CN107155445B - 一种提高低温保存后白背叶种子胚乳活力的方法 - Google Patents

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Abstract

一种提高低温保存后白背叶种子胚乳活力的方法，包括：将‑18℃至‑20℃低温保存的干燥种子连同存放种子的密闭容器取出；在温度为15℃、相对湿度15％的环境中放置24小时，取出种子；将种子放置在温度为45℃的培养箱中，热处理4‑6小时后取出。种子恢复到室温后放置于1％的琼脂培养基上，置于20℃培养间24小时；处理后的种子切破种皮及胚乳，浸泡于1％的氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液中，放置于30℃黑暗条件下48小时；取出浸泡后的种子切开观测胚乳染色情况，具有活力的胚乳显示均匀的红色。该方法显著提高了不同产地，低温下储存不同时间的白背叶种子的胚乳活力。解决了白背叶种子低温保藏后胚乳活力降低的问题。且处理方法简便易行，无任何危险性及毒副作用。

Description

一种提高低温保存后白背叶种子胚乳活力的方法
技术领域
本发明属于植物种质资源保存技术领域，具体地，涉及一种提高低温(-18℃至-20℃)保存后白背叶种子胚乳活力的方法。
背景技术
白背叶(Mallotus apelta(Lour.)Muell.Arg.)是大戟科(Euphorbiaceae)野桐属(Mallotus Lour.)落叶灌木或小乔木树种。常生长于南方各省平地丘陵的路旁和瘠薄干燥的光山或荒山上，适应性特别强，可用于防止土壤流失和生态恢复。春季嫩叶可掺合其他饲料喂猪，冬天可收集叶子制堆肥。茎皮为纤维性原料，织麻袋，供作混纺或作蜡纸及人造棉原料。白背叶的根、叶入药；叶具有清热利湿、止痛解毒和止血的功效,可用于治疗中耳炎、口疮、跌打损伤、湿疹、外伤出血等；根具有柔肝活血、健脾化湿、收敛固脱的作用，可用于治疗慢性肝炎、肝脾肿大、水肿等病症；同时也用于治疗胃痛呕水、外伤出血和皮肤湿痒等病。种子含油率达36％，含α-粗糠柴酸，可供制油漆，或合成大环香料、杀菌剂、润滑剂等原料，开发价值潜力巨大。白背叶在我国虽然分布较广，但是资源量较少，无论是硬枝扦插还是嫩枝扦插，其繁殖成活率都不高，只有30％左右。目前，白背叶栽培技术还不够成熟，未见规模化育苗报道，播种仍是主要繁殖技术之一，对白背叶种子储藏方面研究也未见报道。
将正常型种子干燥后低温(-18℃至-20℃)保藏可以极大的延长其寿命，这在国际上已经形成共识，并且基于这一理论建立了多个农作物及野生植物种子库；但一些植物的种子在冷藏后胚乳的活力会发生变化，而胚乳也是一种重要的种质资源，并且是天然的三倍体育种材料。因此提高及改善低温冷藏后种子胚乳的活力对于长期高效保存及合理利用植物种质资源有着重要的意义。
目前对种子进行活力检测的方法主要有萌发及氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法(也叫TZ染色法)。在保存实践中本发明发现冷藏后白背叶种子几乎不能萌发，对其进行TTC染色后发现，胚可以被染成红色，而胚乳不能染色；而未经冷藏种子的胚及胚乳都可被染成红色，且萌发率较高；因此本发明判断可能是由于胚乳在冷藏过程中发生某种变化而导致的活力下降，进而影响种子的整体活力及萌发率；为此发明了本发明的方法，用以提高胚乳的活力。胚乳活力的评价办法以TTC染色为主，辅以种子萌发率为参考，以保证实验结果的严谨性及可信度。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中在低温(-18℃至-20℃)保存一段时间后的白背叶种子胚乳活力大幅下降甚至几乎完全丧失的技术难题，提供一种简便高效提高低温保存后白背叶种子胚乳活力的方法。为实现该物种的长期有效保存，特别是胚乳这种天然的三倍体种质资源的长期有效保存及高效利用提供技术支持。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
一种提高低温保存后白背叶种子胚乳活力的方法，包括如下步骤：
(1)将在-18℃至-20℃冷藏保存后的种子连同其密闭容器取出，在温度为15℃、相对湿度15％的环境中放置24小时回温；
(2)将回温后的种子从密闭容器中取出，放置在温度为45℃的培养箱中，热处理4-6小时后取出；
