KR101204896B1 - 청미래덩굴 조직배양방법 - Google Patents

청미래덩굴 조직배양방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 청미래덩굴 조직배양방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 (a) 청미래덩굴의 정아조직을 초대배지에 치상한 후 배양하여 분화된 기내식물체를 얻는 단계; (b) 상기 기내식물체를 증식배지에서 생장시켜 청미래덩굴 식물체를 얻는 단계; 및 (c) 상기 배양된 청미래덩굴 식물체에서 다경줄기 (multiple shoot) 또는 발근 (rooting)을 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 청미래덩굴 조직배양방법에 관한 것이다. 본 발명의 조직배양방법에 따라 청미래덩굴 정아조직을 배양하는 경우 청미래덩굴을 짧은 시간에 대량으로 생산할 수 있으므로, 청미래덩굴을 원료로 하는 식물 자원화 산업 (청미래덩굴을 원료로 하는 약품, 건강식품, 기능성 화장품과 같은 산업)에 매우 유용하다.

Description

청미래덩굴 조직배양방법{Tissue Culture Method of Smilax China}
본 발명은 청미래덩굴의 조직배양방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 (a) 청미래덩굴의 정아조직을 초대배지에 치상한 후 배양하여 분화된 기내 배양체를 얻는 단계; (b) 상기 기내 배양체를 증식배지에서 생장시켜 청미래덩굴 식물체를 얻는 단계; 및 (c) 상기 배양된 청미래덩굴 식물체에서 다경줄기 (multiple shoot) 또는 발근 (rooting)을 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 청미래덩굴 조직배양방법에 관한 것이다.
우리나라 전국 산야지에 분포하는 청미래덩굴 (Smilax china)은 한국을 비롯하여 중국, 일본에 널리 분포하며 백합과 (Liliaceae)의 덩굴성 낙엽관목으로서 명감나무 또는 망개나무라고 불리며 약명으로는 그의 근경을 지칭하는 생약인 토복령이다. 꽃의 개화기는 5-6월이며 9-10월에 적색의 열매를 맺고, 근경은 옆으로 뻗고 갈색이다. 잎은 호생하고 두껍고 넓은 타원형이며 끝이 뾰족해 지고 밑은 둥글고 가장자리가 밋밋하여 기부에서 5-7개의 맥이 나오고 다시 그물맥이 된다. 우리나라 황해도 이남의 산기슭 양지, 산비탈, 야산 및 수풀가 반음지에 나는 덩굴성 낙엽 관목이다. 뿌리는 굵고 꾸불꾸불 옆으로 뻗으며 줄기에 갈고리 같은 가시가 있다.
청미래덩굴은 동의치료에서 습을 내보내며 열 내림과 피를 맑게 하고 오줌내기, 독풀에 효과가 있다하여 매독, 창독, 만성 피부병, 수은중독증 피부염에 쓴다. 청미래덩굴 잎은 예로부터 민간에서 어린잎을 나물로 식용하거나 큰 잎은 여름철에 떡을 보존하는 천연식품 보존제, 암 치료제, 당뇨병, 이뇨제 등으로 적혈구나 헤모글로빈의 증가를 유지하는데 그 뿌리를 약제로 사용하고 있다. 최근 연구에 의하면 20% 농도에서 황색포도상구군, 녹농균, 대장균 등에 대하여 균 성장 억제작용이 있다고 알려져 있다. 또한 전자공여능, 아질산염 소거능 등 항산화 활성을 보유하고 있는 것으로 보고되고 있다. 청미래덩굴에 대한 항균활성 물질에 대한 연구는 본 기술발명 수종과 유사한 smilax menispermoidea의 근경에서 스테로이드 사포닌의 분리와 Smilax lebrunii의 뿌리에서 분리한 스테로이드 글리코시드 등이 보고되었다. 특히 청미래덩굴은 망개떡의 원료로 사용되고 있으나 원료부족 및 품질의 불균일성 등의 문제점을 안고 있다.
청미래덩굴은 유용한 자생 식물임에도 불구하고 관심의 대상이 되지 못하고 있으며, 아울러 재배 등 자원화를 위한 노력이 필요하다. 특히 농촌연령의 노령화에 따라 산지채취 등이 어렵게 됨에 따라 재배에 의해 원료를 공급할 필요성이 대두되었다. 청미래덩굴의 묘목생산은 종자를 이용한 실생묘로 생산할 수도 있으나, 종자번식이 매우 힘든 수종이어서 그 양이 충분치 못하여 원활히 공급되지 못하고 있다. 기내배양 기술은 소수의 우량개체를 단시간에 다량 증식할 수 있을 뿐만 아니라, 질병 또는 가뭄 등의 환경적인 영향에서 벗어날 수 있어 기존의 종자번식으로 묘목생산의 효율성을 제고할 수 없다면 대안으로 고려되야할 기술이다.
상술한 바와 같이, 청미래덩굴은 다양한 약리효과 및 생리활성을 지니고 있어, 청미래덩굴을 원재료로 하는 약품, 건강식품, 기능성 화장품과 같은 분야에 적용될 가능성이 높으나 청미래덩굴의 다량 증식을 위한 기술이 전무한 실정이다.
이에 본 발명자는 청미래덩굴에 대한 대량생산방법의 일환으로 청미래덩굴의 조직배양방법을 개발하고자 예의 노력하였으며, 그 결과 청미래덩굴의 조직배양방법을 확립함으로써 본원발명을 완성하였다.
본 발명은
(a) 청미래덩굴의 정아조직을 초대배지에 치상한 후 배양하여 분화된 기내 배양체를 얻는 단계;
