CN108522279A - 茭白种子胚直接成苗组织培养法及所用培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种茭白种子胚直接成苗培养基的制备方法，取1LMS基本培养液先调pH值为5.7‑5.9，然后加入2.5‑4.2g植物凝胶和28‑32g蔗糖，高温灭菌；待灭菌后的溶液温度降至50‑60℃时，加入2.0mg的6‑BA母液、2.0mg的KT母液、0.2mg的NAA母液，得成苗培养基。本发明还公开一种茭白种子胚直接成苗组织培养方法：选取茭白种子进行消毒灭菌后获取其种子胚；将种子胚接种到成苗培养基上，于22‑27℃的温度下进行光照培养，光照强度为40‑60μmol/m2/s，每天的光照时间为16小时，直至长出2～3片的叶子，得绿苗，能够显著减少茭白从成熟种子到成苗的时间。

Description

茭白种子胚直接成苗组织培养法及所用培养基
技术领域
本发明涉及植物组织培养领域，具体涉及一种茭白种子胚直接成苗组织培养法及所用培养基。
背景技术
茭白(ZizaniacaducifloroHand-Mozz[Z.LatifliaTurcz])，又名茭瓜、茭笋，属禾本科，多年生水生宿根草本植物，植株高达2m左右，无主根，从茎节上抽生许多不定根。我国现在种植的茭白只长叶茎，不开花结籽，而开花结籽的就是菰米。因为菰米与“五谷”比起来，谷粒成熟期不一致，籽实容易脱落，收获困难，产量较低，还影响茭笋的生长，农民一经发现便立即拔除，所以我国现在只种植有黑粉菌寄生的茭白。
目前，茭白大多采用分株繁殖的方式，种子在自然条件下不萌发；而茭白进行分株繁殖时，其繁殖系数较低，速度较慢；在国内未见采取茭白种子繁殖种苗以扩大种植规模的报道。
为了缩短加代的世代周期，育种家们进行了不少的研究，总结出了一些具体可供利用的休眠破除技术，归纳起来大致有药剂法(双氧水和“920”浸种)和物理法(干湿交替、高低温交替、自然曝晒、刺破种皮等)，但各人方法不一，效果难以进行比较。
茭白的繁殖方式目前以无性繁殖为主，由于茭白孕茭是黑粉菌和茭白植株互作的结果，造成其种性很不稳定，而且受到季节的限制。因种子成熟后在自然条件下存在不发芽的缺陷，所以种子繁殖的有性繁殖方式还未见报道。目前茭白大多采用分株繁殖的方式，种子在自然条件下不萌发。现有技术中，茭白种植后35天左右到分蘖期，可以进行分株繁殖。因与黑粉菌互作孕茭，现有茭白分株繁殖易变异，所以茭白品性的稳定性差；
发明内容
本发明要解决的技术问题是提出一种茭白种子胚直接成苗组织培养法及所用培养基。
为解决上述技术问题，本发明提出一种茭白种子胚直接成苗组织培养基的制备方法，包括MS基本培养液，以及包括以下步骤：
①、配置植物生长调节物质的母液：
先分别配置浓度均为0.1-0.3mg/ml的6-苄基腺嘌呤水溶液、萘乙酸水溶液、激动素水溶液；然后分别过滤灭菌，对应得6-苄基腺嘌呤母液、萘乙酸母液和激动素母液；
②、取1LMS基本培养液先调pH值为5.7-5.9(可利用1M KOH进行调节)，然后加入2.5-4.2g植物凝胶(Phytagel)和28-32g蔗糖，高温灭菌(为常规的高温灭菌处理，高温为100～150℃)；待灭菌后的溶液温度降至50-60℃时，加入2.0mg的6-苄基腺嘌呤母液、2.0mg的激动素母液、0.2mg的萘乙酸母液；得成苗培养基。
作为本发明茭白种子胚直接成苗组织培养基的制备方法的改进：
对作为植物生长调节物质的6-苄基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)和激动素(KT)分别进行如下处理：