(3)将步骤(2)处理后的种子取出，待种子温度恢复到室温后放置于1％的琼脂培养基上，放置于20℃培养间24小时；
(4)将上述步骤(3)处理后的种子切破种皮及胚乳；
(5)将上述步骤(4)处理后的种子浸泡于1％的氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液中，放置于30℃黑暗条件下48小时；
(6)将上述步骤(5)处理后的种子切开观测胚乳染色情况，具有活力的胚乳显示均匀的红色。
根据所述的一种提高低温保存后白背叶种子胚乳活力的方法，其中所述步骤(1)在-18℃至-20℃冷藏保存的种子是采集成熟饱满的种子，先将种子置于温度为15℃、相对湿度15％的环境中直到种子的平衡相对湿度达到15％(此时种子的含水量通常低于10％)，然后再将种子放入密闭容器中，保存于-18℃至-20℃。
本发明为一种提高低温保存后白背叶种子胚乳活力的方法，更具体的步骤是：
采集成熟饱满的种子，将种子置于温度为15℃、相对湿度15％的环境中，至种子的平衡相对湿度达到15％时，将种子放入密闭容器，保存于-18℃至-20℃中，以上为国际通用的正常型种子保存方法。种子保存一段时间后，将装有种子的密闭容器取出，在温度为15℃、相对湿度15％的环境中放置24小时回温；随后将种子从容器中取出，放置在培养箱温度为45℃的培养箱中，热处理4-6小时后取出，待种子温度恢复到室温后放置于1％的琼脂培养基上，放置于20℃培养间24小时；处理后的种子切破种皮及胚乳，浸泡于1％的氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液中，放置于30℃黑暗条件下48小时；取出种子切开观测胚乳染色情况，具有活力的胚乳显示均匀的红色。
具体实施方式
下面用本发明实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1：
1.材料和方法：
1.1研究材料：
2015年10月，云南红河州元阳县观音山采集成熟的新鲜白背叶(Mallotusapelta)种子。采集后运回昆明植物研究所西南野生生物种质资源库种子保藏中心。
1.2研究方法：
1.2.1干燥冷藏及冷藏后的回温：将1.1步骤采集到的种子置于15℃，15％相对湿度的干燥间中干燥。定期以Rotronic Ltd.公司生产的Hygrolab C1unit相对湿度测定仪结合同一公司生产的Rotronic HC 2-AW探头对种子相对湿度进行测定，待平衡相对湿度达到15％后装入密闭的容器中。2016年7月20日将装有种子的密闭容器放入-18℃至-20℃冷藏。冷藏处理7天后将装有种子的密闭容器取出。放入15℃，15％相对湿度的干燥间中24小时回温后打开装有种子的容器，根据实验需要随机取出相应数量的种子。
1.2.2实验设计：将种子分为3组处理，分别为未冷藏组、冷藏后无处理组和冷藏后热处理组；热处理温度设置为45℃，时间设置2、4、6、8、12及16个小时等六个梯度。每个处理3个重复，每个重复20粒种子。
1.2.3热处理方法：将种子放入培养箱，培养箱温度设定为45℃。处理2、4、6、8、12、16小时后随机取出60粒种子用于检测胚乳活力。对于处理4、8、16小时的种子，同时随机取出60粒做萌发实验，以萌发率佐证热处理对胚乳活力的影响。
1.2.4TTC染色：待热处理后的种子温度恢复到室温，将种子放置于1％的琼脂培养基上，放置于20℃培养间24小时；取出种子切破种皮及胚乳，并将种子浸泡于1％的氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液中，放置于30℃黑暗条件下48小时，染色完成后取出种子，用吸水纸吸干表面残余溶液，将种子切开，观测胚乳染色情况，具有活力的胚乳显示均匀的红色。
1.2.5萌发：对未经冷藏的种子，冷藏后未经处理的种子及冷藏后热处理4、8、16小时的种子进行萌发实验，以佐证胚乳活力变化。将种子用自来水搓洗后去除表面疏松含油结构，冲洗干净后吸干表面水分，播种于含有200毫克每升赤霉素的1％琼脂培养基上，将培养基装入透明自封袋中防止水分散失，然后置于于20℃的光照培养箱中，光照强度为1000勒克斯，光周期为12小时光照/12小时黑暗。每间隔2-3天检查一次萌发，胚根伸长超过5mm即认为种子萌发，将萌发种子取出，并记录萌发数量；实验开始4周后连续2周无萌发即结束实验。
