CN106995834A - 一种竹节参花粉活力的测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明一种竹节参花粉活力的测定方法，其目的是为了提供一种高效、快速、简便、低成本的测定竹节参花粉活力的方法。本发明一种竹节参花粉活力的测定方法包括以下步骤：制备培养液；花粉采集；花粉萌发培养；观察统计。本发明的一种竹节参花粉活力的测定方法，培养液制备方便，操作简单，耗时短，成本低，效果好。本发明用于竹节参花粉萌发能力的测定领域。

Description

一种竹节参花粉活力的测定方法

技术领域

本发明涉及一种花粉萌发能力的测定方法，特别是涉及一种用于竹节参的花粉萌发能力的测定方法。

背景技术

竹节参为五加科人参属多年生草本植物，别名竹根七、竹节人参等。以干燥根茎入药，具有滋补强壮、散瘀止痛、止血生肌、舒筋活络、和血祛痰等功效，是我国特有的珍贵中药材资源。

竹节参分布范围比较广，在我国主要分布于四川，湖北，云南，贵州，湖南，陕西，河南，江西等地，尤以贵州，四川和湖北最为集中。竹节参生长比较缓慢，每年生长一节，作为药用的竹节参生长年限一般在5年以上。上世纪七八十年代，竹节参野生资源还比较丰富，但是由于近些年来人们对其认知度的不断提升，一系列滥采乱挖的行为导致竹节参野生资源被严重破坏，其药用资源呈现濒危状态。

植物体中成熟的花粉包含着植物全部的遗传信息，花粉贮藏是有效利用和保存珍稀种质简捷、高效的途径。如何鉴定、收集具有高纯度和高生活力的花粉对保证竹节参的产量和质量具有至关重要的作用。

花粉活力是花粉细胞存活能力的指标，是花粉生物学特性研究中的一项重要内容，花粉活力的大小可以估测花粉授精和遗传后代的能力。花粉活力受自身遗传特性和外界因素的影响。现有技术对花粉活力的测定中，染色法测定时染色时间不易把握，且有时候颜色重叠，在显微镜下不易观察；形态学观察法虽然简单，但有些花粉形态正常，其实已经失去活力，统计起来也会有误差；花粉离体培养测定法是相对有效，接近实际结果的测定方法，但不同植物有着不同的离体萌发培养测定条件，还需要进一步摸索。目前，关于竹节参花粉活力的测定方法还未见报道。

发明内容

本发明要解决的问题是提供高效、快速、简便、低成本的测定竹节参花粉活力的方法。

本发明一种竹节参花粉活力的测定方法，其特征在于包含有以下步骤：

a.制备培养液，对其进行杀菌处理；

b.花粉采集：采集当天上午散粉的花粉，将所述花粉装入无菌离心管中，低温避光保存；

c.花粉培养：准备镊子、滤纸和培养皿，杀菌处理；用镊子将滤纸在培养液中充分浸湿，然后平展在培养皿中；将采集的花粉均匀的撒在滤纸上，在黑暗或自然光中培养30-60分钟；

d.镜检，计算萌发率，比较花粉管生长一致性。

优选的，一种竹节参花粉活力的测定方法，其特征在于包含有以下步骤：

a.制备培养液，对其进行杀菌处理，所述的培养液由质量浓度为15-20％的蔗糖、质量浓度为0.1-0.15％的硼酸、质量浓度为0.1-0.15％的氯化钙和水组成；所述的杀菌处理为将培养液在紫外灯下照射12-24小时；将离心管、镊子、滤纸和培养皿在121℃高温高压下灭菌20-30分钟；

b.花粉采集：采集当天上午散粉的花粉，将所述花粉装入无菌离心管中，低温避光保存；

c.花粉培养：准备镊子、滤纸和培养皿，杀菌处理；用镊子将滤纸在培养液中充分浸湿，然后平展在培养皿中；将采集的花粉均匀的撒在滤纸上，在黑暗或自然光中培养30-60分钟；