将植物生长调节物质用乙醇溶解后再加蒸馏水进行定容，从而分别制得浓度为0.1-0.3mg/ml的6-苄基腺嘌呤水溶液、浓度为0.1-0.3mg/ml的萘乙酸水溶液、及浓度为0.1-0.3mg/ml的激动素水溶液。
作为本发明茭白种子胚直接成苗组织培养基的制备方法的进一步改进：
所述步骤①中的过滤灭菌为采用0.2μm微孔膜过滤灭菌。
作为本发明茭白种子胚直接成苗组织培养基的制备方法的进一步改进：
所述步骤②为：
取1L MS基本培养液先调pH值为5.8(可利用1M KOH进行调节)，然后加入2.5g植物凝胶(Phytagel)和30g蔗糖，高温灭菌(为常规的高温灭菌处理，高温为100～150℃)；待灭菌后的溶液温度降至55±1℃时，加入2.0mg的6-苄基腺嘌呤母液、2.0mg的激动素母液、及0.2mg的萘乙酸母液；得成苗培养基。
为了解决上述问题，本发明还提出一种利用上述制备的成苗培养基进行的茭白种子胚直接成苗组织培养方法，包括依次进行以下步骤：
1)、选取茭白种子进行消毒灭菌，在无菌操作台上(可利用灭菌的小镊子)将消毒灭菌后的种子在距离种子钝圆一端的1/4处掐断露胚，获得种子胚；将种子胚接种到成苗培养基上；
2)、将步骤1)所得的接种在成苗培养基上的种子胚于22-27℃的温度下进行光照培养，光照强度为40-60μmol/m2/s，每天的光照时间为16小时，直至长出2～3片的叶子，得绿苗。
作为茭白种子胚直接成苗组织培养方法的改进：
所述步骤2)中，温度为25℃，光照强度为60μmol/m2/s，每天的光照时间为16小时。
作为茭白种子胚直接成苗组织培养方法的进一步改进：
所述步骤1)的消毒灭菌为：
将茭白种子剥去外壳，先用体积浓度70～75％酒精清洗(2～3次)，再用无菌水清洗(2～3次)；接着浸泡在质量浓度为0.1～0.2％的升汞水溶液中15～35min，再用体积浓度70～75％酒精浸泡4～6min；最后用灭菌水洗涤(4～5次)。
注：本发明所述的茭白种子指当年生的饱满的茭白种子。
本发明提出的茭白种子胚直接成苗组织培养法与以前报道的等待种子成熟收获后采取破除种子休眠技术进行加代的方法相比，本发明通过种子胚培养，使种子胚直接出芽生根，减少了种子成熟的时间，省去了破除种子休眠的过程，缩短了加代的世代周期。本发明构建的茭白种子胚成苗体系，成苗率高，达到80～85％，而且可适用于不同基因型的茭白品种，为茭白育种的快速加代奠定了基础。本发明突破了茭白繁殖的瓶颈，为以后的优良品种选育、保持茭白优良品性的稳定性打下了基础。
与现有技术相比，本发明的技术优势在于：
本发明创建的茭白幼胚快速成苗组织培养体系能够显著减少茭白成苗的时间(约为10天)，组培效率高(约为80～85％)。目前茭白大多采用分株繁殖的方式，种子在自然条件下不萌发。该技术推动了茭白繁殖的过程。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为本发明实施例1中茭白种子胚组织培养的绿苗。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
实施例1、茭白种子胚离体培养基(即，成苗培养基)，其制备方法如下：
①、配置植物生长调节物质的母液：
对作为植物生长调节物质的6-苄基腺嘌呤(6-BA)、萘乙酸(NAA)、及激动素(KT)分别进行如下处理：
称取植物生长调节物质1mg用95％(体积％)乙醇溶解后(该乙醇的量只需能使植物生长调节物质溶解即可)再加蒸馏水进行定容至5ml，从而分别制得0.2mg/ml的6-苄基腺嘌呤水溶液、浓度为0.2mg/ml的萘乙酸水溶液、浓度为0.2mg/ml的激动素水溶液。
将上述3种水溶液均分别通过0.2μm微孔膜进行过滤灭菌，对应得6-BA母液(0.2mg/ml)、NAA母液(0.2mg/ml)和KT母液(0.2mg/ml)。
