CN108849515B

CN108849515B - 一种诱导博落回胚状愈伤组织产生的培养基及方法

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Publication number: CN108849515B
Application number: CN201810820292.1A
Authority: CN
Inventors: 曾建国; 余林岚
Original assignee: Hunan Meikeda Biological Tiomin Resources Inc
Current assignee: Hunan Meikeda Biological Tiomin Resources Inc
Priority date: 2018-07-24
Filing date: 2018-07-24
Publication date: 2019-11-29
Anticipated expiration: 2038-07-24
Also published as: CN108849515A

Abstract

本发明一种诱导博落回胚状愈伤组织产生的培养基及方法，属于植物组织培养技术领域。诱导胚状愈伤组织产生的培育基由MS培养基和添加物2,4‑D、IAA、KT和PQQ组成：MS培养基的浓度为4.42g/L；2,4‑D的浓度为0.2～0.6μmol/L；IAA的浓度为4.0～6.5μmol/L；KT的浓度为0.2～0.6μmol/L的；PQQ的浓度为100～1000nmol/L。方法包括如下步骤：(1)外植体选取和灭菌；(2)采用上述培养基进行诱导胚状愈伤组织培养；(3)诱导胚状体培养；(4)体细胞胚胎萌发；(5)成苗培养；(6)再生苗的移栽；(7)大棚培养。本发明外植体选用博落回的茎、叶，培养基在常用植物激素的基础上加以PQQ，本发明提供的培养基及方法能达到快速、高产能培育博落回组培幼苗的目的，能大大缩短博落回成苗时间，适用于大面积生产。

Description

一种诱导博落回胚状愈伤组织产生的培养基及方法

技术领域

本发明属于博落回植物组织培养技术领域，具体来说是一种诱导博落回胚状愈伤组织产生的培养基及方法，尤其涉及一种体细胞快速诱导博落回胚状愈伤组织产生植株再生的方法。

背景技术

博落回[Macleaya cordata(Willd)^R.B]是罂粟科博落回属多年生植物，是一种重要的传统药用植物，活性成分主要为异喹啉类生物碱，主要包括血根碱(sanguinarine，SA)，白屈菜红碱(chelerythrine，CHE)，原阿片碱(protopine，PRO)和别隐品碱(allocryptopine，ALL)等，具有抗炎杀菌、抗肿瘤、改善肝功能、调节胃肠等显著生物活性。博落回提取物已被批准为我国的第一个二类新中兽药药物饲料添加剂[(2011)新兽药证字33号，34号]。欧盟从2006年1月开始严禁在饲料中添加任何抗生素，德国将博落回开发成饲料添加剂用以在长期使用过程中替代抗生素；而美国将血根碱开发成抗炎牙膏和漱口水，用于预防牙龈肿痛和口腔溃疡。随着对博落回资源的开发和利用，使得博落回植物需求量大增，如今主要是通过大规模采集野生资源来获得。驯化博落回资源，实现规模化种植是当前需要迫切解决的重大课题，而育种是当前必须解决的核心问题。博落回现在主要的繁殖方式有种子繁殖、分根繁殖等，而组织培养作为优良育种方式的一种重要方法，不仅具备有稳定遗传的特点，而且还具备有不受季节影响，能够大幅缩短育种年限等优势。所以探索出一种快速诱导博落回外植体产生愈伤的组培方式不仅仅满足科研的需求，更是生产的需要。

中国专利申请CN103404441A公开一种博落回体细胞胚胎发生和植株再生的方法，中国专利申请CN103404442A公开博落回花药离体单倍体胚胎发生及植株再生的方法，中国专利申请CN105794652A公开一种博落回组织培养快速繁殖的方法。在中国专利申请CN103404442A中受博落回开花时间影响，具有时节性，无法常年工作；而中国专利申请CN105794652A中，根据专利说明，该方法从外植体到植株形成需要82～105天，耗时长，效率不高；中国专利申请CN103404441A外植体到植株形成需要75～105天也存在耗时长的问题。

吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone又名Methoxatin，以下简称PQQ)，化学名称4,5-二氢-4,5-二氧-1氢-吡咯并(2,3-f)喹啉-2,7,9-三羧酸，是甲醇脱氢酶的辅酶，能参与某些氧化还原酶类的催化反应。根据文献报道，PQQ能够促进微生物细胞的生长，其在缩短菌体的迟缓期的同时还不影响菌体细胞的生长速度，在多地发现的“太岁”体内均含有高浓度的PQQ；PQQ为人和动物生长发育不可缺少的辅助因子，有文献报道其能够营养、保护神经细胞，能够保护心脏，能够解毒、护肝，此外还具有抗炎、抗肿瘤、预防白内障、调节骨代谢平衡等作用；此外PQQ还能刺激植物细胞生长，1988年就有报道PQQ能够刺激百合花粉萌发，能够通过加快呼吸速率促进烟草种子萌发，PQQ还能通过促进生长素与细胞分裂素合成，提高新陈代谢水平而发挥促进植物生长的作用，其还可以通过减缓SOD AS APOD酶活性和GSH含量在低温胁迫下急剧下降从而缓解低温胁迫对黄瓜幼苗的损伤。但是将其运用到植物组织培养中的报道尚未见到。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提出一种诱导博落回胚状愈伤组织产生的培养基及方法，是一种利用体细胞快速诱导博落回胚状愈伤组织产生，并加快根系生长的组织培养方法，以解决现在博落回野生资源日益减少，而需求量日益增加之间的矛盾现状，该方法对传统组织培养技术进行改良，使得其生长周期加快，便于快速、高效的培育质量均一的博落回资源，更好的应用于博落回科学研究与实际生产。

为了实现上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

首先，提供一种诱导博落回胚状愈伤组织产生的培养基，所述培育基的组成如下：

MS培养基+0.2～0.6μmol/L的2,4-D+4.0～6.5μmol/L的IAA+0.2～0.6μmol/L的KT+25～100μmol/L的PQQ。

本发明还提供采用上述培养基，利用体细胞快速诱导博落回胚状愈伤组织发生植株再生的方法，包括以下步骤：

(1)外植体选取和灭菌：将叶片剪成小块，嫩枝剪切成小段，清洗消毒，备用；

(2)诱导胚状愈伤组织培养：将处理好的叶片、嫩枝接种到培养基一上，暗培养条件下诱导胚状愈伤组织产生；所述培育基一由MS培养基和添加物组成，所述添加物包括2,4-D、IAA、KT和PQQ；所述MS培养基的浓度为4.42g/L；所述2,4-D的浓度为0.2～0.6μmol/L；所述IAA的浓度为4.0～6.5μmol/L；所述KT的浓度为0.2～0.6μmol/L的；所述PQQ的浓度为100～1000nmol/L；

(3)诱导胚状体培养：将步骤(2)得到的愈伤组织转接到培养基二上，暗培养条件下诱导胚状体产生；所述培养基二由MS培养基和GA₃组成：所述MS培养基的浓度为4.42g/L；所述GA₃的浓度为0.1～0.5μmol/L；

(4)体细胞胚胎萌发：将步骤(3)得到的胚状体转接到培养基三上光暗结合培养；所述培养基三由MS培养基、IAA 和KT组成：所述MS培养基的浓度为4.42g/L；所述IAA的浓度为4.0～6.5μmol/L；所述KT的浓度为0.2～0.6μmol/L；

(5)成苗：将步骤(4)萌发的胚状体转接到培养基四上光暗结合培养；所述培养基四由MS培养基和PQQ组成：所述MS培养基的浓度为4.42g/L；所述PQQ的浓度为25～200μmol/L；