1.2.6数据分析：利用SPSS16.0软件对胚乳染色比例数据进行分析，采用One-WayANOVA进行方差分析，并用S-N-K法对不同处理时间的染色比例做多重比较。
2.结果
2.1不同处理对采自云南元阳冷藏后的白背叶种子胚乳活力的影响：
表1不同处理对元阳白背叶种子胚乳染色率(％)及种子萌发率(％)的影响
Figure BDA0001292486120000041
注：数字为平均值±标准误
由表1可以看出，未经冷藏的种子胚乳染色率高达86.7％，对应的萌发率为55.0％；-20℃下冷藏7天后未经热处理的种子胚乳完全不能染色，对应的种子萌发率也为0；45℃处理2小时后胚乳染色比例即开始升高，4小时效果最好，胚乳染色率达到70％，此时对应的萌发率为31％，处理6小时开始下降，但8小时的染色比例仍有51.7％，萌发率为35％。以上结果表明，未经冷藏的白背叶种子胚乳活力高，萌发率也较高；而冷藏7天后的种子胚乳活力机会完全丧失且种子不能萌发；而热处理后种子胚乳活力及种子萌发率均得到显著的恢复。
由表2可以看出，处理4小时及6小时后胚乳活力最接近未经冷藏的种子，时间过长或过短都造成了活力的显著下降，因此我们认为以45℃处理4-6小时效果较好。
表2不同处理对胚乳染色率的S-N-K多重比较结果
Figure BDA0001292486120000042
Figure BDA0001292486120000051
综合以上数据分析结果，在45℃，处理4-6个小时可以有效提高低温冷藏(-18℃至-20℃)后的白背叶种子的胚乳活力。在具体实施例2及3中，本发明采用45℃处理6小时的方法。
实施例2：
1.材料和方法：
1.1研究材料：
2014年9月27日，安徽省黄山市休宁县岭南乡石川采集成熟的新鲜白背叶(Mallotus apelta)种子。采集后运回昆明植物研究所西南野生生物种质资源库种子保藏中心。
1.2研究方法：
1.2.1干燥冷藏及冷藏后的回温：将1.1采集到的种子置于15℃，15％相对湿度的干燥间中干燥。定期以Rotronic Ltd.公司生产的Hygrolab C1unit相对湿度测定仪结合同一公司生产的Rotronic HC 2-AW探头对种子相对湿度进行测定，待平衡相对湿度达到15％后装入密闭的容器中。2015年9月14日将装有种子的密闭容器放入-18℃至-20℃冷藏。冷藏10个月后将装有种子的容器取出。放入15℃，15％相对湿度的干燥间中24小时回温后打开装有种子的容器，根据实验需要随机取出相应数量的种子。
1.2.2实验设计：将种子分为2组处理，分别为对照组和热处理组；热处理温度设置45℃，处理6小时。每个处理3个重复，每个重复20粒种子。
1.2.3热处理方法：将种子放入培养箱，培养箱温度设定为45℃。处理6小时后取出60粒种子用于TTC染色实验。
1.2.4TTC染色：待热处理后的种子温度恢复到室温，将种子放置于1％的琼脂培养基上，放置于20℃培养间24小时；取出种子切破种皮及胚乳，并将种子浸泡于1％的氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液中，放置于30℃黑暗条件下48小时，染色完成后取出种子，用吸水纸吸干表面残余溶液，将种子切开，观测胚乳染色情况，具有活力的胚乳显示均匀的红色。
1.2.6数据分析：利用SPSS16.0软件对胚乳染色率数据进行分析，采用Paired-Samples T Test进行方差分析。
2.结果
2.1热处理对采自安徽休宁冷藏后白背叶种子胚乳活力的影响。
表3热处理对冷藏后安徽省休宁白背叶种子胚乳染色率(％)的影响
Figure BDA0001292486120000061
数字为平均值±标准误，不同字母表示不同处理间的胚乳染色率具有显著差异
由表3可以看出，-20℃下冷藏10个月的白背叶种子，未经热处理的种子胚乳染色率为13.3％；经45℃热处理后，胚乳染色率提高到85.0％，说明热处理有效提高的-20℃冷藏后的种子胚乳活力。
实施例3：
1.材料和方法：
1.1研究材料：
2008年10月15日，湖南省湘西自治州永顺县猛洞河采集成熟的新鲜白背叶(Mallotus apelta)种子。采集后运回昆明植物研究所西南野生生物种质资源库种子保藏中心。
1.2研究方法：
