CN104488857A - 甜瓜花粉超低温保存的方法 - Google Patents

Abstract

本发明甜瓜花粉超低温保存的方法，涉及一种植物体局部的保存方法，特别是涉及一种用于长期保存的甜瓜花粉保存方法。其目的是为了提供一种操作简便、有效可行的甜瓜花粉超低温保存的方法。本发明甜瓜花粉超低温保存的方法包括以下步骤：摘花；采粉；干燥；预冷冻；储藏；解冻。本发明的甜瓜花粉超低温保存的方法简单易于操作，可以用于生产制种。本发明用于甜瓜花粉的保存领域。

Description

甜瓜花粉超低温保存的方法

技术领域

本发明涉及一种植物体局部的保存方法，特别是涉及一种用于长期保存的甜瓜花粉保存方法。

背景技术

随着经济的发展与生态环境的破坏，种质资源不断流失和灭绝。如何保护好现有植物种质，维持其多样性已引起全球关注。

花粉作为植物种质的一种形式，包含了该植株的各种基因类型，是种质保存和交换的主要材料。联合国粮农组织(FAO)和国际植物遗传资源委员会(IBPGR)自1960年以来一直积极支持有关国家的科研机构开展花粉保存工作。但是花粉寿命很短，离开植株后常温下存活时间不长，超低温保存花粉的成功，将使花粉的贮运、交换成为可能。

超低温保存是指在-80℃(干冰温度)到-196℃(液氮温度)甚至更低的温度下保存生物材料。从理论上讲，在低温下保存生物材料，特别是在超低温条件下，可以大大减慢，甚至终止植物的代谢和衰老过程，保持生物的稳定度，最大限度的抑制生理代谢强度，降低劣变发生的频率。经过超低温保存后，处于“假死”状态的生物材料能保持正常细胞的活性、形态发生潜能，并且不发生任何遗传变异，从而达到长期保存的目的。

超低温保存花粉可以延长花粉的寿命，同时也带来了以下几个方面的好处；

(1)授粉：在不同花期或授粉不良时使用；

(2)育种：解决花期不同的矛盾，可以随时进行杂交；

(3)基因保存：花粉具有半套基因，稳定且体积小，便于运输；对于某些种子寿命不长的园艺植物而言，花粉是最理想的基因保存介质，可用于建立花粉种质库。

成熟的花粉具有厚实的花粉壁，对花粉起着良好的保护作用，花粉中含有丰富的贮藏物质，可以供给花粉独立生活所需要的能量和营养，花粉的这些特点为在适宜的条件下延长其寿命成为可能。在液氮中保存的花粉便于长途运输，可作为地区间和国际间植物种质交换的一种形式，特别是多年生木本植物，从幼苗到开花需要许多年，如果采取交换花粉的方式，则可大大加速其改良的工作进程，而且花粉极少带有病毒、病菌等，可避免由于种子和苗木交换时携带病虫害所产生的一系列问题。据统计，在木本植物中，已对雪松、扁柏、柑桔、胡桃、落叶松、枣、李、梨、杜鹃花和秤锤树等10多个属10多个种的花粉进行了超低温保存研究。

目前，甜瓜花粉的的储藏未见研究，采用现有技术保藏近似种属的方法对甜瓜花粉进行超低温保藏，均无法保存甜瓜花粉的活性。常用干燥程度为8-13％，通常需要逐步解冻，操作复杂，且不适用于甜瓜花粉。

发明内容

本发明是为了解决以上技术问题，而提供的一种操作简便、有效可行的甜瓜花粉超低温保存的方法。

本发明甜瓜花粉超低温保存的方法，包括以下步骤：

一、摘花：早上6点至8点间摘取刚刚开放的甜瓜花；

二、采粉和干燥：于温度为25℃，湿度为40％的阴凉干燥处收集花粉，并将收集的花粉置于牛皮纸上1h；

三、预冷冻：将经步骤二处理的花粉置于冻存管中，于-10℃预冷冻1h；

四、储藏：将冻存管置于液氮或干冰中冷冻储藏；

五、解冻：将储藏的花粉从液氮中取出后平铺在牛皮纸上，在室温下放置10min，即可恢复花粉活性。

本发明的甜瓜花粉超低温保存的方法，所述的花粉在储藏过程中的运输：短途运输时，直接用液氮罐运输；长途运输时，将储藏的花粉置于放有干冰的泡沫箱中进行运输。

作为超低温保存的材料，伤害往往发生在冰冻和化冻两个过程中，因此在进行冰冻保存的时候必须使材料达到超低温保存所要求的生理特性，否则在投入液氮以后会造成冷冻伤害,使花粉活力丧失，影响保存的效果，无法用于正常的育种和科研。而且要使植物种质的超低温保存获得成功，还要求采取合适的化冻方法，以避免在化冻过程中产生细胞内的次生结冰，并防止在化冻吸水过程中水的渗透冲击对细胞膜体系的破坏。甜瓜花粉与其他植物花粉在超低温保存时对含水量、以及解冻方式的要求明显不同，采用常用干燥程度和解冻方法无法保存甜瓜花粉的活性，而采用本发明的方法，可以使超低温保藏甜瓜花粉成为可行。

本发明甜瓜花粉超低温保存的方法与现有技术相比具有如下有益效果：

1、本发明的甜瓜花粉超低温保存的方法使甜瓜花粉的超低温保藏成为可行，弥补了甜瓜花粉长期储藏方法的空白。

2、本发明的甜瓜花粉超低温保存的方法，是针对目前甜瓜制种市场，可直接进行异地父母本制种或不同季节种植，储藏或运输，从而有效抑制甜瓜花粉父母本外流。

3、本发明的甜瓜花粉超低温保存的方法，其含水量远高于现有技术所使用的量，这是由甜瓜花粉其自身特性决定的，采用本发明的方法可以使甜瓜花粉储藏在液氮中一年、储藏在干冰中7天后仍能保持80％-90％的活性。而将甜瓜花粉降至较低的含水量再进行超低温保存，将使其失去活性。

