CN107372471B - 一种钻喙兰花粉的超低温保存方法 - Google Patents

一种钻喙兰花粉的超低温保存方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种钻喙兰花粉的超低温保存方法，包括采粉和干燥、冻存、解冻。其中花粉干燥时放置在透气袋中进行，隔离了干燥剂对花粉的污染且透气性良好而具有很好的干燥效果；其次，本发明降低了玻璃化溶液PVS2中DMSO的浓度，在原有PVS2的成分基础上增加了丙二醇，丙二醇是具有渗透性且低毒的一类防冻剂。因此，本发明提供的一种钻喙兰花粉的超低温保存方法能长时间有效保证花粉活力，简单易行，可根据需要随时取出解冻用于授粉，在钻喙兰的育种和生产上具有重要的实践和推广意义。

Description

一种钻喙兰花粉的超低温保存方法
技术领域
本发明属于超低温保存技术领域，具体地，涉及一种钻喙兰花粉的超低温保存方法。
背景技术
钻喙兰(Rynchostylis retusa)是兰科(Orchidaceae)树兰亚科(Epidendroideae)万代兰族(Vandeae)指甲兰亚族(Aeridinae)钻喙兰属(Rynchostylis)的一种附生型兰花，它花色淡雅且具芳香，小花密集，花序饱满而下垂，形似一条毛茸茸的狐狸尾巴，因此其商品被称为狐狸尾兰。钻喙兰主要分布于南亚、东南亚诸国以及我国的贵州和云南。
钻喙兰具有很高的观赏价值，也是育种的好材料，但钻喙兰在育种中的利用率远不如同属下的海南钻喙兰((Rynchostylis gigantea)。目前在英国皇家园艺学会(RHS)上登录的以钻喙兰属植物为亲本之一的30个杂交属、326个杂交种中，只有很少的一部分是由钻喙兰与其近缘属下的种和品种之间杂交获得的。导致这个状况的原因之一就是钻喙兰的花粉不易保存。钻喙兰的花粉寿命很短，在离开植株体后自然条件存放的花粉其活力直线下降，12小时后花粉萌发率降至10%以下，而在杂交育种过程中，常会出现花期不遇的情况，给杂交育种工作带来很大的不便。
兰科植物的花粉外包裹着类脂膜，因此花粉粒粘连成花粉块，而不同物种的花粉粒在大小、含水量等方面存在差异，导致不同种类的花粉在保存条件上也会有区别。目前尚没有关于钻喙兰花粉长期保存方法的报道，利用常规的兰科植物花粉保存方式，即将花粉块在无水氯化钙中干燥后置于-20℃冰箱中冷冻保存，我们发现钻喙兰的花粉在这样的保存条件下只能保持一段时间，约1个月以后其活力直线下降，如在实际操作中遇到与另一个种或品种花期相差1个月以上，常规的保存方法将无法满足育种需求。而在大多数植株组织、花粉超低温保存中使用的冷冻保护剂PVS2无法在钻喙兰花粉的超低温保存中发挥很好的效果，利用PVS2进行超低温保存后我们发现花粉活力下降较快，授粉后结实率也很低。因此，我们需要一种效果良好的长期保存技术来克服钻喙兰育种中存在的时间空间限制。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述缺陷，提供一种能长时间保持钻喙兰花粉活力，并对授粉效果没有影响的钻喙兰花粉保存方法。
为了实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：
一种钻喙兰花粉的超低温保存方法，包括如下步骤：
S1.采粉和干燥：摘取新鲜花粉块，放入透气袋中密封，并将透气袋置于放有干燥剂的培养皿中，在0～4℃条件下放置1～3h；
S2.冻存：将花粉块取出，放入冻存管中，加入预处理液，室温下静置10～45 min；然后将冻存管中的预处理液吸出，加入玻璃化溶液MPVS2，将冻存管投入液氮保存；所述玻璃化溶液MPVS2的成分为：30% (w/v)甘油、15% (w/v)乙二醇、7.5～10% (w/v)丙二醇、5～7.5% (w/v)DMSO，用含有0.4M蔗糖的BK无机盐储备液配制，pH为5.7；
