CN101352147A

CN101352147A - 含太子参环肽b组培苗的培养方法

Info

Publication number: CN101352147A
Application number: CNA2008100589006A
Authority: CN
Inventors: 朱宏涛; 许文彦; 张颖君; 谭宁华; 唐军
Original assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Current assignee: Kunming Institute of Botany of CAS
Priority date: 2008-09-11
Filing date: 2008-09-11
Publication date: 2009-01-28

Abstract

本发明基于太子参环肽B在植物体内分布的特点及其在药理方面的活性，提供一种含有效成分太子参环肽B组培苗的培养方法，包括太子参丛生芽的诱导、培养和太子参组培苗培养系的建立及太子参环肽B含量测定，还可进一步包括太子参不定根的液体培养与太子参环肽B含量测定。本方法简便易行，太子参组培苗、不定根生物量生长快，太子参环肽B含量高，是获取大量高含量太子参环肽B的太子参材料的有效途径。

Description

含太子参环肽B组培苗的培养方法

技术领域：

本发明涉及植物生物技术领域，尤其涉及一种含太子参环肽B组培苗的培养方法。

组织培养是指在人工控制的条件下，把植物体的一个器官、一种组织、单个细胞或离体胚等置于盛有一定培养基的容器中进行生长分化的一种培养方法。组织培养技术克服了整体植物研究中的困难，一方面是由于所用的培养材料是离体的，取自植物体的一部分，减少了整体植物中复杂的相互关系；另一方面，在人工控制条件下，人们可以有意识地去选择和设置一些能引起某种生理变化的因素进行处理，以便探索离体培养下组织和细胞发展变化的规律。植物组织培养是一种很有潜力的新兴生物技术。

太子参[Pseudostellaria heterophylla(Miq.)Pax ex Pax etHoffm.]系石竹科(Caryophyllaceae)假繁缕属(Pseudostellaria)植物。又名异叶假繁缕，孩儿参等。被《中华人民共和国药典》2005年版收载。太子参以块根入药，是一种珍贵的中药材。性平；味甘，微苦。归脾、肺经。益气健脾，生津润肺。用于脾虚体倦，食欲不振，病后虚弱，气阴不足，自汗口渴，肺燥干咳。

太子参的化学成分主要包括环肽类如太子参环肽A-H等；苷类如太子参皂苷、尖叶丝石竹皂苷等；糖类如蔗糖、麦芽糖、α-槐糖等；氨基酸类如赖氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、蛋氨酸等；油脂类如甘油单硬脂酸酯、磷脂酰基醇等；挥发油等。其中，环肽成分是中药太子参的特征和主要成分，而太子参环肽B(Heterophyllin B，HB)尤是其商品药材中的共有成分，可作为太子参药材质量控制的化学成分。目前已开发的以太子参为原料的保健产品有复方太子参口服液、太子参胶囊、太子参止咳平喘精(散)、太子宝、真空膨化太子参等系列产品。原料药材市场需求量逐年加大，药材价格也随之攀升，致使野生资源采挖过度，日趋减少，进一步发展道地太子参药材生产迫在眉睫。但是太子参生长过程中很容易被多种病虫害侵袭，最终影响太子参栽培药材的产量和品质，使太子参的栽培规模难以扩大。采用组织培养方法，对植物体进行脱毒并提高太子参有效成分太子参环肽B的含量是解决目前资源匮乏的有效途径之一。

现有技术目前尚无专门针对太子参环肽B含量提高的组织培养技术的文献报道和应用，而报道过的方法仅是针对繁殖系数和生物量提高的一些培养方法。这些方法存在着不定根诱导步骤复杂，需经过外植体到愈伤组织再到不定根的复杂步骤；愈伤组织诱导率低，扩繁速度慢，诱导不定根的材料受限；植物通过愈伤组织后形成的培养系不稳定；激素使用复杂，不定根诱导时间过长，以及太子参有效成分含量不明确导致产品质量低等缺陷。

发明内容：

本发明的目的在于针对现有技术存在的不足，基于太子参环肽B在植物体内分布的特点及其在药理方面的活性，提供一种含有效成分太子参环肽B组培苗的培养方法，此方法简便易行，太子参组培苗及不定根生物量提高快，太子参环肽B含量高，是获取大量含高含量太子参环肽B的太子参材料的有效方法。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下的技术方案：