d.镜检，计算萌发率，比较花粉管生长一致性；以花粉管长度达到花粉粒直径的2倍及以上视为萌发，以萌发率≥80％视为花粉具有活力，适用于花粉活力测定；所述萌发率通过以下公式进行计算：萌发率(％)＝[(B1+B2+B3+B4+B5+B6+B7+B8)/A]×100％＝(B/A)×100％；式中，A为圆形培养皿的面积，B1-B8为镜检时圆形培养皿均分成8个区域内的每个区域内花粉萌发的面积；B为8个区域中花粉萌发的面积之和。

花粉萌发率是衡量花粉活力状况的主要标志，同时花粉管生长速度亦在一定程度上反映花粉的生活力状况。在人工授粉前鉴定花粉活力能够减少不必要的损失。本发明采用花粉离体萌发测定法检测花粉活性。

本发明一种竹节参花粉活力的测定方法具有如下有益效果：

1、采用本发明的竹节参花粉活力的测定方法，只需培养30-60分钟即可得到结果，一定程度上缩短了实验时间，该方法操作简单，更适用于实际的生产应用。

2、本发明的竹节参花粉活力的测定方法中，培养基质的配制简单易操作，相比其它人工、贵重微量元素等费用、成本低。

3、采用本发明的竹节参花粉活力的测定方法，可以实时观察，提前检测花粉活力，避免直接人工授粉后由于花粉活性的缺失而造成的经济损失。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：1、一种竹节参花粉活力的测定方法，其特征在于包含有以下步骤：

a.制备培养液，对其进行杀菌处理；

b.花粉采集：采集当天上午散粉的花粉，将所述花粉装入无菌离心管中，低温避光保存；

c.花粉培养：准备镊子、滤纸和培养皿，杀菌处理；用镊子将滤纸在培养液中充分浸湿，然后平展在培养皿中；将采集的花粉均匀的撒在滤纸上，在黑暗或自然光中培养30-60分钟；

d.镜检，计算萌发率，比较花粉管生长一致性。

2、按照权利要求1所述的一种竹节参花粉活力的测定方法，其特征在于包含有以下步骤：

a.制备培养液，对其进行杀菌处理，所述的培养液由质量浓度为15-20％的蔗糖、质量浓度为0.1-0.15％的硼酸、质量浓度为0.1-0.15％的氯化钙和水组成；所述的杀菌处理为将培养液在紫外灯下照射12-24小时；将离心管、镊子、滤纸和培养皿在121℃高温高压下灭菌20-30分钟；

b.花粉采集：采集当天上午散粉的花粉，将所述花粉装入无菌离心管中，低温避光保存；

c.花粉培养：准备镊子、滤纸和培养皿，杀菌处理；用镊子将滤纸在培养液中充分浸湿，然后平展在培养皿中；将采集的花粉均匀的撒在滤纸上，在黑暗或自然光中培养30-60分钟；

d.镜检，计算萌发率，比较花粉管生长一致性；以花粉管长度达到花粉粒直径的2倍及以上视为萌发，以萌发率≥80％视为花粉具有活力，适用于花粉活力测定；所述萌发率通过以下公式进行计算：萌发率(％)＝[(B1+B2+B3+B4+B5+B6+B7+B8)/A]×100％＝(B/A)×100％；式中，A为圆形培养皿的面积，B1-B8为镜检时圆形培养皿均分成8个区域内的每个区域内花粉萌发的面积；B为8个区域中花粉萌发的面积之和。

