CN107409536B - 一种提高低温保存后四果野桐种子胚活力的方法 - Google Patents
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Abstract
一种提高低温保存后四果野桐种子胚活力的方法，包括：将‑18℃至‑20℃低温保存的干燥种子连同存放种子的密闭容器取出；在温度为15℃、相对湿度15％的环境中放置24小时，取出种子；将种子放置在温度为45℃的培养箱中，热处理6小时后取出。种子恢复到室温后放置于1％的琼脂培养基上，置于20℃培养间24小时；处理后的种子切破种皮及胚，浸泡于1％的氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液中，放置于30℃黑暗条件下48小时；取出浸泡后的种子切开观测胚染色情况，具有活力的胚显示均匀的红色。该方法显著提高了低温下储存了超过5年的四果野桐种子的胚活力。解决了四果野桐种子低温保藏后胚活力降低的问题。且处理方法简便易行，无任何危险性及毒副作用。
Description
技术领域
本发明属于植物种质资源保存技术领域，具体地，涉及一种提高低温(-18℃至-20℃)保存后四果野桐种子胚活力的方法。
背景技术
四果野桐(Mallotus tetracoccus(Roxb.)Kurz)是大戟科(Euphorbiaceae)野桐属(Mallotus Lour.)小乔木。产于云南南部和西藏，生于海拔500-1300米山谷林中。该种提取物具有一定的抗菌作用，目前未见四果野桐种子萌发及储藏方面研究报道。
将正常型种子干燥后低温(-18℃至-20℃)保藏可以极大的延长其寿命，这在国际上已经形成共识，并且基于这一理论建立了多个农作物及野生植物种子库；但一些植物的种子在冷藏后胚的活力会发生变化，从而导致种子活力下降，影响库存质量。因此提高及改善低温冷藏后种子胚的活力对于长期高效保存及合理利用植物种质资源有着重要的意义。
目前对种子进行活力检测的方法主要有萌发及氯化三苯基四氮唑(TTC)染色法(也叫TZ染色法)。在保存实践中本发明发现冷藏后四果野桐种子几乎不能萌发，对其进行TTC染色后发现，只有少数种子的胚可以染色，几乎全部种子的胚乳均不能染色；结合该属其他类群(如白背叶、白楸及尼泊尔野桐，均另案报道)种子冷藏前后胚及胚乳的染色情况及种子萌发情况，本发明判断可能是由于胚及胚乳在冷藏过程中发生某种变化而导致的活力下降，进而影响种子的整体活力及萌发率；为此发明了本发明的方法，用以提高胚的活力。对于该物种低温冷藏后的种子，目前尚无有效方法使其萌发，因此胚活力的评价采用TTC染色法。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中在低温(-18℃至-20℃)保存一段时间后的四果野桐种子胚活力大幅下降的技术难题，提供一种简便高效提高低温保存后四果野桐种子胚活力的方法。为实现该物种的长期有效保存及高效利用提供技术支持。
为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
一种提高低温保存后四果野桐种子胚活力的方法，包括如下步骤：
(1)将在-18℃至-20℃冷藏保存后的种子连同其密闭容器取出，在温度为15℃、相对湿度15％的环境中放置24小时回温；
(2)将回温后的种子从密闭容器中取出，放置在温度为45℃的培养箱中，热处理6小时后取出；
(3)将步骤(2)处理后的种子取出，待种子温度恢复到室温后放置于1％的琼脂培养基上，放置于20℃培养间24小时；
(4)将上述步骤(3)处理后的种子切破种皮及胚乳；
(5)将上述步骤(4)处理后的种子浸泡于1％的氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液中，放置于30℃黑暗条件下48小时；
(6)将上述步骤(5)处理后的种子切开观测胚染色情况，具有活力的胚显示均匀的红色。
根据所述的一种提高低温保存后四果野桐种子胚活力的方法，其中所述步骤(1)在-18℃至-20℃冷藏保存的种子是采集成熟饱满的种子，先将种子置于温度为15℃、相对湿度15％的环境中直到种子的平衡相对湿度达到15％(此时种子的含水量通常低于10％)，然后再将种子放入密闭容器中，保存于-18℃至-20℃。
本发明为一种提高低温保存后四果野桐种子胚活力的方法，更具体的步骤是：
采集成熟饱满的种子，将种子置于温度为15℃、相对湿度15％的环境中，至种子的平衡相对湿度达到15％时，将种子放入密闭容器，保存于-18℃至-20℃中，以上为国际通用的正常型种子保存方法。种子保存一段时间后，将装有种子的密闭容器取出，在温度为15℃、相对湿度15％的环境中放置24小时回温；随后将种子从容器中取出，放置在培养箱温度为45℃的培养箱中，热处理6小时后取出，待种子温度恢复到室温后放置于1％的琼脂培养基上，放置于20℃培养间24小时；处理后的种子切破种皮及胚乳，浸泡于1％的氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液中，放置于30℃黑暗条件下48小时；取出种子切开观测胚染色情况，具有活力的胚显示均匀的红色。
具体实施方式
下面用本发明实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明。