(6)再生苗的移栽：步骤(5)将生根苗组培瓶拧开，加入少量水，放置1～2天后移栽到装有炼苗基质的炼苗盒中，进行正常水肥管理；

(7)大棚培养：炼苗盒中炼苗两周后移栽到大棚，进行正常水肥管理。

上述方案中：

1、MS培养基：是指Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要，因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。MS培养基是目前使用最普遍的培养基。其具有较高的无机盐浓度，能够保证组织生长所需的矿质营养还能加速愈伤组织的生长。由于配方中的离子浓度高，在配制、贮存和消毒等过程中，即使有些成分略有出入，也不会影响离子间的平衡。MS固体培养基可用于诱导愈伤组织，也可用于胚、茎段、茎尖及花药的培养，其液体培养基用于细胞悬浮培养时能获得明显的成功。

2、2,4-D：2，4-二氯苯氧乙酸，具有代表性的合成植物生长素，是一种生长素类似物，以下简称2,4-D。在普通的植物生长素定量法中显示有高的活性，但在采用植物生长素标准定量法的燕麦伸长试验中，其效颇低。

3、IAA：吲哚-3-乙酸，英文全称indole-3-acetic acid，亦称吲哚乙酸，简称“IAA”，是一种用作刺激植物生长的激素类试剂，广泛应用于农业生产中。

4、KT：kinetin，激动素，细胞分裂素的一种。激动素是一种非天然的细胞分裂素，化学名称为6-糠基氨基嘌呤(或N6-呋喃甲基腺嘌呤)，分子式C₁₀H₉N₅O。不溶于水，溶于强酸、碱及冰醋酸中；除具有促进细胞分裂的作用外，还具有延缓离体叶片和切花衰老，诱导芽分化和发育及增加气孔开度的作用。

5、GA3：即赤霉素，为植物生长调节剂，主要用于促进作物的生长发育，提早成熟，提高产量和打破种子、块茎、鳞茎等器官的休眠，促进发芽、分蘖、抽苔，提高果实结果率，特别对解决杂交水稻制种中花期不遇有特别功效，在棉花、葡萄、马铃薯、水果、蔬菜上广泛应用。

进一步地，

步骤(1)首先将叶片剪成边长为8～12厘米的正方形，嫩枝剪切成长度8～12厘米的小段。

进一步地，

步骤(1)中，用洗洁精清洗剪取的叶片和嫩枝，去除其表面灰尘、绒毛，再用蒸馏水冲洗，在灭菌的超净工作台上用75％乙醇浸润10s，放到0.1％升汞水溶液中浸透8～10min，用无菌水漂洗3～4次；将已经灭菌消毒好的叶片和嫩枝用滤纸吸干水分。

进一步地，

步骤(1)将已经灭菌消毒好的叶片和嫩枝用滤纸吸干水分后，进一步用剪刀将叶片剪成0.8～1.2cm²大小的正方形，然后用刀片将叶片划伤；嫩枝斜切成长度0.4～0.6cm的小段，备用。

进一步地，

步骤(2)(3)(4)(5)培养时温度均控制在25±1℃。

进一步地，

步骤(4)(5)光暗结合培养时光照强度均为1000～3000Lx，光照时间均为16h/d。

进一步地，

步骤(2)(3)(4)(5)中MS培养基中含有蔗糖30g/L，植物凝胶3g/L，pH5.8。

进一步地，

步骤(6)炼苗所用基质为：椰糠粉：砂石＝1:1，用生根水浇透水，用塑料罩罩住育苗盒，保证育苗盒湿度不低于82％，温度控制25±1℃，光照强度为3000lx，光照时间16h/d条件下培养两周。

进一步地，

步骤(2)诱导胚状愈伤组织培养的培养基一中：添加剂2,4-D的浓度为0.5μmol/L；所述IAA的浓度为5.7μmol/L；所述KT的浓度为0.5μmol/L的；所述PQQ的浓度为500nmol/L。