②、配制成苗培养基：
先将1L MS基本培养液pH值利用1M KOH进行调节为5.8，之后加入2.5g植物凝胶(Phytagel)和30g蔗糖，在1.1个大气压，121℃下灭菌15min，待灭菌溶液温度降至55℃左右时，分别加入10ml的6-BA母液，1ml的NAA母液和10ml的KT母液；得成苗培养基。即，该成苗培养基中6-BA的浓度为2.0mg/L，KT的浓度为2.0mg/L，NAA的浓度为0.2mg/L。
将所得的成苗培养基倒入75×15mm的灭菌培养皿中，待降至室温后用封口膜封好，4℃冰箱中保存备用。
实施例2、一种茭白种子胚离体培养的方法，使用实施例1配制的成苗培养基，以饱满的新收茭白种子为实验材料按如下步骤进行：
1)、选取饱满茭白种子，用灭菌的小镊子将消毒灭菌后的种子在钝圆的一端1/4处掐断露胚，获得种子胚，并将种子胚接种到成苗培养基上。
本实施例中所采用的茭白种子为金茭1号雄株的种子收集于金华市茭白基地。
注：茭白种子细且长，种子一端钝圆，一端(芒端)凸出，种子胚靠近种子钝圆的一端。
上述对茭白种子进行消毒灭菌的方式具体为：
选取饱满茭白种子，剥去外壳，然后将上述处理后的茭白种子用体积浓度70～75％(最佳为75％)酒精洗2～3次，再弃去体积浓度70～75％酒精，用无菌水洗2～3次，再浸泡在质量浓度为0.1～0.2％(最佳为0.1)的升汞水溶液中15～35min(最佳为20min)，弃去升汞溶液再加体积浓度70～75％(最佳为75％)酒精浸泡4～6min(最佳为5min)，再弃去体积浓度70～75％酒精，最后用灭菌水洗涤4～5次；在试验中试行得出，这种消毒灭菌方式对茭白种子消毒更加干净彻底且不会影响种子的活性；消毒灭菌后能有效降低污染率。
2)、将步骤1)所得的接种在成苗培养基上的种子胚放入25℃的培养箱进行光照培养，直至长出2～3片的叶子(一般2～3周)，光照强度为60μmol/m2/s，每天的光照时间为16小时，得绿苗(如图1所示)。
设置了3次重复，每次接种60个胚，成苗率(平均值)为83.3％。
实施例3、将实施例2中选取的茭白种子由“金茭1号的雄株种子(单季茭品种)”更改为“浙茭3号的雄株种子(双季茭品种)”，其余等同于实施例2。一共接种了180个幼胚(即，设置了3次重复，每次接种60个胚)，成苗率(平均值)为80％。
对比例1-1、
更改实施例1中6-BA母液、NAA母液和KT母液的体积量，从而使最终所得的该成苗培养基中6-BA的浓度为2.0mg/L，KT的浓度为1mg/L，NAA的浓度为0.2mg/L；其余等同于实施例1。以此所得的成苗培养基按照实施例2所述方法进行操作。
一共接种了180个幼胚，成苗率(平均值)为64.5％。
对比例1-2、
更改实施例1中6-BA母液、NAA母液和KT母液的体积量，从而使最终所得的该成苗培养基中6-BA的浓度为1.0mg/L，KT的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为0.2mg/L；其余等同于实施例1。以此所得的成苗培养基按照实施例2所述方法进行操作。
一共接种了180个幼胚，成苗率(平均值)为55％。
对比例1-3、
更改实施例1中6-BA母液、NAA母液和KT母液的体积量，从而使最终所得的该成苗培养基中6-BA的浓度为4.0mg/L，KT的浓度为2mg/L，NAA的浓度为0.4mg/L其余等同于
实施例1。以此所得的成苗培养基按照实施例2所述方法进行操作。
一共接种了180个幼胚，成苗率(平均值)为43％。
对比例2-1、将实施例2的人工智能气候培养箱温度由“25℃”改成“28℃”，光照时长由“16h”更改为“12h”；其余内容同实施例2。一共接种了180个幼胚，成苗率(平均值)仅为33.4％。