S3.解冻：将冻存管取出，解冻后将冻存管中原有的溶液吸出一半，并加入相应体积的冲洗液，静置5～10 min，如此重复2～4次。
BK（Brewbaker & Kwack）无机盐储备液的配方是本领域所公用的配方：0.1gHBO3; 0.3g Ca(NO3)2 . 4H2O; 0.2gMgSO4 .7H2O; 0.1g KNO3; 100ml蒸馏水。
含有0.4M蔗糖的BK无机盐储备液即在100ml的BK无机盐储备液中加入63.48g蔗糖。
本发明提供一种钻喙兰花粉的超低温保存方法，具体为将花粉放置在透气袋中密封进行干燥，这一方面隔离了干燥剂对花粉的污染，另一方面由于透气袋透气性良好而具有很好的干燥效果。其次，本发明降低了玻璃化溶液PVS2中DMSO的浓度，DMSO是一种良好的防冻剂，但它具有一定的细胞毒性，不同物种所表现的毒性反应不同，在原有PVS2的成分基础上增加了丙二醇，丙二醇也是具有渗透性且低毒的一类防冻剂，目前尚未有丙二醇在花粉超低温保存中运用的报道。通过调配玻璃化溶液中丙二醇与DMSO的浓度，使得细胞毒性降低且防冻效果良好，显著增强了钻喙兰花粉在长时间冷冻保存下的生命活力。
优选地，步骤S2所述玻璃化溶液MPVS2的成分为：30% (w/v)甘油、15% (w/v)乙二醇、10% (w/v)丙二醇、5% (w/v)DMSO，用含有0.4M蔗糖的BK无机盐储备液配制，pH为5.7。
本发明研究表明，降低玻璃化溶液PVS2中DMSO的浓度，增加丙二醇含量，使得玻璃化溶液细胞毒性降低，有利于花粉活力增大；DMSO防冻效果优异，其浓度进一步降低，则玻璃化溶液的防冻效果下降，造成花粉活力降低。经过不断尝试，发明人研究了一个合适的浓度范围，细胞毒性降低且防冻效果良好，可增强钻喙兰花粉在长时间冷冻保存下的生命活力。
步骤S1所述透气袋为常见的透气性好且密封性好的袋子，如过滤棉纸袋，在生活中常见的过滤棉纸袋包括茶叶袋。
优选地，步骤S1所述干燥剂为变色硅胶。其对介质(比如空气或工业气体)中所含水蒸汽有极强的吸附作用，且颜色随湿度不同而变化。
优选地，步骤S2所述预处理液成分为含有0.4M蔗糖、2M甘油的BK无机盐储备液。
步骤S3所述冲洗液为含有1.2M蔗糖的BK无机盐储备液。
步骤S3所述解冻操作为将冻存管置于室温下或用自来水冲洗30min。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明降低了玻璃化溶液PVS2中DMSO的浓度，DMSO是一种良好的防冻剂，但它具有一定的细胞毒性，不同物种所表现的毒性反应不同，在原有PVS2的成分基础上增加了丙二醇，丙二醇也是具有渗透性且低毒的一类防冻剂，目前尚未有丙二醇在花粉超低温保存中运用的报道。通过调配玻璃化溶液中丙二醇与DMSO的浓度，使得细胞毒性降低且防冻效果良好，显著增强了钻喙兰花粉在长时间冷冻保存下的生命活力。且本发明的方法简单易行，可根据需要随时取出解冻用于授粉，如果是远距离操作也可利用小型液氮盒或冰盒携带花粉，到目的地后自然解冻用于授粉。因此，本发明在钻喙兰的育种和生产上具有重要的实践和推广意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步解释说明，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明范围的限制，但凡采用等同替换或等效变换的形式所获得的技术方案，均应包括在本发明权利要求的保护范围之内。
以下实施例和对比例中，所用原料均为市售商品。
实施例1
S1.采粉和干燥：在天气晴朗的上午9:00～11:00，取开花当天的新鲜花粉块放入茶叶袋中，然后置于放有变色硅胶的培养皿中，在4℃条件下放置2h。