进一步地，

步骤(3)诱导胚状体培养的培养基二中：GA₃的浓度为0.3μmol/L。

进一步地，

步骤(4)体细胞胚胎萌发的培养基三中：所述IAA的浓度为5.7μmol/L；所述KT的浓度为0.5μmol/L。

进一步地，

步骤(5)成苗的培养基四中：所述PQQ的浓度为200nmol/L。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明提供的培养基和方法能加快博落回组织培养速度，体细胞诱发愈伤组织产生时间能比现有技术(如对比文件CN103404441A、CN105794652A)提前一周，愈伤生长周期缩短5-10天时间；从胚胎到成苗期也可以缩短约5-10天时间，而且在成苗期更有利于根系生长；整个生长周期最快仅60天，平均缩短接近一个月，能有效提高博落回组织培养效率，缩短其生长周期，为博落回大规模培育种苗提供有力保障，能有效的解决博落回种质资源紧张的局面。

(2)本发明提供的方法是一种改良的组织培养技术，可以不受时间、季节等控制，培育出科研、生产需要的博落回幼苗，一方面可以保证博落回科研能够不受季节影响，另一方面可以培育出遗传背景完全一致幼苗，为博落回的科研提供资源保障；此外该方法还能为博落回的栽培种植提供大量幼苗。

附图说明

图1为1#培养基培养5天后嫩枝的状态图；

图2为4#培养基培养5天后嫩枝的状态图；

图3为5#培养基培养5天后嫩枝的状态图；

图4为0#培养基培育15天后幼苗的状态图；

图5为9#培养基培育15天后幼苗的状态图；

图6为10#培养基培育15天后幼苗的状态图；

图7为11#培养基培育15天后幼苗的状态图。

具体实施方式

通过以下实验案例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。

1、培养基的配制，首先将市面上买到的MS培养基粉末，按照标准配比，4.42克MS培养基粉末加1L水调成基础培养基，然后加蔗糖:30g/L+植物凝胶:3g/L，调pH值为5.8，即得MS培养基；

然后配制不同阶段所需不同培养基，并分别标记，各培养基及其组成如下表1所示：

表1培养基编号及对应的配方表

2、实验操作

2.1外植体的选取：取博落回新鲜健康的叶片、嫩枝，用冰盒带回实验室备用。

2.2外植体灭菌：首先，用剪刀将叶片周围受伤、破损部分减去，剪成边长约10厘米的正方形，嫩枝剪切成长度约10厘米的小段；然后用洗洁精清洗叶片和嫩枝表面，去除表面灰尘、绒毛等，再用蒸馏水冲洗，在灭菌的超净工作台上用菌水冲洗干净，在75％乙醇中浸润10s，放到0.1％升汞水溶液中浸透8-10min，用无菌水漂洗3～4次灭菌消毒；将已经灭菌消毒好的叶片和嫩枝用滤纸吸干水分，剪刀剪成约1cm²大小正方形，用刀片将叶片划伤，嫩枝斜切成长度约0.5cm的小段，备用。

2.3诱导胚状愈伤组织培养：取培养皿，将1#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、15#、16#培养基分别放入培养皿中，每种培养基接种2皿，其中一皿接种叶片，每皿7片；一皿接种嫩枝，每皿7段，然后编号。控制温度25±1℃，暗培养条件下诱导胚状愈伤组织产生。

2.4诱导胚状体培养：取与步骤2.3对应数量的培养皿，对应编号，每个培养皿中均放入14#培养基，将上一步得到的胚状愈伤组织按照对应编号分别转接到14#培养基上，在温度25±1℃，暗培养条件下诱导胚状体产生，培养10～15天形成胚状体。

2.5体细胞胚胎萌发：取对应数量的培养皿，对应编号，每个培养皿中均放入2#培养基，将上一步得到的胚状体分别转接到2#培养基上，温度控制在25±1℃，光照强度为1000～3000Lx，光照时间16h/d，培养20天。

2.6成苗：取对应数量的培养皿，对应编号，将0#、9#、10#、11#、12#、13#、0#、17#、18#培养基分别放入培养皿中，与步骤2.3类似，每种培养基接种2皿，然后将上一步萌发的胚状体分别转接到对应编号的培养皿中的培养基上，在温度25±1℃，光照强度1000～3000Lx，光照时间为16h/d的条件下培养，大约1～2天可以观察到根，10～20天长成完整的植株。

