的超低温保存方法

技术领域

本发明涉及植物花粉的保存技术领域，更具体的说是涉及一种辣木花粉的超低温保存方法。

背景技术

辣木起源于印度和非洲的干旱或半干旱地区，凭借超强的生态适应力、丰富的营养价值、独特的生物活性，成为一种极具开发潜力的树种。辣木籽油是高级烹调油、化妆品、香料和防腐剂的优良原料。辣木籽油还可被用于航天、精密机械的润滑剂。另外，辣木种仁中富含有活性凝结成分，有净水效果，因此辣木又被誉为“植物黄金”。

花粉是植物种质的形式之一，包含该物种的所有基因类型，遗传信息极其丰富，是种质保存、交换、人工辅助授粉以及杂交育种的重要材料。辣木每朵花的花药中的花粉粘合成两个花粉团，花粉团粘性很大，很难均匀的散开，授粉成功需要依靠大量的昆虫传粉。此外，辣木开花量大，生理落花落果严重，在自然状态下，辣木花粉的寿命只有1-2天，这给提高辣木产量以及杂交育种工作带来极大的不便。开展花粉的中长期保存就显得尤为重要。在辣木盛花期大量收集辣木花，减少辣木花自然脱落，造成的浪费，并将辣木花粉低温冷冻保存，用于人工授粉，提高辣木产量，同时解决了杂交育种工作中效率低和花期不遇的问题。

超低温保存被誉为是种质资源长期保存最有效的方法，可以保存茎尖、愈伤组织、休眠芽、花粉、细胞、原生质体等。在超低温状态下，材料新陈代谢几乎完全停止，只要方法合适，液氮充足，理论上可以无限期保存材料。目前多个本木植物如袖子、油棕、柳树、山茶、桂花等都成功开展了花粉的超低温保存研究。研究表明不同植物花粉其超低温保存所采用的方法以及保存参数会因植物自身特性不同而不同。

目前尚未见到怎样采用超低温技术来保存辣木花粉、使辣木的花粉活力保持时间延长至大约2-3个月的技术报道，因此，提供一种针对延长辣木花粉寿命的超低温保存方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种能够延长辣木花粉寿命并维持辣木种质资源的遗传多样性的超低温保存方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案一种辣木花粉的超低温保存方法，包括如下步骤：

(1)选择上午9点至11点，采集有花粉的花朵；

(2)将步骤(1)的花朵置于密封袋中，经干燥，密封，预冻后，再置于(-80)℃-(-200)℃下保存，得到辣木花粉。

本发明的有益效果：

花粉超低温保存成功的关键，在于降温冷冻过程中避免细胞内结冰,造成细胞结构不可逆性的破坏，导致花粉死亡。在本发明中辣木花朵经过特殊的干燥脱水、预冻处理可以使细胞发生适当程度的保护性脱水,使细胞内的水流到细胞外结冰，并且在化冻过程防止细胞内次生结冰并且防止在化冻过程中水的渗透冲击对细胞膜体系的破坏。采用本方法冻存后可以有效延长花粉活力，并且保持花粉活力超越鲜花活力(冻存2-3个月后花粉活力依然可以达到90％以上)；有效解决了辣木花粉采集和保存的难题，在辣木盛花期大量收集辣木花，减少辣木花自然脱落造成的浪费，并将辣木花粉超低温保存后，可用于人工授粉，提高辣木产量，同时解决了杂交育种工作中效率低和花期不遇的问题。

优选地，步骤(2)中，所述干燥温度为30℃-40℃，干燥时间为1-9h。

更加优选地，干燥温度为35℃，干燥时间为4h。

优选地，步骤(2)中，所述预冻温度为(-20)-(-80)℃，预冻时间为1-2h。

优选地，所述步骤(2)中，将预冻后的辣木花粉置于-80℃的冰箱中保存或将预冻后的辣木花粉置于-196℃的液氮中保存。

更加优选地，采用液氮保存时，先将辣木花粉在-20℃下预冻1h，再在-80℃下预冻1h，然后置于-196℃液氮中保存。

采用上述的有益效果：超低温保存能否成功的关键是要避免冷冻材料细胞内结冰对原生质的损害。本发明中采取预冻处理逐级降温的方式可以使细胞内的水分缓慢地流出，从而在细胞外缓慢地结冰，这种细胞外结冰对细胞结构的损伤不大，从而保证超低温冷冻的成功。

