CN105766653B - 利用虎杖叶片培养制备含有白藜芦醇根系的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明是提供一种利用虎杖叶片培养制备含有白藜芦醇根系的方法；其是利用虎杖叶片及其愈伤组织直接获取不定根和毛状根，再以此不定根和毛状根为原料从中提取白藜芦醇，其包括以下步骤：（1）制备无菌虎杖苗：(2)制虎杖不同外植体愈伤组织：（3）虎杖愈伤组织直接分化生根：即得虎杖根系，进而提供一种替代野生虎杖资源的新途径。

Description

利用虎杖叶片培养制备含有白藜芦醇根系的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种利用虎杖叶片培养直接获取大量根系的方法，特别是利用虎杖叶片培养制备含有白藜芦醇根系的方法。
背景技术：
虎杖（Polygonum cuspidatum）为蓼科植物，白藜芦醇是其主要的活性成份。白藜芦醇（resveratrol）是一种具有多种生物活性的非黄酮类多酚化合物，是植物受到外界刺激而产生的一种植物抗毒素，主要存在于虎杖、葡萄、花生等植物中，且在虎杖根茎中含量最高。白藜芦醇不仅能提高植物的抗病性，还具有多种有益于人类健康的药理作用，主要包括：抗氧化、抗肿瘤、抗炎抗菌、抗衰老、预防心血管疾病、雌激素作用、保护肝脏等，而且它在抑制癌细胞增殖的同时，还对正常细胞的存活具有促进作用，被认为是最有希望的天然化学防癌剂之一。因此，不仅能用医药市场和保健品市场，还能用于化妆品市场，需求量大。
目前，白藜芦醇的主要来源仍然是从野生虎杖的根茎中提取，为了防止虎杖资源被过度采挖，利用生物技术如组织培养、生物转化和转基因等技术来生产白藜芦醇的研究，是当前研究的热点。如，王丹丹等利用虎杖悬浮细胞的培养来获取白藜芦醇；洪汉君等研究了利用发根农杆菌诱导虎杖毛状根来获取白藜芦醇的方法。因为，白藜芦醇主要存在于虎杖的根茎中，因而，利用生物技术获得的虎杖不定根中白藜芦醇含量很可能会比虎杖愈伤组织及悬浮细胞中要高。又因为，毛状根的产生是由发根农杆菌生根质粒的一段T-DNA整合到了植物外植体的细胞核基因组中而产生的，因而这种方法获得的毛状根是一种转基因的产物，与当前人们追求纯天然非转基因的消费理念不符。
而如何来利用虎杖叶片组织培养获得大量不定根或毛状根，从而利用该不定根或毛状根来获取白藜芦醇，不仅最大限度地利用和保护了虎杖野生资源，也符合人们追求天然绿色环保的理念，且生根方法简便高效，从而实现一种解决虎杖短期内大量产根系的问题。
发明内容：
本发明是提供一种利用虎杖叶片培养制备含有白藜芦醇根系的方法；其是利用虎杖叶片及其愈伤组织直接获取不定根和毛状根，再以此不定根和毛状根为原料从中提取白藜芦醇，进而提供一种替代野生虎杖资源的新途径。
为了实现以上的发明目的，本发明采用以下技术方案，一种利用虎杖叶片培养制备含有白藜芦醇根系的方法，是利用虎杖叶片和/或虎杖愈伤组织直接培养生长出根系，其包括以下步骤：
（1）制备无菌虎杖苗：将野生虎杖切成带节幼嫩茎段，消毒、经快繁及壮苗培养，得无菌虎杖苗；
(2)制虎杖不同外植体愈伤组织：将上步的无菌虎杖苗的叶片、叶柄和茎段切碎，置于虎杖愈伤组织诱导培养基中培养，控制培养温度为22-28℃，培养时间20-28天，形成虎杖不同外植体愈伤组织；
（3）虎杖愈伤组织直接分化生根：将虎杖不同外植体愈伤组织在和（2）步相同的培养基或分化培养基，及和（2）步其余相同的培养条件下继续培养10-55天，即得虎杖根系。
优选所述步骤（1）中所述快繁培养的培养基的各组分组成为MS， 6-BA 1.0-3.0mg/L ，IBA 0.1-0.3mg/L ， 蔗糖20-40g/L ， 琼脂5-9g/L；所述壮苗培养的培养基各组分组成为1/2MS， IBA 0.2-0.8mg/L ， 蔗糖 20-40g/L ， 琼脂5-9g/L，pH值均为5.5-6.1。
所述步骤（2）中所述的虎杖不同外植体是控制叶片为直径0.3-0.8cm的小圆盘，控制茎段和叶柄的长度为0.3-0.8cm。
本发明所述虎杖愈伤组织诱导培养基和分化培养基的各组分组成为MS ， NAA1.0-4.0mg/L ， KT 0.1-0.5 mg/L ， 蔗糖25-35g/L ， 琼脂5.5-7.5g/，控制pH值均为5.5-6.0。