2.7再生苗的移栽：将生根苗组培瓶拧开，加入少量水，放置1～2天后移栽到装有炼苗基质的炼苗盒中，进行正常水肥管理。

2.8大棚培养：上述再生苗在炼苗盒中炼苗两周后移栽到大棚，做好标记，进行正常水肥管理。

上述实验分为叶片组和嫩枝组，叶片组和嫩枝组的步骤2.3-2.6中使用的培养皿和培养基的编号分别如下表2、表3：

表2叶片组对应步骤使用的培养皿及培养基编号表

表3嫩枝组对应步骤使用的培养皿及培养基编号表

3、结果及分析

3.1在2.3步骤中，不同诱导胚状愈伤组织的培养基(培养基一：1#、3#、4#、5#、6#、7#、8#、15#、16#)上，外植体长出愈伤的时间不一致，其中：

(1)嫩枝组：

4#、5#培养基上嫩枝最早出现愈伤，5天已经明显可见，分别见图2、图3，16#培养基上嫩枝也与4#、5#培养基差不多时间出现愈伤，但是其愈伤组织玻璃化。其次是6#、7#、1#(见图1)、3#、8#、15#培养基出现愈伤。且愈伤4#、5#培养基愈伤最多，其时间比1#、3#培养基早10-15天。从图1-3可以看出，1#培养基上的嫩枝的愈伤组织明显少于4#、5#培养基的。

(2)叶片组：

4#、5#培养基上叶片最早出现愈伤，但是相比嫩枝稍晚，7天明显可见，其次是6#、7#、1#、8#、3#、15#培养基出现愈伤；且4#、5#培养基愈伤最多，其出现愈伤的时间比1#、3#培养基早12-16天。16#培养基上的叶片也与4#、5#培养基差不多时间出现愈伤，但是也与嫩枝组类似，其愈伤组织出现玻璃化。

3.2在2.6步骤中，不同成苗培养基(培养基四：0#、9#、10#、11#、12#、13#、0#、17#、18#)上的长根成苗的时间不一致，其中：

(1)嫩枝组：

9#、10#、11#培养基最先长出根，而且数量也较多，其次是11#、12#、13#、17#、18#、0#，9#、10#、11#培养基上植株生长速度也比其他培养基上所长植株要快，其长根成苗周期在15天左右，9#、10#、11#培养基比0#培养的成苗周期要短15天左右。0#、9#、10#、11#培养基培育15天后幼苗的状态图分别见图4、图5、图6、图7，0#培养基的根相比9#、10#、11#培养基较少，且植株相比更矮小，以10#培养基上的植株最为高大，根系也较发达。

(2)叶片组：

与嫩枝组相比，叶片组也是9#、10#、11#培养基最先长出根，而且数量也较多，其次是11#、12#、13#、17#、18#、0#，9#、10#、11#培养基上植株生长速度也比其他培养基上所长植株要快，其长根成苗周期在18天左右，9#、10#、11#培养基比0#培养的成苗周期要早14天左右。

根据以上实验结果可知：

1、步骤2.3中，在诱导胚状愈伤组织的培养基(培养基一)中添加PQQ，可以加快植物呼吸作用，有利于植物生长与发育，将其加入到培养基里面，可以缩短组织培养周期。但是其添加浓度很重要，若浓度过高(16#培养基)，会出现玻璃化愈伤，浓度太低(15#培养基)，其愈伤组织产生的时间与未添加PQQ的其他培养基差不多，因此浓度态度达不到加快植物生长发育的目的。根据实例数据分析，PQQ浓度在100～1000nmol/L时候有利于诱导博落回愈伤组织产生，以浓度为100～200nmol/L最优。

2、在步骤2.6中，在成苗培养基(培养基四)中添加PQQ，有助于博落回胚状体苗生根成苗，缩短萌发后的胚状体生根成苗的周期，且添加浓度以25～200μmol/L为优。