S2.冻存：将步骤1的花粉放入2ml冻存管中，加入1ml的预处理液(含有0.4M蔗糖、2M甘油的BK无机盐储备液，pH5.7)，在室温下(27±2℃)静置10min，然后将预处理液吸出，加入1ml改良的玻璃化溶液MPVS2 [30% (w/v)甘油+15% (w/v)乙二醇+10% (w/v)丙二醇+5% (w/v)DMSO，用含有0.4M蔗糖的BK无机盐储备液配制，pH5.7]，投入液氮保存。
S3.解冻：冻存的钻喙兰花粉在使用时先将冻存管取出，置于室温下(27±2℃)或用自来水冲洗30min，然后将冻存管中的原有的MPVS2溶液吸出一半，并加入相应体积的冲洗液(含有1.2M蔗糖的BK无机盐储备液)，静置5min，如此重复3次。解冻后的花粉可按常规方法直接用于授粉。
实施例2
S1.采粉和干燥：在天气晴朗的上午9:00～11:00，取开花当天的新鲜花粉块放入茶叶袋中，然后置于放有变色硅胶的培养皿中，在0℃条件下放置1h。
S2.冻存：将步骤1的花粉放入2ml冻存管中，加入1ml的预处理液(含有0.4M蔗糖、2M甘油的BK无机盐储备液，pH5.7)，在室温下(27±2℃)静置10min，然后将预处理液吸出，加入1ml改良的玻璃化溶液MPVS2 [30% (w/v)甘油+15% (w/v)乙二醇+7.5% (w/v)丙二醇+7.5% (w/v)DMSO，用含有0.4M蔗糖的BK无机盐储备液配制，pH5.7]，投入液氮(LN)保存。
S3.解冻：冻存的钻喙兰花粉在使用时先将冻存管取出，置于室温下(27±2℃)或用自来水冲洗30min，然后将冻存管中的原有的MPVS2溶液吸出一半，并加入相应体积的冲洗液(含有1.2M蔗糖的BK无机盐储备液)，静置5min，如此重复3次。解冻后的花粉可按常规方法直接用于授粉。
实施例3
1.采粉和干燥：在天气晴朗的上午9:00～11:00，取开花当天的新鲜花粉块放入茶叶袋中，然后置于放有变色硅胶的培养皿中，在4℃条件下放置3h。
2.冻存：将步骤1的花粉放入2ml冻存管中，加入1ml的预处理液(含有0.4M蔗糖、2M甘油的BK无机盐储备液，pH5.7)，在室温下(27±2℃)静置10min，然后将预处理液吸出，加入1ml改良的玻璃化溶液MPVS2 [30% (w/v)甘油+15% (w/v)乙二醇+10% (w/v)丙二醇+5%(w/v)DMSO，用含有0.4M蔗糖的BK无机盐储备液配制，pH5.7]，投入液氮(LN)保存。
3.解冻：冻存的钻喙兰花粉在使用时先将冻存管取出，置于室温下(27±2℃)或用自来水冲洗30min，然后将冻存管中的原有的MPVS2溶液吸出一半，并加入相应体积的冲洗液(含有1.2M蔗糖的BK无机盐储备液)，静置5min，如此重复3次。解冻后的花粉可按常规方法直接用于授粉。
对比例1
1.采粉和干燥：在天气晴朗的上午9:00～11:00，取开花当天的新鲜花粉块放入茶叶袋中，然后置于放有变色硅胶的培养皿中，在4℃条件下放置2h。
2.冻存：将步骤1的花粉放入2ml冻存管中，加入1ml的预处理液(含有0.4M蔗糖、2M甘油的BK无机盐储备液，pH5.7)，在室温下(27±2℃)静置10min，然后将预处理液吸出，加入1ml玻璃化溶液 [30% (w/v)甘油+15% (w/v)乙二醇+15% (w/v)DMSO，用含有0.4M蔗糖的BK无机盐储备液配制，pH5.7]，投入液氮(LN)保存。
3.解冻：冻存的钻喙兰花粉在使用时先将冻存管取出，置于室温下(27±2℃)或用自来水冲洗30min，然后将冻存管中的原有的PVS2溶液吸出一半，并加入相应体积的冲洗液(含有1.2M蔗糖的BK无机盐储备液)，静置5min，如此重复三次。解冻后的花粉可按常规方法直接用于授粉。
对比例2
1.采粉和干燥：在天气晴朗的上午9:00～11:00，取开花当天的新鲜花粉块放入茶叶袋中，然后置于放有变色硅胶的培养皿中，在4℃冰箱中放置2h。
