CN104705292B - 向日葵花粉超低温保存的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明向日葵花粉超低温保存的方法，涉及一种植物体局部的保存方法，特别是涉及一种用于长期保存向日葵花粉的方法。其目的是为了提供一种便于异地运输及贮藏的向日葵花粉超低温保存的方法及其所配套的花粉离体萌发培养基。本发明向日葵花粉超低温保存的方法，包括：采集花粉；测定花粉活性；干燥；冷冻；解冻。本发明的向日葵花粉超低温保存的方法简单易于操作，可以用于生产制种。本发明用于甜瓜花粉的保存领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物体局部的保存方法，特别是涉及一种用于长期保存向日葵花粉的方法。
背景技术
向日葵起源于北美洲，是菊科、向日葵属的植物，向日葵的种子具有很高的经济价值，不但可作成受人喜爱的葵瓜子，更可榨出低胆固醇的高级食用葵花油。向日葵在我国已有几十年的栽培历史.遍布20多个省、市、自治区，是重要的经济作物之一。
向日葵具有明显的杂种优势，生产中使用的向日葵种子绝大多数为杂种一代。在“三系”育种工作中，有时需要利用异地的花粉，有时可能遇到亲本花期不育的问题。只有打破杂交亲本时间与空间的隔离，才能增加获得新品种的机会，这就使得珍贵、稀有遗传种质的贮备工作尤为重要。成熟花粉包含着植物的全部遗传信息，因此向日葵花粉的贮藏对解决杂交亲本花期不遇以及人工授粉、种质资源保存等都具有重要意义。
目前，关于向日葵花粉长期储藏的报道尚不多见，大部分只能进行几天的短期储藏。本发明可以为向日葵花粉长期储藏提供一个经济、快速、简便的方法。
发明内容
本发明是为了解决向日葵亲本花期不遇和远距离杂交的技术问题，提供一种便于异地运输及贮藏的向日葵花粉超低温保存的方法及其所配套的花粉离体萌发培养基。
本发明向日葵花粉超低温保存的方法，包括以下步骤：
一、采集花粉：于上午9-11点采集花盘上的花粉，将采集的花粉过40-60目的筛子，去除杂质；
二、测定花粉活性：用花粉离体萌发法测定花粉活性，花粉活性不低于50％即可进行下一步操作；
三、干燥：将花粉平铺在牛皮纸上，于常温阴凉处干燥，至花粉含水量为80-90％；
四、冷冻保存：将干燥后的花粉装入冻存管，置于液氮中5-10s后，转移至-80℃冰箱储存；
五、解冻：将储存的花粉从-80℃冰箱取出后，直接在常温下置于牛皮纸上解冻0.5h即可。
进一步，本发明向日葵花粉超低温保存的方法，所述步骤二中的花粉离体萌发使用的培养基为：蔗糖120g/L、硼酸150mg/L、CaCl2·2H2O1.0g/L、PEG400090g/L、MgSO4·7H2O350mg/L、KNO3950mg/L、KH2PO490mg/L、KCl175mg/L、Na2EDTA7.5mg/L、FeSO4·7H2O0.025mg/L、Na2MoO4·2H2O0.25mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、CoCl2·6H2O0.025mg/L、VB11.0mg/L和VB61.0mg/L。
本发明向日葵花粉超低温保存的方法与现有技术相比具有如下有益效果：
1、本发明的向日葵花粉超低温保存的方法，是针对目前向日葵制种市场，可直接进行异地父母本制种或不同季节种植，储藏或运输，从而有效抑制向日葵花粉父母本外流。
2、经本发明的方法储存的向日葵花粉授粉成功率不但没有降低，反而有轻微提高，使向日葵花粉的超低温保藏成为可行，弥补了向日葵花粉长期储藏方法的空白。
3、本发明的向日葵花粉超低温保存的方法，其含水量远高于现有技术所使用的量，这是由向日葵花粉其自身特性决定的，采用本发明的方法可以使向日葵花粉储藏在液氮中一年以上。而将向日葵花粉降至较低的含水量再进行超低温保存，将使其失去活性。
4、本发明的向日葵花粉超低温保存的方法，干燥和解冻时均采用在牛皮纸，置于牛皮纸上晾干所需时间短，不需要干燥剂与特殊温度条件；另一方面，由于花粉超低温保存时含水量较大，使用常规回温方法容易造成细胞损伤，而借助牛皮纸的材质特点，使花粉能够均匀回温，且不会在回温过程中粘着在介质上。
5、本发明的向日葵花粉超低温保存的方法，无需添加冷冻保护剂，简单易于操作，可以用于生产制种。
具体实施方式
通过以下实施例对本发明的向日葵花粉超低温保存的方法作进一步的说明。
实施例1
本实施例的向日葵花粉超低温保存的方法，按以下步骤进行：
一、采集花粉：于石家庄地区上午10点采集花盘上的花粉，将采集的花粉过40目的筛子，去除杂质；
二、测定花粉活性：用花粉离体萌发法测定花粉活性，所得花粉活性为76％；
三、干燥：将花粉平铺在牛皮纸上，于常温阴凉处干燥，至花粉含水量为81％；
四、冷冻保存：将干燥后的花粉装入冻存管，置于液氮中10s后，转移至-80℃冰箱储存；
五、解冻：将储存的花粉从-80℃冰箱取出后，直接在常温下置于牛皮纸上解冻0.5h即可。
实施例2
本实施例的向日葵花粉超低温保存的方法，按以下步骤进行：
一、采集花粉：于石家庄地区上午11点采集花盘上的花粉，将采集的花粉过50目的筛子，去除杂质；
二、测定花粉活性：用花粉离体萌发法测定花粉活性，所得花粉活性为71％；
三、干燥：将花粉平铺在牛皮纸上，于常温阴凉处干燥，至花粉含水量为90％；
四、冷冻保存：将干燥后的花粉装入冻存管，置于液氮中5s后，转移至-80℃冰箱储存；
