CN106233877A - 一种有效测定野葛花粉活力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种有效测定野葛花粉活力的方法，包括以下步骤：制备培养液；所述的培养液由以下质量百分比的原料制备而成：蔗糖15％‑20％、硼酸0.05％‑0.1％、氯化钙0.05％‑0.1％，水余量；花粉采集：于上午10点采集花粉，并将采集到的花粉装入无菌离心管中，避光保存；花粉培养：将滴有培养液的载玻片置于放有湿滤纸的培养皿中，将采集的花粉均匀的撒在培养液上，在黑暗或自然光中培养30‑60分钟；镜检，计算萌发率。本发明只需培养30‑60分钟即可得到野葛花粉的活力，一定程度上缩短了实验时间，该方法操作简单成本低，更适用于实际的生产应用。

Description

一种有效测定野葛花粉活力的方法

技术领域

本发明涉及农业领域，具体涉及一种有效测定野葛花粉活力的方法。

背景技术

野葛为豆科葛属植物，别名葛藤，甘葛等。我国葛根的栽培历史悠久，迄今已有6千多年。我国现有十多种葛属品种，且种质资源极为丰富，产量质量均居全球之首。野葛是我国传统的大宗中药材，富含淀粉及异黄酮类物质，其中淀粉具有可食用性，异黄酮类物质具有降血压血脂，扩张冠状动脉，抗氧化，提高大脑记忆能力，保护肝功能等作用，具有良好的食用价值和药用价值，属于国家卫生部公布的药食两用资源，是重要的地区经济作物之一。在植物体中，成熟的花粉包含着植物体的全部遗传信息，花粉贮藏是有效利用珍稀种质的简捷、高效途径。在进行野葛杂交授粉和人工辅助授粉工作中，通常需要进行花粉贮藏和花粉活力的测定。如何鉴定、采集高纯度和高生活力的花粉对后期的杂交育种工作至关重要。花粉活力是花粉细胞存活能力的指标，是花粉生物学特性研究中的一项重要内容，花粉活力的大小可以估测花粉授精和遗传后代的能力。花粉活力受自身遗传特性和外界因素的影响。现有技术对花粉活力的测定中，染色法测定时染色时间不易把握，且有时候颜色重叠，在显微镜下不易观察；形态学观察法虽然简单，但有些花粉形态正常，其实已经失去活力，统计起来也会有误差；花粉离体培养测定法是相对有效，接近实际结果的测定方法，但不同植物有着不同的离体萌发培养测定条件，还需要进一步摸索。目前，关于有效测定野葛花粉活力的方法还未见报道。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种有效测定野葛花粉活力的方法，高效、快速、简便、成本低。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种有效测定野葛花粉活力的方法，包括以下步骤：

S1、制备培养液；所述的培养液由以下质量百分比的原料制备而成：蔗糖15％-20％、硼酸0.05％-0.1％、氯化钙0.05％-0.1％，水余量；

S2、花粉采集：于上午10点采集花粉，并将采集到的花粉装入无菌离心管中，避光保存；

S3、花粉培养：将滴有培养液的载玻片置于放有湿滤纸的培养皿中，将采集的花粉均匀的撒在培养液上，在黑暗或自然光中培养30-60分钟；

S4、镜检，以花粉管长度达到花粉粒直径的2倍及以上视为萌发，计算萌发率。

所述萌发率通过以下公式进行计算：

萌发率＝[(B1+B2+B3+B4+B5+B6+B7+B8)/A]×100％＝(B/A)×100％；

式中，A为圆形培养皿的面积，B1-B8为镜检时圆形培养皿均分成8个区域内的每个区域内花粉萌发的面积；B为8个区域中花粉萌发的面积之和。

其中，每个小区域中萌发的花粉的面积统计方法为(以B1区域为例)：萌发的花粉区域具有不确定性，但是萌发区域总会有类似三角形，圆形，四边形等形状的区域，此时计算面积则以三角形，圆形或者四边形的面积计算公式去计算，然后将所得的面积进行求和，得到B1区域的面积。