含太子参环肽B组培苗的培养方法，包括以下步骤

(1)太子参丛生芽的诱导、培养：取太子参幼枝，经洗涤消毒后，无菌显微条件下剥离茎尖的叶片，取带有生长点的茎尖置于丛生芽培养基中培养；

(2)太子参组培苗培养系的建立及太子参环肽B含量测定：将步骤(1)所得丛生芽近顶端部分切成0.8-1.0cm带节间的外植体置于生根培养基内，20-25℃条件下光照培养诱导生根，生根后继续培养，并对太子参环肽B的含量进行测定。

上述的培养方法，还可以进一步包括以下第(3)步骤：

(3)太子参不定根的液体培养与太子参环肽B含量测定：将太子参组培苗中诱导初出的不定根用解剖刀切下，用无菌蒸馏水洗去不定不定根表面的培养基，在无菌条件下称取0.5g置于液体培养基中，在100-130r/min的旋转震荡器中悬浮扩大培养；并进行太子参环肽B含量分析。

本发明具体的方法如下：

步骤(1)中所采用的消毒方法为：太子参幼枝用自来水清洗3-5遍，置于肥皂液中浸泡1小时后再用流水冲洗1-2小时，取出用无菌滤纸吸干表面水分，用75％的乙醇浸泡消毒20-40秒，然后用无菌水冲洗3次，吸干表面水分后置于10％的过氧化氢溶液中浸泡13分钟，取出后用无菌蒸馏水冲洗6次，吸干表面水分并在无菌显微条件下进行茎尖剥离后置于丛生芽诱导培养基MS+6-卞基氨基嘌呤(6-BA)1.5mg/L中培养，灭菌前培养基PH值精密调至6.5。

步骤(2)是将步骤(1)中所得的丛生芽置于MS固体培养基中分别加入奈乙酸(NAA)0.1-2.0mg/L、吲哚乙酸(IAA)0.1-3.0mg/L、吲哚丁酸(IBA)0.1-4.0mg/L、6-糠基氨基嘌呤(KT)0.1-2.0mg/L、6-卞基氨基嘌呤(6-BA)0.1-1.0mg/L、脱落酸(ABA)0.1-1.0mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.5-1.5mg/L中的-种或几种植物激素所配制的培养基中进行不定根的诱导；灭菌前培养基PH值精密调至6.5；太子参组培苗中太子参环肽B的含量用高效液相色谱(HPLC)测定，条件如下：安捷伦生产的Agilent 1100series；色谱柱为AgilentZORBAX SB-C18，5μm，4.6×150mm；柱温：30℃；流动相为水∶乙腈＝73∶27；流动相流速：1ml/min；检测波长：192nm；HB的保留时间(RT)为14.003min；总环肽溶液进样后收取14min的吸收峰进行FAB-质谱分析，得到分子量为777的[M-1]^-峰，证明为HB[M＝778]。

将步骤(1)中所得的丛生芽置于MS固体培养基中分别加入奈乙酸(NAA)0.1-2.0mg/L、吲哚乙酸(IAA)0.1-3.0mg/L、吲哚丁酸(IBA)0.1-4.0mg/L、6-糠基氨基嘌呤(KT)0.1-2.0mg/L、6-卞基氨基嘌呤(6-BA)0.1-1.0mg/L、脱落酸(ABA)0.1-1.0mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.5-1.5mg/L中的一种和几种植物激素所配制的培养基NAA或NAA+IBA或NAA+IBA+2.4-D或NAA+IBA+ABA或NAA+IBA+6-BA或NAA+IAA+6-BA或NAA+IBA+IAA+KT或NAA+IBA+IAA+KT+6-BA中进行不定根的诱导。

步骤(3)是将步骤(2)中丛生芽直接诱导出的HB含量较高即不低于850.31μg/g组培苗干重的不定根从组培苗中切下，洗去培养基后精密称量0.5g接种到含有奈乙酸(NAA)0.1-2.0mg/L、吲哚丁酸(IBA)0.1-4.0mg/L、6-卞基氨基嘌呤(6-BA)0.1-1.0mg/L的1/2MS液体培养基中，悬浮扩大培养，其含量测定方法同权利要求3中步骤(2)。

其中上述所有步骤太子参环肽B含量分析采用Excel软件进行分析评价。

与现有技术相比较，本发明的优异性在于：本发明不定根诱导步骤简化，只需经过外植体至不定根的步骤；不定根的诱导率高、诱导时间短，生物量生长快，培养系稳定，太子参环肽B含量较高；诱导与培养方法简单、效率高，其中太子参生长点诱导成苗率在97％以上，丛生芽诱导不定根的生根率大于99％；本发明太子参组培苗生物量增长快，不定根生长迅速，太子参环肽B含量高。