五、解冻：将储存的花粉从-80℃冰箱取出后，直接在常温下置于牛皮纸上解冻0.5h即可。
实施例3
本实施例的向日葵花粉超低温保存的方法，按以下步骤进行：
一、采集花粉：于海南地区上午9点采集花盘上的花粉，将采集的花粉过60目的筛子，去除杂质；
二、测定花粉活性：用花粉离体萌发法测定花粉活性，所得花粉活性为55％；
三、干燥：将花粉平铺在牛皮纸上，于常温阴凉处干燥，至花粉含水量为86％；
四、冷冻保存：将干燥后的花粉装入冻存管，置于液氮中8s后，转移至-80℃冰箱储存；
五、解冻：将储存的花粉从-80℃冰箱取出后，直接在常温下置于牛皮纸上解冻0.5h即可。
实施例1-3中花粉离体萌发的培养基为：蔗糖120g/L、硼酸150mg/L、CaCl2·2H2O1.0g/L、PEG400090g/L、MgSO4·7H2O350mg/L、KNO3950mg/L、KH2PO490mg/L、KCl175mg/L、Na2EDTA7.5mg/L、FeSO4·7H2O0.025mg/L、Na2MoO4·2H2O0.25mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、CoCl2·6H2O0.025mg/L、VB11.0mg/L和VB61.0mg/L。对实施例1-3储藏1年后解冻的花粉活性进行检测，其活性分别为72％、66％、52％。使用储存一年后的花粉进行授粉试验，与一年前刚采集的花粉进行授粉的成功率进行比较。结果如表1所示。
表1储存前后向日葵花粉的授粉成功率
由表1可知，采用本发明的方法储存的向日葵花粉授粉成功率不但没有降低反而有轻微的提高，根据种子萌发的规律推知，花粉经过冷冻保藏和回温恢复活性，度过一个休眠期，导致实际授粉时成功率的提高。
验证试验
设定不同干燥程度，对向日葵花粉含水量对超低温保存后的花粉活性的影响进行研究。
本发明的步骤三中的向日葵花粉的含水量干燥至80-90％。采用实施例1的方法，仅改变步骤三中的干燥程度，使得向日葵花粉的含水量分别为5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％，然后对在-80℃冰箱中保藏30天的向日葵花粉活性进行测定，结果如表2所示。
表2不同干燥程度对超低温保藏的向日葵花粉活性的影响
由上表可知，按照本发明的方法，在液氮冷冻前向日葵花粉的含水量为80-90％才能够保证解冻后向日葵花粉的活性，低于80％花粉活性会大大降低，低于50％时花粉基本失去活性，选择常规干燥程度(含水量8-13％)无法保存向日葵花粉活性。
采用以下方法验证置于液氮中5-10s的意义。取实施例1的方法步骤四中采用直接放置-80℃冰箱冷冻的方法与本发明的方法进行比较，对向日葵花粉的预冷冻处理方法对超低温保存后的花粉活性的影响进行研究，结果如表3所示。
表3不同预处理方法对超低温保藏的向日葵花粉活性的影响
由上表可知，按照本发明的方法对向日葵花粉进行液氮处理，可以保持花粉的活性，由于液氮能够使花粉在短短的几秒内快速冷冻，减少了冻伤。
采用实施例1的步骤，仅改变步骤五中的解冻方法，对在液氮中保藏30天的向日葵花粉活性进行测定。作为对照的解冻方法均为现有花粉的超低温保存方法中的常用解冻方法。结果如表4所示。
表4不同解冻方法对超低温保藏的向日葵花粉活性的影响
由上表可知，按照本发明的解冻方法，可以保持花粉的活性；采用玻璃板或者普通白纸作为花粉解冻时的存放介质，花粉的活性恢复较差，且花粉容易粘附与介质上；采用自来水冲洗的方法进行解冻，向日葵花粉全部失去活性。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，本发明的保护范围是由所附权利要求书限定的。本领域的技术人员在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式作出多种变更或修改，但这些变更和修改均落入本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种向日葵花粉超低温保存的方法，其特征在于：包括以下步骤：
一、采集花粉：于上午9-11点采集向日葵花盘上的花粉，将采集的花粉过40-60目的筛子，去除杂质；
二、测定花粉活性：用花粉离体萌发法测定花粉活性，花粉活性不低于50％即可进行下一步操作；
三、干燥：将花粉平铺在牛皮纸上，于常温阴凉处干燥，至花粉含水量为80-90％；
四、冷冻保存：将干燥后的花粉装入冻存管，置于液氮中5-10s后，转移至-80℃冰箱储存；
五、解冻：将储存的花粉从-80℃冰箱取出后，直接在常温下置于牛皮纸上解冻0.5h。
2.根据权利要求1所述的向日葵花粉超低温保存的方法，其特征在于：所述步骤二中的花粉离体萌发使用的培养基为：蔗糖120g/L、硼酸150mg/L、CaCl2·2H2O1.0g/L、PEG400090g/L、MgSO4·7H2O350mg/L、KNO3950mg/L、KH2PO490mg/L、KCl175mg/L、Na2EDTA7.5mg/L、FeSO4·7H2O0.025mg/L、Na2MoO4·2H2O0.25mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、CoCl2·6H2O0.025mg/L、VB11.0mg/L和VB61.0mg/L。
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