本发明具有以下有益效果：

1、只需培养30-60分钟即可得到野葛花粉的活力，一定程度上缩短了实验时间，该方法操作简单，更适用于实际的生产应用。

2、培养基质的配制简单易操作，相比其它人工、贵重微量元素等费用、成本低。

3、可以实时观察，提前检测花粉活力，避免直接人工授粉后由于野葛花粉活性的缺失而造成的经济损失。

具体实施方式

为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下实施例中，所述萌发率通过以下公式进行计算：

萌发率＝[(B1+B2+B3+B4+B5+B6+B7+B8)/A]×100％＝(B/A)×100％；

式中，A为圆形培养皿的面积，B1-B8为镜检时圆形培养皿均分成8个区域内的每个区域内花粉萌发的面积；B为8个区域中花粉萌发的面积之和。每个小区域中萌发的花粉的面积统计方法为(以B1区域为例)：萌发的花粉区域具有不确定性，但是萌发区域总会有类似三角形，圆形，四边形等形状的区域，此时计算面积则以三角形，圆形或者四边形的面积计算公式去计算，然后将所得的面积进行求和，得到B1区域的面积。

实施例1

一种有效测定野葛花粉活力的方法，包括以下步骤：

S1、制备培养液：称取150g蔗糖，0.1g硼酸，0.1g氯化钙加水定容至1L，溶解，即制得培养液；

S2、花粉采集：于上午10点采集花粉，将所述花粉装入无菌离心管中，避光保存；

S3、花粉培养：将滴有培养液的载玻片置于放有湿滤纸的培养皿中，将采集的花粉均匀的撒在培养液上，在自然光中培养45分钟；

S4、镜检，计算萌发率为76％，花粉管生长的一致性高，适于萌发率的观察和计算。

实施例2

一种有效测定野葛花粉活力的方法，包括以下步骤：

S1、制备培养液：称取200g蔗糖，0.05g硼酸，0.1g氯化钙加水定容至1L，溶解，即制得培养液；

S2、花粉采集：于上午10点采集花粉，将所述花粉装入无菌离心管中，避光保存；

S3、花粉培养：将滴有培养液的载玻片置于放有湿滤纸的培养皿中，将采集的花粉均匀的撒在培养液上，在黑暗中培养60分钟；

S4、镜检，计算萌发率为82％，花粉管生长的一致性高，适于萌发率的观察和计算。

实施例3

一种有效测定野葛花粉活力的方法，包括以下步骤：

S1、制备培养液：称取175g蔗糖，0.1g硼酸，0.05g氯化钙加水定容至1L，溶解，即制得培养液；

S2、花粉采集：于上午10点采集花粉，将所述花粉装入无菌离心管中，避光保存；

S3、花粉培养：将滴有培养液的载玻片置于放有湿滤纸的培养皿中，将采集的花粉均匀的撒在培养液上，在自然光中培养30分钟；

S4、镜检，计算萌发率为78％，花粉管生长的一致性高，适于萌发率的观察和计算。

实施例4

一种有效测定野葛花粉活力的方法，包括以下步骤：

S1、制备培养液：称取150g蔗糖，0.1g硼酸，0.05g氯化钙加水定容至1L，溶解，即制得培养液；

S2、花粉采集：于上午10点采集花粉，将所述花粉装入无菌离心管中，避光保存；

S3、花粉培养：将滴有培养液的载玻片置于放有湿滤纸的培养皿中，将采集的花粉均匀的撒在培养液上，在黑暗中培养45分钟；

S4、镜检，计算萌发率为75％，花粉管生长的一致性高，适于萌发率的观察和计算。

实施例5

一种有效测定野葛花粉活力的方法，包括以下步骤：

S1、制备培养液：称取175g蔗糖，0.05g硼酸，0.1g氯化钙加水定容至1L，溶解，即制得培养液；

S2、花粉采集：于上午10点采集花粉，将所述花粉装入无菌离心管中，避光保存；

S3、花粉培养：将滴有培养液的载玻片置于放有湿滤纸的培养皿中，将采集的花粉均匀的撒在培养液上，在自然光中培养45分钟；

S4、镜检，计算萌发率为76％，花粉管生长的一致性高，适于萌发率的观察和计算。

验证试验

为了验证本发明有效测定野葛花粉活力的方法的效果，设计以下试验进行验证。

不同培养液配方对野葛花粉活力测定的影响

1、设计22组含蔗糖，硼酸和氯化钙的不同浓度梯度的培养培养液，编号1-21，其中编号19-21用于检测氯化钙浓度对花粉萌发率和花粉管生长一致性的影响情况；另选用花粉基本培养基作为对照，编号22：质量浓度为5％的蔗糖，质量浓度为0.1％的硼酸，质量浓度为0.1％的氯化钙。具体参数如表1所示。