本发明进一步优选所述虎杖愈伤组织诱导培养基和分化培养基的各组分组成为MS ，NAA 2.3 mg/L ，KT 0.1mg/L ， 蔗糖30g/L ， 琼脂7g/L。
本发明所述培养优选采用黑暗条件下培养；所述根系为不定根和/或毛状根。
本发明所述培养基优选于121℃温度下灭菌处理15-20分钟。
本发明利用所述的虎杖叶及其愈伤组织生的根提取白藜芦醇的方法，其以虎杖叶及其愈伤组织生的根为原料，将虎杖叶及其愈伤组织生的根剪下，用水洗净，除去表面水分，将虎杖根，捣碎研磨成匀浆后置于容器瓶中，加入85-90Wt%的乙醇，利用超声波于45-55℃温度下，提取20-40min后，减压抽虑得到澄清的提取液，蒸发浓缩干，控制蒸发浓缩温度为45-55℃，再加入甲醇超声溶解，然后用0.45μm的有机滤膜过滤即得白藜芦醇粗提溶液。
利用本发明方法制备的白藜芦醇粗提溶液采用HPLC法，即高效液相法，测定本发明方法制备的虎杖不定根及毛状根中白藜芦醇的含量。
本发明中的培养基、专业术语及统计方法说明：
MS基本培养基是目前植物组织培养领域普遍使用的基本培养基，在组织培养方面的教科书和实验指导手册中均可获得其配方；1/2MS基本培养基是MS基本培养基中大量元素减半，其他成分含量不变的培养基；
本发明中所述的激素为6-BA（6-苄氨基嘌呤），IBA（吲哚丁酸），NAA（萘乙酸），KT（激动素）；
单位面积叶片所获的不定根鲜重=不定根鲜重/叶片面积；不定根生根率=生根外植体数/接种外植体数×100%；
本发明中所述的根系是指不定根和毛状根。
本发明的积极效果体现在：
（1）本发明方法制备的获得的虎杖根系即不定根和毛状根为非转基因产物，与转基因产物毛状根相比，更为安全和天然绿色；
（2）本发明利用虎杖叶等少量外植体即可获得大量虎杖根系即不定根及毛状根等，经检测平均每cm2的叶片所能获得的不定根鲜重的产量可达0.763g，且其根系中白藜芦醇的含量是相同条件下愈伤组织的6.7倍；
（3）本发明中愈伤组织生根的培养条件与愈伤组织诱导的条件一样，均为暗培养，且中间不需要更换培养基，极大的简便了操作，降低了人力物力的消耗，适于工业化生产；
（4）本发明叶片从愈伤组织诱导开始到不定根生长量达到最大，只需要55天左右，比野外生长周期要短的多，而且不受季节气候和土地等因素的影响，根的产量和质量稳定可控。
附图说明：
图1 、本发明利用虎杖叶片及其愈伤组织培养55d后根状的生长状态图；
图2、 白藜芦醇标准品的HPLC图，
图3、 本发明利用虎杖叶片及其愈伤组织培养生的根系提取的含白藜芦醇溶液的HPLC图；
说明，图2、3中HPLC图中的峰值相对应处即为白藜芦醇。
具体实施方式：下面结合实施例对本发明方法作进一步的详细说明，下述实施方案中使用质量份或质量百分比。
实施例1
（1）、制备无菌虎杖苗，
A、外植体消毒：切取野生虎杖带节幼嫩茎段，先进行消毒，即先用流水清洗干净后，在超净工作环境中用75%的酒精浸润15秒后，用0.1%升汞浸泡4-5min，再用无菌水漂洗5次，用无菌滤纸吸干水分即可用于接种的外植体；
B、外植体的快繁培养：将上步消毒后的外植体接种于分化快繁培养基：MS +6-BA2.0mg/L+IBA0.2mg/L +蔗糖30g/L + 琼脂7g/L，pH值为5.8，培养基均在121℃下灭菌15-20分钟；光照条件为：光强3000lx、光照时间14h/d，培养温度为：25℃±1℃；
C、壮苗培养：将经分化快繁培养获得的虎杖幼苗接种与壮苗培养基：1/2MS +IBA0.5mg/L + 蔗糖30g/L + 琼脂7g/L，pH值为5.8，其他培养条件同快繁培养。培养20-25天后，即可获得健壮完整的无菌虎杖苗。
（2）、制虎杖不同外植体愈伤组织即叶片虎杖愈伤组织的诱导：将无菌虎杖苗的叶片用灭菌后的打孔器压为直径为0.6cm的小圆盘，并接种于虎杖愈伤组织诱导培养基：MS +NAA1.5mg/L+KT0.2mg/L +蔗糖30g/L + 琼脂7g/L，pH值为5.8，并于温度为25±1℃，黑暗条件下培养，培养25天后愈伤组织完全形成，即虎杖不同外植体愈伤组织。
（3）、虎杖不同外植体愈伤组织即叶片虎杖愈伤组织直接分化产生不定根和毛状根：将虎杖不同外植体愈伤组织，在（2）步的原条件下继续培养5天，即愈伤组织诱导培养的第30天后，愈伤组织周围开始长出大量的不定根毛和毛状根，且控制条件可使不定根的生根率达100%，继续培养后不定根逐渐长粗长长，在不定根长出的第25天，即叶片培养到第55天，可获得最大鲜重的不定根和毛状根如图1所示，经计算后单位面积的叶片可获得不定根的平均鲜重为0.763g/cm2。