具体实施方式：

下面对本发明的实施例作详细说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围并不以此为限。

实施例1：

取太子参[Pseudostellaria heterophylla(Miq.)Pax ex Pax etHoffm.]幼枝，用自来水清洗3-5遍，置于肥皂液中浸泡1小时后再用流水冲洗1-2小时。取出用无菌滤纸吸干表面水分，用75％的乙醇浸泡消毒20-40秒，然后用无菌水冲洗3次，吸干表面水分后置于0.1％的氯化汞溶液中浸泡20分钟，取出后用无菌蒸馏水冲洗6次，吸干表面水分并在无菌显微条件下进行茎尖剥离。无菌显微条件下剥离茎尖的叶片，取带有生长点的茎尖置于丛生芽诱导培养基MS+6-卞基氨基嘌呤(6-BA)1.5mg/L(灭菌前培养基PH值精密调至6.5)中培养。

将步骤(1)所得丛生芽用解剖刀将近顶端部分切成0.8-1.0cm带节间的外植体，将外植体的生物学下端插入特制MS固体培养基(MS+NAA1.5mg/L，灭菌前培养基PH值精密调至6.5)中进行不定根的诱导。每瓶插5苗，置于距30W日光灯35cm的培养架中光照培养。培养7d时外植体开始生根，其生根率大于99％。培养60d时对该组培苗进行收获，平均每瓶太子参组培苗的干重为0.405g是接种量的40.5倍。

太子参组培苗中太子参环肽B的含量用高效液相色谱(HPLC)测定，条件如下：安捷伦生产的Agilent 1100series；色谱柱为AgilentZORBAX SB-C18，5μm，4.6×150mm；柱温：30℃；流动相为水∶乙腈＝73∶27；流动相流速：1ml/min；检测波长：192nm。HB的保留时间(RT)为14.003分钟。总环肽溶液进样后收取14分钟的吸收峰进行FAB-质谱分析，得到分子量为777的[M-1]^-峰，证明为HB[M＝778]。

经HPLC分析，得出该条件下诱导培养的太子参组培苗中太子参环肽B的含量为492.33μg/g组培苗干重。

实施例2：

先按实施例1的方法步骤(1)获得丛生芽，然后用解剖刀将丛生芽近顶端部分切成0.8-1.0cm带节间的外植体，将外植体的生物学下端插入特制MS固体培养基中(MS+NAA0.8mg/L+IBA0.5mg/L)，每瓶插5苗，置于距30W日光灯35cm的培养架中光照培养。培养7d时外植体开始生根，其生根率大于99％。培养60d时对该组培苗进行收获，平均每瓶太子参组培苗的干重为0.25g是接种量的25倍。再进行HPLC分析(所用方法与实施例1相同)，得出该条件下诱导培养的太子参组培苗中太子参环肽B的含量为170.07μg/g组培苗干重。

实施例3：

先按实施例1的方法步骤(1)获得丛生芽，然后用解剖刀将丛生芽近顶端部分切成0.8-1.0cm带节间的外植体，将外植体的生物学下端插入特制MS固体培养基中(MS+NAA0.8mg/L+IBA0.5mg/L+2，4-D1.0mg/L)，每瓶插5苗，置于距30W日光灯35cm的培养架中光照培养。培养7d时外植体开始生根，其生根率大于99％。培养60d时对该组培苗进行收获，平均每瓶太子参组培苗的干重为0.24g是接种量的24倍。经HPLC分析，得出该条件下诱导培养的太子参组培苗中太子参环肽B的含量为134.32μg/g组培苗干重。

实施例4：

先按实施例1的方法步骤(1)获得丛生芽，然后用解剖刀将丛生芽近顶端部分切成0.8-1.0cm带节间的外植体，将外植体的生物学下端插入特制MS固体培养基中(MS+NAA0.8mg/L+IBA0.5mg/L+ABA0.3mg/L)，每瓶插5苗，置于距30W日光灯35cm的培养架中光照培养。培养7d时外植体开始生根，其生根率大于99％。培养60d时对该组培苗进行收获，平均每瓶太子参组培苗的干重为0.29g是接种量的29倍。经HPLC分析，得出该条件下诱导培养的太子参组培苗中太子参环肽B的含量为323.93μg/g组培苗干重。

实施例5：

先按实施例1的方法步骤(1)获得丛生芽，然后用解剖刀将丛生芽近顶端部分切成0.8-1.0cm带节间的外植体，将外植体的生物学下端插入特制MS固体培养基中(MS+NAA0.8mg/L+IBA0.5mg/L+6-BA0.2mg/L)，每瓶插5苗，置于距30W日光灯35cm的培养架中光照培养。培养7d时外植体开始生根，其生根率大于99％。培养60d时对该组培苗进行收获，平均每瓶太子参组培苗的干重为0.30g是接种量的30倍。经HPLC分析，得出该条件下诱导培养的太子参组培苗中太子参环肽B的含量为320.32μg/g组培苗干重。