4、本发明的甜瓜花粉超低温保存的方法，预冷冻为-10℃、1h，这是适合其较高含水量的预冷冻的温度和时间。由于甜瓜超低温保藏所需的含水量较高，预冷冻阶段温度过低会造成冷冻伤害，导致甜瓜花粉失活。

5、本发明的甜瓜花粉超低温保存的方法，干燥时直接采用在牛皮纸上常温晾干，晾干时间短，不需要干燥剂与特殊温度条件，且借助牛皮纸的材质特点，使花粉能够均匀回温，且不会在回温过程中粘着在介质上。

6、本发明的甜瓜花粉超低温保存的方法，无需添加冷冻保护剂，简单易于操作，可以用于生产制种。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明的甜瓜花粉超低温保存的方法作进一步的说明。

实施例1

本实施例的甜瓜花粉超低温保存的方法，按以下步骤进行：

一、摘花：在5、6月份的早上6点至8点间，于石家庄制种基地摘取刚刚开放的甜瓜花；

二、采粉和干燥：于温度为25℃，湿度为40％的阴凉干燥处收集花粉，并将收集的花粉置于牛皮纸上1h；

三、预冷冻：将经步骤二处理的花粉置于冻存管中，于-10℃预冷冻1h；

四、储藏：将冻存管置于液氮中储藏一年；

五、解冻：将储藏的花粉从液氮中取出后平铺在牛皮纸上，在室温下放置10min。

实施例2

本实施例的甜瓜花粉超低温保存的方法，按以下步骤进行：

一、摘花：在5、6月份的早上6点至8点间，于石家庄制种基地摘取刚刚开放的甜瓜花；

二、采粉和干燥：于温度为25℃，湿度为40％的阴凉干燥处收集花粉，并将收集的花粉置于牛皮纸上1h；

三、预冷冻：将经步骤二处理的花粉置于冻存管中，于-10℃预冷冻1h；

四、储藏：将冻存管置于保温箱中的粉末或颗粒状干冰内7天(期间根据干冰挥发情况补充干冰)；

五、解冻：将储藏的花粉从液氮中取出后平铺在牛皮纸上，在室温下放置10min。

本实施例中甜瓜花粉保藏在干冰中，便于携带，可以用于短途或长途运输。

对实施例1和2中储藏的花粉活性进行检测，其活性为80％-90％，证明采用本发明的保藏方法，储藏在液氮中一年、储藏在干冰中7天后仍能保持花粉的活性，其活性足够用于授粉制种。

验证试验

设定不同干燥程度，对甜瓜花粉含水量对超低温保存后的花粉活性的影响进行研究。

采用本发明的步骤二中的干燥方法，可以保证甜瓜花粉的含水量为70-80％。采用实施例1的方法，仅改变步骤二中的干燥时间，使得甜瓜花粉的含水量分别为5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％，然后对在液氮中保藏30天的甜瓜花粉活性进行测定，结果如表1所示。

表1 不同干燥程度对超低温保藏的甜瓜花粉活性的影响

由上表可知，按照本发明的方法，在液氮冷冻前甜瓜花粉的含水量为70-80％才能够保证解冻后甜瓜花粉的活性，低于70％花粉活性会大大降低，低于30％时花粉基本失去活性，选择常规干燥程度(含水量8-13％)无法保存甜瓜花粉活性。

设定不同预冷冻参数，对甜瓜花粉的预冷冻处理方法对超低温保存后的花粉活性的影响进行研究。

采用实施例1的方法，仅改变步骤三中的处理参数为：-10℃、0.5h，-10℃、1h，-20℃、1h，-30℃、1h，-40℃、1h，-10℃、2h，-10℃、3h，-10℃、4h，然后对在液氮中保藏30天的甜瓜花粉活性进行测定，结果如表2所示。

表2 不同预处理方法对超低温保藏的甜瓜花粉活性的影响

由上表可知，按照本发明的方法，对甜瓜花粉进行预冷冻，可以保持花粉的活性，而降低预冷冻温度，缩短或延长预冷冻的时间都会导致花粉活性的丧失。甜瓜花粉经过预冷冻前的干燥处理后，花粉含水量仍然较高，预冷冻温度过低会造成花粉的冷冻伤害，从而失去活性。

采用实施例1的步骤，仅改变步骤五中的解冻方法，对在液氮中保藏30天的甜瓜花粉活性进行测定。作为对照的解冻方法均为现有花粉的超低温保存方法中的常用解冻方法。结果如表3所示。

表3 不同解冻方法对超低温保藏的甜瓜花粉活性的影响

由上表可知，按照本发明的解冻方法，可以保持花粉的活性；采用玻璃板或者普通白纸作为花粉解冻时的存放介质，花粉的活性恢复较差，且花粉容易粘附与介质上；采用自来水冲洗的方法进行解冻，甜瓜花粉全部失去活性。

虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式作出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种甜瓜花粉超低温保存的方法，其特征在于包括以下步骤：

一、摘花：早上6点至8点间摘取刚刚开放的甜瓜花；

二、采粉和干燥：于温度为25℃，湿度为40％的阴凉干燥处收集花粉，并将收集的花粉置于牛皮纸上1h；

三、预冷冻：将经步骤二处理的花粉置于冻存管中，于-10℃预冷冻1h；

四、储藏：将冻存管置于液氮或干冰中冷冻储藏；

五、解冻：将储藏的花粉从液氮中取出后平铺在牛皮纸上，在室温下放置10min，即可恢复花粉活性。