3、通过叶片组与嫩枝组相比，实验操作过程，使用嫩枝比叶片更方便操作，且嫩枝组更容易、更快产生愈伤组织，也能更快生长获得整棵植株。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims

1.一种诱导博落回胚状愈伤组织产生植株再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)诱导胚状愈伤组织培养：将处理好的叶片、嫩枝接种到培养基一上，暗培养条件下诱导胚状愈伤组织产生；所述培养基一由MS培养基和添加物组成，所述添加物包括2,4-D、IAA、KT和PQQ；所述MS培养基的浓度为4.42g/L；所述2,4-D的浓度为0.2～0.6μmol/L；所述IAA的浓度为4.0～6.5μmol/L；所述KT的浓度为0.2～0.6μmol/L的；所述PQQ的浓度为100～1000nmol/L；

(4)体细胞胚胎萌发：将步骤(3)得到的胚状体转接到培养基三上光暗结合培养；所述培养基三由MS培养基、IAA和KT组成：所述MS培养基的浓度为4.42g/L；所述IAA的浓度为4.0～6.5μmol/L；所述KT的浓度为0.2～0.6μmol/L；

2.根据权利要求1所述的诱导博落回胚状愈伤组织产生植株再生的方法，其特征在于，步骤(1)首先将叶片剪成边长为8～12厘米的正方形，嫩枝剪切成长度8～12厘米的小段。

3.根据权利要求2所述的诱导博落回胚状愈伤组织产生植株再生的方法，其特征在于，步骤(1)中，用洗洁精清洗剪取的叶片和嫩枝，去除其表面灰尘、绒毛，再用蒸馏水冲洗，在灭菌的超净工作台上用75％乙醇浸润10s，放到0.1％升汞水溶液中浸透8-10min，用无菌水漂洗3～4次；将已经灭菌消毒好的叶片和嫩枝用滤纸吸干水分。

4.根据权利要求3所述的诱导博落回胚状愈伤组织产生植株再生的方法，其特征在于，步骤(1)将已经灭菌消毒好的叶片和嫩枝用滤纸吸干水分后，进一步用剪刀将叶片剪成0.8～1.2cm²大小的正方形，然后用刀片将叶片划伤；嫩枝斜切成长度0.4～0.6cm的小段，备用。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的诱导博落回胚状愈伤组织产生植株再生的方法，其特征在于，步骤(2)(3)(4)(5)培养时温度均控制在25±1℃。

6.根据权利要求1-4任意一项所述的诱导博落回胚状愈伤组织产生植株再生的方法，其特征在于，步骤(4)(5)光暗结合培养时光照强度均为1000～3000Lx，光照时间均为16h/d。

7.根据权利要求1-4任意一项所述的诱导博落回胚状愈伤组织产生植株再生的方法，其特征在于，步骤(2)(3)(4)(5)中MS培养基中含有蔗糖30g/L，植物凝胶3g/L，pH5.8。

8.根据权利要求1-4任意一项所述的诱导博落回胚状愈伤组织产生植株再生的方法，其特征在于，步骤(6)炼苗所用基质为：椰糠粉：砂石＝1:1，用生根水浇透水，用塑料罩罩住育苗盒，保证育苗盒湿度不低于82％，温度控制25±1℃，光照强度为3000lx，光照时间16h/d条件下培养两周。

9.根据权利要求1所述的诱导博落回胚状愈伤组织产生植株再生的方法，其特征在于，

步骤(2)诱导胚状愈伤组织培养的培养基一中：添加剂2,4-D的浓度为0.5μmol/L；所述IAA的浓度为5.7μmol/L；所述KT的浓度为0.5μmol/L的；所述PQQ的浓度为500nmol/L；

步骤(3)诱导胚状体培养的培养基二中：GA₃的浓度为0.3μmol/L；

步骤(4)体细胞胚胎萌发的培养基三中：所述IAA的浓度为5.7μmol/L；所述KT的浓度为0.5μmol/L；

步骤(5)成苗的培养基四中：所述PQQ的浓度为200nmol/L。