实施例6：

先按实施例1的方法步骤(1)获得丛生芽，然后用解剖刀将丛生芽近顶端部分切成0.8-1.0cm带节间的外植体，将外植体的生物学下端插入特制MS固体培养基中(MS+NAA0.6mg/L+IAA0.5mg/L+6-BA0.1mg/L)，每瓶插5苗，置于距30W日光灯35cm的培养架中光照培养。培养7d时外植体开始生根，其生根率大于99％。培养60d时对该组培苗进行收获，平均每瓶太子参组培苗的干重为0.38g是接种量的38倍。经HPLC分析，得出该条件下诱导培养的太子参组培苗中太子参环肽B的含量为372.30μg/g组培苗干重。

实施例7：

先按实施例1的方法步骤(1)获得丛生芽，然后用解剖刀将丛生芽近顶端部分切成0.8-1.0cm带节间的外植体，将外植体的生物学下端插入特制MS固体培养基中(MS+NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L+IAA0.5mg/L+KT0.5mg/L)，每瓶插5苗，置于距30W日光灯35cm的培养架中光照培养。培养7d时外植体开始生根，其生根率大于99％。培养60d时对该组培苗进行收获，平均每瓶太子参组培苗的干重为0.41g是接种量的41倍。经HPLC分析，得出该条件下诱导培养的太子参组培苗中太子参环肽B的含量为695.23μg/g组培苗干重。

实施例8：

先按实施例1的方法步骤(1)获得丛生芽，然后用解剖刀将丛生芽近顶端部分切成1cm带节间的外植体，将外植体的生物学下端插入特制MS固体培养基中(MS+NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L+IAA0.5mg/L+KT0.5mg/L+6-BA0.2mg/L)，每瓶插5苗，置于距30W日光灯35cm的培养架中光照培养。培养7d时外植体开始生根，其生根率大于99％。培养60d时对该组培苗进行收获，平均每瓶太子参组培苗的干重为0.45g是接种量的45倍。经HPLC分析，得出该条件下诱导培养的太子参组培苗中太子参环肽B的含量为850.31μg/g组培苗干重。

实施例9：

取太子参幼枝，用自来水清洗3-5遍，置于肥皂液中浸泡1小时后再用流水冲洗1-2小时。取出用无菌滤纸吸干表面水分，用75％的乙醇浸泡消毒20-40秒，然后用无菌水冲洗3次，吸干表面水分后置于10％的过氧化氢溶液中浸泡13分钟，取出后用无菌蒸馏水冲洗6次，吸干表面水分并在无菌显微条件下进行茎尖剥离。无菌显微条件下剥离茎尖的叶片，取带有生长点的茎尖置于丛生芽诱导培养基MS+6-卞基氨基嘌呤(6-BA)1.5mg/L中培养得丛生芽。用解剖刀将丛生芽近顶端部分切成0.8-1.0cm带节间的外植体，将外植体的生物学下端插入特制MS固体培养基(MS+NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L+IAA0.5mg/L+KT0.5mg/L+6-BA0.2mg/L，灭菌前培养基PH值精密调至6.5)中进行不定根的诱导。每瓶插5苗，置于距30W日光灯35cm的培养架中光照培养。培养7d时外植体开始生根，其生根率大于99％。培养60d时对该组培苗进行收获，平均每瓶太子参组培苗的干重为0.45g是接种量的45倍，经检测其太子参环肽B含量为850.31μg/g组培苗干重。

按上述丛生芽直接诱导不定根的方法诱导出太子参不定根，诱导出根后5天，将太子参不定根从组培苗中小心切下，洗去培养基后精密称量0.5g接种到液体培养基中(1/2MS+NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L+6-BA0.2mg/L，灭菌前培养基PH值精密调至6.5)，以转速为120r/min的速度悬浮扩大培养。培养20d时对该组培苗进行收获，平均每瓶太子参不定根的干重为0.79g是接种量的74倍。经HPLC分析，得出该条件下诱导培养的太子参不定根中太子参环肽B的含量为209.85g/g组培苗干重。液体培养基中太子参环肽B的含量为7.2μg/ml培养液。