实施例2：一种竹节参花粉活力的测定方法，包括以下步骤：

1、制备培养液：称取150g蔗糖，1.0g硼酸，1.5g氯化钙加去离子水充分溶解，定容至1L，在紫外灯下照射24小时灭菌；

2、花粉采集：采集当天上午散粉的花粉，将所述花粉装入无菌离心管中，低温避光保存；

3、花粉培养：将滤纸在培养液中充分浸湿，然后平展在培养皿中，将采集的花粉均匀的撒在滤纸上，在黑暗中培养60分钟；

4、镜检，计算萌发率为91％，花粉管生长的一致性高，适用于花粉活力测定。

实施例3：一种竹节参花粉活力的测定方法，包括以下步骤：

1、制备培养液：称取100g蔗糖，1.5g硼酸，1.0g氯化钙加去离子水充分溶解，定容至1L，在紫外灯下照射24小时灭菌；

2、花粉采集：采集当天上午散粉的花粉，将所述花粉装入无菌离心管中，低温避光保存；

3、花粉培养：将滤纸在培养液中充分浸湿，然后平展在培养皿中，将采集的花粉均匀的撒在滤纸上，在自然光中培养45分钟；

4、镜检，计算萌发率为65％，花粉管生长的一致性中等，不适用于花粉活力测定。

实施例4：一种竹节参花粉活力的测定方法，包括以下步骤：

本实施例一种竹节参花粉活力的测定方法，包括以下步骤：

1、制备培养液：称取50g蔗糖，1.5g硼酸，1.0g氯化钙加去离子水充分溶解，定容至1L，在紫外灯下照射18小时灭菌；

2、花粉采集：采集当天上午散粉的花粉，将所述花粉装入无菌离心管中，低温避光保存；

3、花粉培养：将滤纸在培养液中充分浸湿，然后平展在培养皿中，将采集的花粉均匀的撒在滤纸上，在自然光中培养60分钟；

4、镜检，计算萌发率为27％，花粉管生长的一致性低，不适用于花粉活力测定。

实施例5：一种竹节参花粉活力的测定方法，包括以下步骤：

1、制备培养液：称取200g蔗糖，1.5g硼酸，1.0g氯化钙加去离子水充分溶解，定容至1L，在紫外灯下照射12小时灭菌；

2、花粉采集：采集当天上午散粉的花粉，将所述花粉装入无菌离心管中，低温避光保存；

3、花粉培养：将滤纸在培养液中充分浸湿，然后平展在培养皿中，将采集的花粉均匀的撒在滤纸上，在黑暗中培养30分钟；

4、镜检，计算萌发率为91％，花粉管生长的一致性高，适用于花粉活力测定。

实施例6：一种竹节参花粉活力的测定方法，包括以下步骤：

1、制备培养液：称取200g蔗糖，1.5g硼酸，0.5g氯化钙加去离子水充分溶解，定容至1L，在紫外灯下照射24小时灭菌；

2、花粉采集：采集当天上午散粉的花粉，将所述花粉装入无菌离心管中，低温避光保存；

3、花粉培养：将滤纸在培养液中充分浸湿，然后平展在培养皿中，将采集的花粉均匀的撒在滤纸上，在黑暗中培养45分钟；

4、镜检，计算萌发率为72％，花粉管生长的一致性中等，不适用于花粉活力测定。

实施例7：一种竹节参花粉活力的测定方法，包括以下步骤：

1、制备培养液：称取175g蔗糖，10g硼酸，1.5g氯化钙加去离子水充分溶解，定容至1L，在紫外灯下照射24小时灭菌；

2、花粉采集：采集当天上午散粉的花粉，将所述花粉装入无菌离心管中，低温避光保存；

3、花粉培养：将滤纸在培养液中充分浸湿，然后平展在培养皿中，将采集的花粉均匀的撒在滤纸上，在黑暗中培养45分钟；

4、镜检，计算萌发率为0，花粉管未生长，不适用于花粉活力测定。

验证试验

为了验证本发明一种竹节参花粉活力的测定方法的效果，设计以下试验进行验证。

1、不同培养液配方对竹节参花粉活力测定的影响

设计18组含蔗糖，硼酸和氯化钙的不同浓度梯度的培养液，编号1-18，其中编号16-18用于检测氯化钙浓度对花粉萌发率和花粉管生长一致性的影响情况，具体参数如表1所示。