表1对比试验中各成分的配比

2、将滴有培养液的载玻片置于放有湿滤纸的培养皿中，将采集的花粉均匀的撒在培养液上，黑暗室温培养后用显微镜观察萌发情况，选择三个视野计算萌发率，取平均值。

具体操作步骤：按上表中数据称取蔗糖、硼酸和氯化钙，分别搅拌溶于水中，并编号1-21。用同样的方法配制对照用的培养基并标注22。上午10点采集花粉；从19种培养液中各取300μL于干净的载玻片上，将载玻片置于放有湿滤纸的培养皿中；将新鲜的野葛花粉均匀的撒在培养液上。在室温和光照条件下分别培养60分钟后记录萌发率和生长的一致性等实验结果，结果如表2所示。

表2不同配方培养液对萌发率和生长一致性的影响

由表2可知，不同培养液浓度之间的结果差异较大，随着蔗糖浓度的升高，花粉萌发率也随之升高，花粉管生长一致性由低变高，然而受硼酸浓度增大的影响，花粉萌发率先增加后减小，当硼酸浓度＞0.1％时，花粉萌发率明显降低，另外，在蔗糖和硼酸浓度一定的条件下，随着氯化钙浓度的升高，花粉萌发率先增加后减小，同样当氯化钙浓度＞0.1％时，花粉萌发率明显降低，花粉管生长的一致性呈现出由中变高再变低的趋势。同时由上表可知，在对照培养基中野葛花粉完全不能萌发，说明花粉基本培养基不适用于野葛花粉的培养。

(1)不同培养温度对野葛花粉活力测定的影响

按照上面的试验方法，取三组14号培养液，将采集的花粉均匀的撒在培养液上，分别放在自然光条件下的4℃、15℃、25℃和35℃的条件下培养45分钟后观察实验结果。结果见表3。

表3不同培养温度对野葛花粉活力测定的影响

由表3可以看出，在4℃时花粉基本没有萌发，升高10℃左右后，萌发率达到35％，花粉管生长一致性为中等，当温度达到室温时，萌发率最高，达到79％，花粉管生长一致性也最高，当温度达到35℃较高温时，萌发率降低到12％，花粉管生长一致性也较低，可见此温度不适合花粉活力的测定。

(2)不同光照条件对野葛花粉活力测定的影响。

取三组14号培养液，将采集的花粉均匀的撒在培养液上，分别放在室温下的强光、自然光和黑暗条件下培养45分钟后观察实验结果。结果见表4。

表4不同光照条件对野葛花粉活力测定的影响

由表4可知，在强光条件下，花粉基本没有萌发，在自然光和黑暗条件下，花粉萌发率均达到80％左右，花粉管生长一致性也最高，无明显差别。

(3)不同培养时间对野葛花粉活力测定的影响

取三组14号培养液，将采集的花粉均匀的撒在培养液上，分别放在室温下的自然光条件下培养15、30、45、60、90分钟后观察实验结果。结果见表5。

由表5可知，在培养15分钟后，花粉开始萌发，但萌发率较低，花粉管生长一致性也不高，在培养30-60分钟期间，花粉萌发率平均达到77％左右，花粉管生长一致性也最高，此时适合花粉活力的测定，随着培养时间的延长，到90分钟时，花粉萌发率降到32％左右，花粉管生长一致性也降为中等，开始不适合花粉活力的测定。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种有效测定野葛花粉活力的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、制备培养液；所述的培养液由以下质量百分比的原料制备而成：蔗糖15％-20％、硼酸0.05％-0.1％、氯化钙0.05％-0.1％，水余量；

S2、花粉采集：于上午10点采集花粉，并将采集到的花粉装入无菌离心管中，避光保存；

S3、花粉培养：将滴有培养液的载玻片置于放有湿滤纸的圆形培养皿中，将采集的花粉均匀的撒在培养液上，在黑暗或自然光中培养30-60分钟；

S4、镜检，以花粉管长度达到花粉粒直径的2倍及以上视为萌发，计算萌发率。

2.如权利要求1所述的一种有效测定野葛花粉活力的方法，其特征在于，所述萌发率通过以下公式进行计算：

萌发率＝[(B1+B2+B3+B4+B5+B6+B7+B8)/A]×100％＝(B/A)×100％；

式中，A为圆形培养皿的面积，B1-B8为镜检时圆形培养皿均分成8个区域内的每个区域内花粉萌发的面积；B为8个区域中花粉萌发的面积之和。