（4）、虎杖不定根中白藜芦醇的提取：将不定根剪下后，用水洗净，并用滤纸吸干表面的水分，精确称取虎杖不定根2g，用研钵捣碎研磨成匀浆后转移到100mL的锥形瓶中，加入85%的乙醇20mL，超声波50℃提取30min后，减压抽虑得到澄清的提取液，再用旋转蒸发仪50℃浓缩至干，加入1mL甲醇超声溶解，并用0.45μm的有机滤膜过滤即得供试品溶液，置于4℃保存备用。
（5）虎杖不定根中白藜芦醇含量的HPLC法测定
色谱条件：白藜芦醇的含量使用安捷伦1200系列液相色谱系统测定。色谱柱为C18(150 mm×4.6 mm)，流动相采用甲醇-重蒸水（35:65）混合溶剂，流速为0.8mL/min，检测波长为306nm，每次进样10μL，柱温为30℃ ；
白藜芦醇标准曲线的制定：精确称取白藜芦醇标准品10mg，用甲醇溶解并定容至100mL，得到浓度为100μg /mL的对照品溶液，分别吸取该溶液1、2、3、4、5、6、7mL，并定容至50mL，即得浓度分别为2、4、6、8、10、12、14μg /mL的对照品溶液。依次取10μL进样后如图2所示，以测得的白藜芦醇峰的峰面积(y)为纵坐标，以白藜芦醇浓度(x)为横坐标进行线性回归，即得到回归方程；
不定根中白藜芦醇含量的测定：精密吸取供试品溶液10μL，按与标准品溶液相同的色谱条件进样，如图3所示,根据峰面积与回归方程，经计算利用本发明方法制备的供试品溶液中白藜芦醇的平均含量为13.94μg /g。
对比例1
改变诱导虎杖愈伤组织的外植体来源，其他条件均与实施例1中一致，测定外植体来源对不定根产生的影响，结果见下表1：
说明：由上表1可知，外植体来源对愈伤组织直接分化生成不定根有很大影响，而且以叶片作为外植体生根率最高。
对比例2
改变愈伤组织诱导及分化生根培养的光照条件，以叶片作为外植体，其他条件与实施例1一致，测定光照条件对不定根产生的影响，结果见下表2：
光照条件 接种外植体数 生根外植体数 生根率
黑暗 60 60 100%
光照强度1000lx 60 28 46.7%
光照强度3000lx 60 2 3.3%
说明：由上表2可知，愈伤组织诱导及分化生根培养的光照条件对不定根的产生有很大影响，黑暗培养最有利于不定根的形成。

Claims (3)

1.一种利用虎杖叶片培养制备含有白藜芦醇根系的方法，是利用虎杖叶片和/或虎杖愈伤组织直接培养生长出根系，其包括以下步骤：
（1）制备无菌虎杖苗：将野生虎杖切成带节幼嫩茎段，消毒、经快繁及壮苗培养，得无菌虎杖苗；
(2)制虎杖不同外植体愈伤组织：将上步的无菌虎杖苗的叶片切碎，置于虎杖愈伤组织诱导培养基中培养，控制培养温度为22-28℃，培养时间20-28天，形成虎杖不同外植体愈伤组织；
（3）虎杖愈伤组织直接分化生根：将虎杖不同外植体愈伤组织在和（2）步相同的培养基或分化培养基，及和（2）步其余相同的培养条件下继续培养10-55天，即得虎杖根系；
（1）中所述快繁培养的培养基的各组分组成为MS， 6-BA 1.0-3.0mg/L ，IBA 0.1-0.3mg/L ， 蔗糖20-40g/L ， 琼脂5-9g/L；所述壮苗培养的培养基各组分组成为1/2MS，IBA 0.2-0.8mg/L ， 蔗糖 20-40g/L ， 琼脂5-9g/L，pH值均为5.5-6.1；
步骤（2）中所述的虎杖不同外植体是控制叶片为直径0.3-0.8cm的小圆盘；
所述虎杖愈伤组织诱导培养基和分化培养基的各组分组成为MS ， NAA 1.0-4.0mg/L， KT 0.1-0.5 mg/L ， 蔗糖25-35g/L ， 琼脂5.5-7.5g/，控制pH值均为5.5-6.0；
所述培养采用黑暗条件下培养；所述根系为不定根和/或毛状根。
2.依据权利要求1所述的利用虎杖叶片培养制备含有白藜芦醇根系的方法，其特征是所述虎杖愈伤组织诱导培养基和分化培养基的各组分组成为MS ，NAA 2.3 mg/L ，KT0.1mg/L ， 蔗糖30g/L ， 琼脂7g/L。
3.依据权利要求1所述的利用虎杖叶片培养制备含有白藜芦醇根系的方法，其特征是所述培养基于121℃温度下灭菌处理15-20分钟。
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