太子参组培苗中太子参环肽B的含量用高效液相色谱(HPLC)测定，条件如下：安捷伦生产的Agilent 1100 series；色谱柱为AgilentZORBAX SB-C18，5μm，4.6×150mm；柱温：30℃；流动相为水∶乙腈＝73∶27；流动相流速：1ml/min；检测波长：192nm。HB的保留时间(RT)为14.003分钟。总环肽溶液进样后收取14分钟的吸收峰进行FAB-质谱分析，得到分子量为777的[M-1]^-峰，证明为HB[M＝778]。

Claims

1、含太子参环肽B组培苗的培养方法，包括以下步骤：

2、根据权利要求1所述的含太子参环肽B组培苗的方法，其特征是经过步骤(1)和(2)之后，可进一步进行下述第(3)步骤：

(3)太子参不定根的液体培养与太子参环肽B含量测定：将步骤(1)和(2)太子参组培苗中诱导出的不定根用解剖刀切下，用无菌蒸馏水洗去不定根表面的培养基，在无菌条件下称取0.5g置于液体培养基中，在100-130r/min的旋转震荡器中悬浮培养；同时进行太子参环肽B的含量测定。

3、根据权利要求1所述的含太子参环肽B组培苗的培养方法，其特征是步骤(1)中所采用的消毒方法为：太子参幼枝用自来水清洗3-5遍，置于肥皂液中浸泡1小时后再用流水冲洗1-2小时，取出用无菌滤纸吸干表面水分，用75％的乙醇浸泡消毒20-40秒，然后用无菌水冲洗3次，吸干表面水分后置于10％的过氧化氢溶液中浸泡13分钟，取出后用无菌蒸馏水冲洗6次，吸干表面水分并在无菌显微条件下进行茎尖剥离后置于丛生芽诱导培养基MS+6-卞基氨基嘌呤(6-BA)1.5mg/L中培养。

4、根据权利要求1所述的含太子参环肽B组培苗的培养方法，其特征是步骤(2)是将步骤(1)中所得的丛生芽置于MS固体培养基中分别加入奈乙酸(NAA)0.1-2.0mg/L、吲哚乙酸(IAA)0.1-3.0mg/L、吲哚丁酸(IBA)0.1-4.0mg/L、6-糠基氨基嘌呤(KT)0.1-2.0mg/L、6-卞基氨基嘌呤(6-BA)0.1-1.0mg/L、脱落酸(ABA)0.1-1.0mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.5-1.5mg/L中的一种或几种植物激素所配制的培养基中进行不定根的诱导；灭菌前培养基PH值精密调至6.5；太子参组培苗中太子参环肽B的含量用高效液相色谱(HPLC)测定，条件如下：安捷伦生产的Agilent 1100 series；色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18，5μm，4.6×150mm；柱温：30℃；流动相为水∶乙腈＝73∶27；流动相流速：1ml/min；检测波长：192nm；HB的保留时间(RT)为14.003min；总环肽溶液进样后收取14min的吸收峰进行FAB-质谱分析，得到分子量为777的[M-1]^-峰，证明为太子参环肽B[M＝778]。

5、根据权利要求1或4所述的含太子参环肽B组培苗的培养方法，其特征是将步骤(1)中所得的丛生芽置于MS固体培养基中分别加入奈乙酸(NAA)0.1-2.0mg/L、吲哚乙酸(IAA)0.1-3.0mg/L、吲哚丁酸(IBA)0.1-4.0mg/L、6-糠基氨基嘌呤(KT)0.1-2.0mg/L、6-卞基氨基嘌呤(6-BA)0.1-1.0mg/L、脱落酸(ABA)0.1-1.0mg/L、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)0.5-1.5mg/L中的一种和几种植物激素所配制的培养基NAA或NAA+IBA或NAA+IBA+2.4D或NAA+IBA+ABA或NAA+IBA+6-BA或NAA+IAA+6-BA或NAA+IBA+IAA+KT或NAA+IBA+IAA+KT+6-BA中进行不定根的诱导。

6、根据权利要求2所述的含太子参环肽B组培苗的培养方法，其特征是步骤(3)是将步骤(2)中丛生芽直接诱导出的太子参环肽B含量较高即不低于850.31μg/g组培苗干重的不定根从组培苗中切下，洗去培养基后精密称量0.5g接种到含有奈乙酸0.1-2.0mg/L、吲哚丁酸0.1-4.0mg/L、卞基氨基嘌呤0.1-1.0mg/L的1/2MS液体培养基中，悬浮扩大培养，其含量测定方法同权利要求4的步骤(2)。

7、根据权利要求1所述的含太子参环肽B组培苗的培养方法，其特征是太子参环肽B含量分析采用Exel软件进行分析评价。