对比例2-2、将实施例2的人工智能气候培养箱温度由“25℃”改成“28℃”，光照时长不变，仍为“16h”；其余内容同实施例2。一共接种了180个幼胚，成苗率(平均值)仅为60％，而且小苗长势不佳，易发黄。
对比例2-3、将实施例2步骤1)中的“成苗培养基”改成“MS基本培养液”，其余内容同实施例2。一共接种了180个幼胚，成苗率(平均值)仅为10％。
综上，本发明创建的茭白幼胚快速成苗组织培养体系能够显著减少茭白成苗的时间(约为10天)，组培效率高(约为80～85％)。目前茭白大多采用分株繁殖的方式，种子在自然条件下不萌发，本发明推动了茭白种子快速繁殖的过程，突破了茭白繁殖的瓶颈，为以后的优良品种选育、保持茭白优良品性的稳定性打下了基础。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (7)

1.茭白种子胚直接成苗组织培养基的制备方法，包括MS基本培养液，其特征在于包括以下步骤：
①、配置植物生长调节物质的母液：
先分别配置浓度均为0.1-0.3mg/ml的6-苄基腺嘌呤水溶液、萘乙酸水溶液、激动素水溶液；然后分别过滤灭菌，对应得6-苄基腺嘌呤母液、萘乙酸母液和激动素母液；
②、取1LMS基本培养液先调pH值为5.7-5.9，然后加入2.5-4.2g植物凝胶和28-32g蔗糖，高温灭菌；待灭菌后的溶液温度降至50-60℃时，加入2.0mg的6-苄基腺嘌呤母液、2.0mg的激动素母液、0.2mg的萘乙酸母液；得成苗培养基。
2.根据权利要求1所述的茭白种子胚直接成苗组织培养基的制备方法，其特征在于，对作为植物生长调节物质的6-苄基腺嘌呤、萘乙酸和激动素分别进行如下处理：
将植物生长调节物质用乙醇溶解后再加蒸馏水进行定容，从而分别制得浓度为0.1-0.3mg/ml的6-苄基腺嘌呤水溶液、浓度为0.1-0.3mg/ml的萘乙酸水溶液、及浓度为0.1-0.3mg/ml的激动素水溶液。
3.根据权利要求1或2所述的茭白种子胚直接成苗组织培养基的制备方法，其特征在于：
所述步骤①中的过滤灭菌为采用0.2μm微孔膜过滤灭菌。
4.根据权利要求3所述的茭白种子胚直接成苗组织培养基的制备方法，其特征在于所述步骤②为：
取1L MS基本培养液先调pH值为5.8，然后加入2.5g植物凝胶和30g蔗糖，灭菌；待灭菌后的溶液温度降至55±1℃时，加入2.0mg的6-苄基腺嘌呤母液、2.0mg的激动素母液、及0.2mg的萘乙酸母液；得成苗培养基。
5.利用如权利要求1-4任一方法制备而得的成苗培养基进行的茭白种子胚直接成苗组织培养方法，其特征在于依次进行以下步骤：
1)、选取茭白种子进行消毒灭菌，在无菌操作台上将消毒灭菌后的种子在距离种子钝圆一端的1/4处掐断露胚，获得种子胚；将种子胚接种到成苗培养基上；
2)、将步骤1)所得的接种在成苗培养基上的种子胚于22-27℃的温度下进行光照培养，光照强度为40-60μmol/m2/s，每天的光照时间为16小时，直至长出2～3片的叶子，得绿苗。
6.根据权利要求5所述的茭白种子胚直接成苗组织培养方法，其特征在于：
所述步骤2)中，温度为25℃，光照强度为60μmol/m2/s，每天的光照时间为16小时。
7.根据权利要求5或6所述的茭白种子胚直接成苗组织培养方法，其特征在于所述步骤1)的消毒灭菌为：
将茭白种子剥去外壳，先用体积浓度70～75％酒精清洗，再用无菌水清洗；接着浸泡在质量浓度为0.1～0.2％的升汞水溶液中15～35min，再用体积浓度70～75％酒精浸泡4～6min；最后用灭菌水洗涤。
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