还包括解冻，所述解冻的具体操作为：将保存后的花朵置于湿度15-20％、温度10-15℃的气候箱中10-20min；然后再置于湿度30-50％、温度35-40℃的气候箱内40min-2h。

采用上述的有益效果：花粉经超低温保存后，不同的化冻方式对花粉的萌发率具有明显的影响,从而影响到冷冻保存的效果。本发明采取的解冻复苏方式可以避免在化冻过程中产生细胞内的次生结冰,并且防止在化冻过程中水的渗透冲击对细胞膜体系的破坏，从而有效的保证花粉超低温冻存的效果。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种辣木花粉的超低温保存方法，采用本发明中的低温保存方式能够将辣木花粉保存2-3个月；保存2-3个月后复苏处理，辣木花粉的萌发率均可达到90％以上，由此可见本方法适合辣木种质特性，可以有效提高辣木花粉的保存期限和保存寿命，提升辣木花粉利用率，而且方法简便，操作简单。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中的培养基由10％蔗糖、1％琼脂糖、0.02％硼酸和88.98％蒸馏水组成。

实施例1

选择在晴天上午9点30采集多油辣木刚刚开放，花药刚刚打开开始散粉的花朵。将采集的花朵带回实验室，将花粉均匀的播散在处理好的培养基上，置于人工气候箱中培养4h，控制温湿度分别为RH50％，30℃和RH35％，37℃，4h后在Olympus10×10倍显微镜下观察花粉的萌发状况，镜检计数。每个样品重复3次，每重复观察3个视野。测定结果如表1所示，多油辣木花粉离体萌发最佳条件为高温干燥。

表1花粉离体萌发培养条件对花粉活力的影响

实施例2

在晴天下午采集多油辣木刚刚开放，花药刚刚打开开始散粉的花朵，将花朵带回实验室分别做4组实验，实验条件为

(1)室温(35℃)不预冻处理，-80℃保存24h

(2)-20℃预冻1h，液氮保存24h

(3)-20℃预冻1h，-80℃保存24h

(4)-20℃预冻1h，然后-80℃预冻1h，液氮保存24h；

然后将上述4中条件下处理后的辣木花朵在温湿度分别为20％、15℃的人工气候箱内解冻10-20min，再置于温湿度分别为30％、35℃的人工气候箱内复苏40min后，花粉萌发率见表2；结果表明辣木花粉超低温保存时需要做预冻处理，-80℃超低温冰箱保存时20℃预冻1h即可，液氮保存时则需要逐级降温预冻-20℃预冻1h，然后-80℃预冻1h即可。

表2预冻方式对花粉超低温保存效果的影响

实施例3

在晴天下午采集多油辣木刚刚开放，花药刚刚打开开始散粉的花朵，将花朵带回实验室在-20℃下预冻1h，在-80℃预冻1h，然后置于液氮中保存24h，将花朵取出后进行4组实验，实验条件为

(1)经38℃温水浴3-5min

(2)在湿度温度分别为RH20％、15℃下解冻20min，再在湿度温度分别为RH50％、35℃下复苏40min

(3)在湿度温度分别为RH20％、15℃下解冻20min，再在湿度温度分别为RH30％、35℃下复苏40min

(4)在湿度温度分别为RH20％、15℃解冻20min，再在湿度温度分别为RH30％、35℃复苏3h

按照上述4种解冻方式处理后，花粉萌发率见表3，结果表明辣木花粉超低温冷冻保存后，置于人工气候箱内在湿度温度分别为RH20％、15℃下解冻20min,再置于湿度温度为RH30％、35℃下复苏40min，保存效果最佳且省时省力。区别于其他作物的花粉解冻孵育环境，辣木花粉需要在湿度较低干燥的条件下解冻复苏。