表1对比试验中各成分的配比

由表1可知，不同培养液浓度之间的结果差异较大，随着蔗糖浓度的升高，花粉萌发率也随之升高，花粉管生长一致性由低变高；随着硼酸浓度的增加，花粉萌发率先增大后降低，花粉管生长一致性由低变高在变低，当硼酸浓度≥0.1％时，花粉萌发率明显降低，为0；另外，在蔗糖和硼酸浓度一定的条件下，随着氯化钙浓度的升高，花粉萌发率先增加后减小，同样当氯化钙浓度≥0.1％时，花粉萌发率明显降低，花粉管生长的一致性呈现出由中变高再变低的趋势。

2、不同光照条件对竹节参花粉活力测定的影响。

取表1中第14组培养液，将采集的花粉均匀的撒在用培养液浸湿后的滤纸上，分别放在室温下的强光、自然光和黑暗条件下培养45分钟后观察实验结果，结果见表2。

表2不同光照条件对竹节参花粉活力测定的影响

由表2可知，在强光条件下，花粉基本没有萌发，在自然光和黑暗条件下，花粉萌发率均达到90％左右，花粉管生长一致性高，无明显差别。

3、不同培养时间对竹节参花粉活力测定的影响

取表1中第14组培养液，将采集的花粉均匀的撒在用培养液浸湿后的滤纸上，分别在自然光条件下培养15、30、45、60、90分钟后观察实验结果，结果见表3。

表3不同培养时间对竹节参花粉活力测定的影响

由表3可知，在培养15分钟后，花粉开始萌发，但萌发率较低，为31％，花粉管生长一致性低；在培养30-60分钟期间，花粉萌发率平均达到90％左右，花粉管生长一致性高，此时适合花粉活力的测定；随着培养时间的延长，到90分钟时，花粉萌发率降到63％左右，花粉管生长一致性也降为中等，开始不适合花粉活力的测定。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (2)

1.一种竹节参花粉活力的测定方法，其特征在于包含有以下步骤：

a.制备培养液，对其进行杀菌处理；

b.花粉采集：采集当天上午散粉的花粉，将所述花粉装入无菌离心管中，低温避光保存；

c.花粉培养：准备镊子、滤纸和培养皿，杀菌处理；用镊子将滤纸在培养液中充分浸湿，然后平展在培养皿中；将采集的花粉均匀的撒在滤纸上，在黑暗或自然光中培养30-60分钟；

d.镜检，计算萌发率，比较花粉管生长一致性。

2.按照权利要求1所述的一种竹节参花粉活力的测定方法，其特征在于包含有以下步骤：

a.制备培养液，对其进行杀菌处理，所述的培养液由质量浓度为15-20％的蔗糖、质量浓度为0.1-0.15％的硼酸、质量浓度为0.1-0.15％的氯化钙和水组成；所述的杀菌处理为将培养液在紫外灯下照射12-24小时；将离心管、镊子、滤纸和培养皿在121℃高温高压下灭菌20-30分钟；

b.花粉采集：采集当天上午散粉的花粉，将所述花粉装入无菌离心管中，低温避光保存；

c.花粉培养：准备镊子、滤纸和培养皿，杀菌处理；用镊子将滤纸在培养液中充分浸湿，然后平展在培养皿中；将采集的花粉均匀的撒在滤纸上，在黑暗或自然光中培养30-60分钟；

d.镜检，计算萌发率，比较花粉管生长一致性；以花粉管长度达到花粉粒直径的2倍及以上视为萌发，以萌发率≥80％视为花粉具有活力，适用于花粉活力测定；所述萌发率通过以下公式进行计算：萌发率(％)＝[(B1+B2+B3+B4+B5+B6+B7+B8)/A]×100％＝(B/A)×100％；式中，A为圆形培养皿的面积，B1-B8为镜检时圆形培养皿均分成8个区域内的每个区域内花粉萌发的面积；B为8个区域中花粉萌发的面积之和。