实施例1：
1.材料和方法：
1.1研究材料：
2008年10月，云南省玉溪市新平县水塘镇采集成熟的新鲜四果野桐(Mallotustetracoccus)种子。采集后运回昆明植物研究所西南野生生物种质资源库种子保藏中心。
1.2研究方法：
1.2.1干燥冷藏及冷藏后的回温：将1.1步骤采集到的种子置于15℃，15％相对湿度的干燥间中干燥。定期以Rotronic Ltd.公司生产的Hygrolab C1unit相对湿度测定仪结合同一公司生产的Rotronic HC 2-AW探头对种子相对湿度进行测定，待平衡相对湿度达到15％后装入密闭的容器中。2011年8月23日将装有种子的密闭容器放入-18℃至-20℃冷藏。冷藏处理5年4个月后将装有种子的密闭容器取出。放入15℃，15％相对湿度的干燥间中24小时回温后打开装有种子的容器，根据实验需要随机取出相应数量的种子。
1.2.2实验设计：将种子分为2组处理，分别为对照组(冷藏后无处理组)和冷藏后热处理组；热处理温度设置为45、60和70℃，时间设置6个小时。每个处理3个重复，每个重复20粒种子。
1.2.3热处理方法：将种子放入培养箱，培养箱温度设定为45、60和70℃。处理6小时后随机取出60粒种子用于检测胚活力。
1.2.4TTC染色：待热处理后的种子温度恢复到室温，将种子放置于1％的琼脂培养基上，放置于20℃培养间24小时；取出种子切破种皮及胚乳，并将种子浸泡于1％的氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液中，放置于30℃黑暗条件下48小时，染色完成后取出种子，用吸水纸吸干表面残余溶液，将种子切开，观测胚染色情况，具有活力的胚乳显示均匀的红色。
1.2.5数据分析：利用SPSS16.0软件对胚染色比例数据进行分析，采用One-WayANOVA进行方差分析，并用S-N-K法对不同处理时间的染色比例做多重比较。
2.结果
2.1热处理对采自云南玉溪冷藏后的四果野桐种子胚活力的影响：
表1不同温度热处理对冷藏后云南玉溪四果野桐种子胚染色率(％)的影响
注：数字为平均值±标准误，不同字母表示不同处理间的胚染色率具有显著差异
由表1可以看出，-20℃下冷藏5年4个月的四果野桐种子，未经热处理的种子胚染色率为23.3％；经45℃热处理6小时后，胚染色率提高到63.3％；60℃及70℃处理6小时后，胚染色率约在40％左右，显著低于45℃，但仍显著高于对照；说明热处理有效提高了-20℃冷藏后的种子胚活力。综合能耗及效果，45℃处理6小时是节能有效的处理方式。
3、本发明的积极效果如下：
由于目前尚无有效萌发四果野桐种子的方法，无法以萌发率进行佐证；但参考该属其他种类(如白背叶、尼泊尔野桐及白楸)的情况，热处理均有效提高了这三种野桐属植物种子胚乳的活力以及种子的萌发率；且这三种植物的种子胚乳染色的变化规律与该种胚染色的变化规律一致。因此本发明认为与现有技术相比，本发明有效提高了采自云南玉溪干燥后低温(-18℃至-20℃)下储存5年4个月的四果野桐种子胚的活力。较好的解决了四果野桐种子低温保藏后胚活力大幅下降的问题，后续可尝试采用活力提高的胚进行离体培养的方法得到新的植株，从而实现该种种质资源在低温储藏后的成功扩繁。
Claims (3)
1.一种提高低温保存后四果野桐种子胚活力的方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
(1)将在-18℃至-20℃低温保存后的干燥种子连同储存种子的密闭容器取出，在温度为15℃，相对湿度15％的环境中放置24小时回温；
(2)将回温后的种子放置在温度为45℃的培养箱中，热处理6小时后取出；
(3)将步骤(2)处理后的种子取出，待种子温度恢复到室温后放置于1％的琼脂培养基上，放置于20℃培养间24小时；
(4)将上述步骤(3)处理后的种子切破种皮及胚；
(5)将上述步骤(4)处理后的种子浸泡于1％的氯化三苯基四氮唑溶液中，放置于30℃黑暗条件下48小时；
(6)将上述步骤(5)处理后的种子切开观测胚染色情况，具有活力的胚显示均匀的红色。
2.根据权利要求1所述的一种提高低温保存后四果野桐种子胚活力的方法，其特征在于：所述步骤(1)在-18℃至-20℃冷藏保存的种子是采集成熟饱满的种子，先将种子置于温度为15℃、相对湿度15％的环境中直到种子的平衡相对湿度达到15％，种子含水量低于10％时，再将种子放入密闭容器中，保存于-18℃至-20℃。
3.根据权利要求1所述的一种提高低温保存后四果野桐种子胚活力的方法，其特征在于：该方法是采集成熟饱满的种子，将种子置于温度为15℃、相对湿度15％的环境中，至种子的平衡相对湿度达到15％时，将种子放入密闭容器，保存于-18℃至-20℃中；根据需要在一段时间后将装有种子的密闭容器取出，在温度为15℃、相对湿度15％的环境中放置24小时；随后将种子从容器中取出，放置在温度为45℃的培养箱中，热处理6小时后，将处理后的种子取出，待种子温度恢复到室温后放置于1％的琼脂培养基上，放置于20℃培养间24小时；处理后的种子切破种皮及胚，浸泡于1％的氯化三苯基四氮唑溶液中，放置于30℃黑暗条件下48小时；取出种子切开观测胚染色情况，具有活力的胚显示均匀的红色。
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