表3解冻复苏方式对花粉超低温保存效果的影响

实施例4

选择在晴天上午9点30采集多油辣木刚刚开放，花药刚刚打开开始散粉的花朵。将采集的花朵带回实验室置于35℃鼓风干燥箱内分别干燥脱水0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h等7个处理实验；

然后经-20℃预冻1h，然后在-80℃预冻1h，置于液氮中保存24h后取出，在置于湿度温度分别为RH20％、15℃的人工气候箱内解冻20min，再置于湿度温度分别为RH30％、35℃的人工气候箱内复苏40min后，花粉萌发率见表4，结果表明辣木花粉经35℃鼓风干燥箱内干燥脱水4小时后，超低温冷冻保存效果最佳。

表4脱水时间对花粉超低温保存效果的影响

实施例5

选择在晴天上午9点30采集多油辣木刚刚开放，花药刚刚打开开始散粉的花朵。将采集的花朵带回实验室置于35℃鼓风干燥箱内干燥脱水4h，然后将花朵分别做4组实验，实验条件为：

(1)-20℃冰箱，冻存7天；

(2)-20℃预冻1h→-80℃预冻1h，置于液氮中保存30天；

(3)-20℃预冻1h，-80℃超低温冰箱保存30天；

(4)-20℃预冻1h，-80℃超低温冰箱保存60天。

按照上述4个实验条件处理后，取出花朵置于湿度温度分别为RH20％、15℃的人工气候箱内解冻10-20min，再置于湿度温度分别为RH30％、35℃的人工气候箱内复苏40min后，将花朵上的花粉均匀的播散在处理好的培养基上，置于人工气候箱中培养4h，控制温湿度为RH35％、37℃，4h后Olympus10×10倍显微镜下观察花粉的萌发状况，镜检计数。每个样品重复3次，每重复观察3个视野。结果如表5所示,低温前萌发率为94.76％，经过不同温度保存后，花粉活力存在差异，-20℃活力下降明显，-80℃冰箱和-196℃液氮活力得到较好的保持，其中-80℃保存效果最佳，且存储方便，可大量保存，成本较低。

表5冷冻温度和时间对于花粉活力的影响

由上述表格中的数据可以得出，采用本发明中的方法将花粉保存两个月之后解冻复苏处理后的辣木花粉的萌芽率均可达到90％以上。

实施例6

辣木花粉的超低温保存方法，包括如下步骤：

(1)选择上午9点30，采集多油辣木刚刚开放，花药刚刚打开开始散粉的花朵；

(2)将步骤(1)的花朵放在密封袋中，在35℃下鼓风干燥脱水4h，密封，然后将花朵在-20℃下预冻1h，再置于-80℃下预冻1h，然后在液氮中保存24h，得到辣木花粉；

将上述得到的辣木花粉置于人工气候箱内控制温度湿度分别为15℃、RH20％的条件下解冻10-20min，然后再在温度湿度分别为35℃、RH30％下解冻40min，然后置于培养基中并置于人工气候箱内并控制温度湿度分别为37℃、RH35％的条件下培养4h，得到的辣木花粉具有良好的活力。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (1)

1.一种辣木花粉的超低温保存方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）选择上午9点至11点，采集有花粉的花朵；

（2）将步骤（1）的花朵置于密封袋中，经干燥，密封，预冻后，再置于-80℃的冰箱中保存或将预冻后的辣木花粉置于-196℃的液氮中保存，得到所述的辣木花粉；

步骤（2）中，所述干燥温度为35℃，干燥时间为4h；

当置于-80℃保存时，所述预冻条件为：在-20℃下预冻1h；

当置于液氮保存时，所述预冻条件为：先在-20℃预冻1h，再-80℃预冻1h；

还包括解冻，所述解冻的具体操作为：将保存后的花朵置于湿度20%、温度15℃的气候箱中解冻10-20min；然后再置于湿度30%、温度35℃的气候箱内40min或3h。