2.冻存：将步骤1的花粉放入2ml冻存管中，加入1ml的预处理液(含有0.4M蔗糖、2M甘油的BK无机盐储备液，pH5.7)，在室温下(27±2℃)静置10min，然后将预处理液吸出，加入1ml玻璃化溶液[30% (w/v)甘油+15% (w/v)乙二醇+14% (w/v)丙二醇+1% (w/v)DMSO，用含有0.4M蔗糖的BK无机盐储备液配制，pH5.7]，投入液氮(LN)保存。
3.解冻：冻存的钻喙兰花粉在使用时先将冻存管取出，置于室温下(27±2℃)或用自来水冲洗30min，然后将冻存管中的原有的PVS2溶液吸出一半，并加入相应体积的冲洗液(含有1.2M蔗糖的BK无机盐储备液)，静置5min，如此重复三次。解冻后的花粉可按常规方法直接用于授粉。
用离体萌发法对实施例1、对比例1、对比例2、自然条件下放置、常规的兰科植物花粉保存方式（即将花粉块在无水氯化钙中干燥后置于-20℃冰箱中冷冻保存的方法）等不同储藏条件下钻喙兰花粉的活力进行比较，每种处理重复3次，每个重复在显微镜下观察10个视野；并用不同储藏条件下的钻喙兰花粉进行人工授粉，观察结实率。实验结果如表1所示。
实验结果表明，自然条件下放置的钻喙兰花粉很快就失去活力；用常规兰科植物花粉保存方式的花粉在在7天之内保持较高活力，但在之后便逐渐下降，在储藏90天之后基本丧失活力；对比例1超低温保存时，花粉的活力在保存至第7天时就已出现明显下降，与实施例1超低温保存的花粉差异显著，此后至180天内花粉活力逐渐降低，储存1年后的活力下降至17.2%，授粉后结实率为20%；而在本发明的保存方法下，利用MPVS2进行超低温保存，花粉在储存1年后活力仍有36.3%，授粉后结实率为90%。
表1为不同储藏条件下钻喙兰花粉的萌发率
Figure 1
表1中，每列数据后的字母相同表示差异不显著，字母不同则表示差异显著。

Claims (7)

1.一种钻喙兰花粉的超低温保存方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.采粉和干燥：摘取新鲜花粉块，放入透气袋中密封，并将透气袋置于放有干燥剂的培养皿中，在0～4℃条件下放置1～3h；
S2.冻存：将花粉块取出，放入冻存管中，加入预处理液，室温下静置10～45 min；然后将冻存管中的预处理液吸出，加入玻璃化溶液MPVS2，将冻存管投入液氮保存；所述玻璃化溶液MPVS2的成分为：30% (w/v)甘油、15% (w/v)乙二醇、7.5～10% (w/v)丙二醇、5～7.5%(w/v)DMSO，用含有0.4M蔗糖的BK无机盐储备液配制，pH为5.7；
S3.解冻：将冻存管取出，解冻后将冻存管中原有的溶液吸出一半，并加入相应体积的冲洗液，静置5～10 min，如此重复2～4次。
2.根据权利要求1所述钻喙兰花粉的超低温保存方法，其特征在于，步骤S2所述玻璃化溶液MPVS2的成分为：30% (w/v)甘油、15% (w/v)乙二醇、10% (w/v)丙二醇、5% (w/v)DMSO，用含有0.4M蔗糖的BK无机盐储备液配制，pH为5.7。
3.根据权利要求1所述钻喙兰花粉的超低温保存方法，其特征在于，步骤S1所述透气袋为茶叶袋。
4.根据权利要求1所述钻喙兰花粉的超低温保存方法，其特征在于，步骤S1所述干燥剂为变色硅胶。
5.根据权利要求1所述钻喙兰花粉的超低温保存方法，其特征在于，步骤S2所述预处理液成分为含有0.4M蔗糖、2M甘油的BK无机盐储备液。
6.根据权利要求1所述钻喙兰花粉的超低温保存方法，其特征在于，步骤S3所述冲洗液为含有1.2M蔗糖的BK无机盐储备液。
7.根据权利要求1所述钻喙兰花粉的超低温保存方法，其特征在于，步骤S3所述解冻操作为将冻存管置于室温下或用自来水冲洗30min。
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