1.2.1干燥冷藏及冷藏后的回温：将1.1采集到的种子置于15℃，15％相对湿度的干燥间中干燥。定期以Rotronic Ltd.公司生产的Hygrolab C1unit相对湿度测定仪结合同一公司生产的Rotronic HC 2-AW探头对种子相对湿度进行测定，待平衡相对湿度达到15％后装入密闭的容器中。2012年4月将装有种子的密闭容器放入-18℃至-20℃冷藏。冷藏4年零3个月后(2016年7月)将装有种子的容器取出。放入15℃，15％相对湿度的干燥间中24小时回温后打开装有种子的容器，根据实验需要随机取出相应数量的种子。
1.2.2实验设计：将种子分为2组处理，分别为对照组和热处理组；热处理温度设置45℃，处理6小时。每个处理3个重复，每个重复20粒种子。
1.2.3热处理方法：将种子放入培养箱，培养箱温度设定为45℃。处理6小时后取出60粒种子用于TTC染色实验。
1.2.4TTC染色：待热处理后的种子温度恢复到室温，将种子放置于1％的琼脂培养基上，放置于20℃培养间24小时；取出种子切破种皮及胚乳，并将种子浸泡于1％的氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液中，放置于30℃黑暗条件下48小时，染色完成后取出种子，用吸水纸吸干表面残余溶液，将种子切开，观测胚乳染色情况，具有活力的胚乳显示均匀的红色。
1.2.6数据分析：利用SPSS16.0软件对胚乳染色率数据进行分析，采用Paired-Samples T Test进行方差分析。
2.结果与讨论
2.1热处理对湖南永顺冷藏后白背叶种子胚乳染色率的影响。
表4热处理对冷藏后湖南省永顺县白背叶种子胚乳染色率(％)的影响
Figure BDA0001292486120000071
数字为平均值±标准误，不同字母表示不同处理间的胚乳染色率具有显著差异
由表4可以看出，-20℃下冷藏4年零3个月的白背叶种子，未经热处理的种子胚乳染色率为0；经45℃热处理后，胚乳染色率达到了86.7％，活力得到显著提高。
3、本发明的积极效果如下：
与现有技术相比，本发明显著提高了不同产地(云南、安徽及湖南)，干燥后低温(-18℃至-20℃)下储存不同时间(7天、10个月及4年3个月)的白背叶种子胚乳的活力。较好的解决了白背叶种子低温保藏后胚乳活力降低的问题。且处理方法简便易行，对热处理时间要求不严格，45℃处理4-6个小时即有显著效果，而且无任何危险性及毒副作用。本发明有利于实现该物种在种子库条件下的长期保存，且对于胚乳这一天然三倍体种质资源的长期有效保存和合理利用提供了技术支持。

Claims (3)

1.一种提高低温保存后白背叶种子胚乳活力的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(1)将在-18℃至-20℃低温保存后的干燥种子连同储存种子的密闭容器取出，在温度为15℃，相对湿度15％的环境中放置24小时回温；
(2)将回温后的种子放置在温度为45℃的培养箱中，热处理4-6小时后取出；
(3)将步骤(2)处理后的种子取出，待种子温度恢复到室温后放置于1％的琼脂培养基上，放置于20℃培养间24小时；
(4)将上述步骤(3)处理后的种子切破种皮及胚乳；
(5)将上述步骤(4)处理后的种子浸泡于1％的氯化三苯基四氮唑溶液中，放置于30℃黑暗条件下48小时；
(6)将上述步骤(5)处理后的种子切开观测胚乳染色情况，具有活力的胚乳显示均匀的红色。
2.根据权利要求1所述的一种提高低温保存后白背叶种子胚乳活力的方法，其特征在于：所述步骤(1)在-18℃至-20℃冷藏保存的种子是采集成熟饱满的种子，先将种子置于温度为15℃、相对湿度15％的环境中直到种子的平衡相对湿度达到15％，此时种子含水量低于10％，然后再将种子放入密闭容器中，保存于-18℃至-20℃。
3.根据权利要求1所述的一种提高低温保存后白背叶种子胚乳活力的方法，其特征在于：该方法是采集成熟饱满的种子，将种子置于温度为15℃、相对湿度15％的环境中，至种子的平衡相对湿度达到15％时，将种子放入密闭容器，保存于-18℃至-20℃中；根据需要在一段时间后将装有种子的密闭容器取出，在温度为15℃、相对湿度15％的环境中放置24小时回温；随后将种子从容器中取出，放置在温度为45℃的培养箱中，热处理4-6小时后取出；将处理后的种子取出，待种子温度恢复到室温后放置于1％的琼脂培养基上，放置于20℃培养间24小时；处理后的种子切破种皮及胚乳，浸泡于1％的氯化三苯基四氮唑溶液中，放置于30℃黑暗条件下48小时；取出种子切开观测胚乳染色情况，具有活力的胚乳显示均匀的红色。
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