(b) 상기 기내 배양체를 증식배지에서 생장시켜 청미래덩굴 식물체를 얻는 단계; 및
(c) 상기 배양된 청미래덩굴 식물체에서 다경줄기 (multiple shoot) 또는 발근 (rooting)을 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 청미래덩굴 조직배양방법을 제공한다.
본 발명의 조직배양방법에 따라 청미래덩굴 정아조직을 배양하는 경우 청미래덩굴을 짧은 시간에 대량으로 생산할 수 있으므로, 청미래덩굴을 원료로 하는 식물 자원화 산업 (청미래덩굴을 원료로 하는 약품, 건강식품, 기능성 화장품과 같은 산업)에 매우 유용하다.
도 1은 본 발명의 청미래덩굴 기내 배양체의 6가지 (1/2MS, MS, 2MS, WPM, B5, SH) 고체배지별 생장 길이를 비교한 그래프이다.
도 2는 본 발명의 청미래덩굴 기내 배양체의 탄소원 (sucrose) 농도별 (1%, 3%, 5%, 7%, 9%) 생장 길이를 비교한 그래프이다.
도 3은 본 발명의 청미래덩굴 기내 배양체의 질소원 NH4NO3, KNO3 함량별 생장 길이를 비교한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 청미래덩굴 기내 배양체의 광 세기별 생장 길이를 비교한 그래프이다
도 5는 본 발명의 청미래덩굴 식물체의 사이토키닌 (BA) 농도별 (0/l, 0.1/l, 0.5/l, 1.0/l, 2.0/l) 발생한 싹 (shoot)의 개수를 비교한 그래프이다.
도 6은 본 발명의 청미래덩굴 식물체의 사이토키닌 (BA)을 농도별 (0/l, 0.1/l, 0.5/l, 1.0/l, 2.0/l) 줄기 생장을 비교한 그래프이다.
도 7은 본 발명의 청미래덩굴 식물체의 옥신 종류별 (NAA, IAA, IBA), 농도별 (0.5/l, 1.0/l) 발근 개수를 비교한 그래프이다.
도 8은 본 발명의 청미래덩굴 식물체의 옥신 종류별 (NAA, IAA, IBA), 농도별 (0.5/l, 1.0/l) 발근 길이를 비교한 그래프이다.
본 발명은
(a) 청미래덩굴의 정아조직을 초대배지에 치상한 후 배양하여 분화된 기내 배양체를 얻는 단계;
(b) 상기 기내 배양체를 증식배지에서 생장시켜 청미래덩굴 식물체를 얻는 단계; 및
(c) 상기 배양된 청미래덩굴 식물체에서 다경줄기 (multiple shoot) 또는 발근 (rooting)을 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 청미래덩굴 조직배양방법을 제공한다.
본 발명에서 '청미래덩굴의 정아조직'이란 청미래덩굴의 정아 부분을 절취하여 획득된 조직을 의미한다.
본 발명에서 '기내 배양채'란 청미래덩굴의 정아조직을 기내 배양함으로써 분화된 식물체를 의미한다.
상기 (b)단계에서 증식배지는 식물세포 배양용 배지인 MS배지를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 1/2MS 배지이다.
상기 (b)단계에서 증식배지는 1/2MS 배지에 탄소원을 포함할 수 있으며, 탄소원으로는 수크로오스를 사용할 수 있다. 바람직하게는 1/2MS 배지에 탄소원으로 3 내지 5% 수크로오스를 포함하는 것이 좋다.
상기 (b)단계에서 증식배지는 1/2MS 배지에 질소원을 포함할 수 있으며, 질소원으로는 무기질소원 또는 유기질소원을 사용할 수 있다. 바람직하게는 1/2MS 배지에 질소원으로 질산암모늄 (NH4NO3) 1500 내지 1800㎎/ℓ 및 질산칼륨 (KNO3) 1800 내지 2000㎎/ℓ를 포함하는 것이 좋다.
상기 (b)단계에서 기내배양체가 생장하기 위한 광 조건은 1000 내지 2000Lux일 수 있으며, 바람직하게는 1400 내지 2000Lux인 것이 좋다.
상기 (c)단계에서 다경줄기 (multiple shoot) 유도는 상기 (b)단계를 통해 배양된 청미래당굴 식물체를 1/2MS 배지에 사이토키닌 (cytokinin)을 처리하여 배양함으로써 유도할 수 있다.
사이토키닌 (cytokinin)은 식물생장조절물질 (growth substance)은 식물호르몬 (phyto hormone)이라고도 부르며, 유기물로 된 화학적 정보전달체로서 식물의 생장과 노화를 제어하는 중요한 물질이다. 이러한 사이토키닌은 분화상태의 조직인 캘러스의 세포분열을 촉진하는 효과를 가진다. 사이토키닌의 종류로는 아데닌, 키네틴 (kinetin), 제아틴 (zeatin), 벤질아데닌 (BA) 및 벤질아미노퓨린 (BAP) 등이 있다.
본 발명에서 처리되는 사이토키닌은 벤질아미노퓨린 (BAP)일 수 있으며, 바람직하게는 벤질아미노퓨린 (BAP) 0.2㎎/ℓ 내지 0.8㎎/ℓ 농도를 처리하는 것이 좋다.
또한 상기 (c)단계에서 발근 (rooting) 유도는 상기 (b)단계를 통해 배양된 청미래덩굴 식물체를 1/2MS 배지에 옥신을 처리하여 배양함으로써 유도할 수 있다.
옥신 (auxin)은 식물의 신장에 관여하는 식물생장조절물질의 일종으로, 줄기 및 뿌리의 생장을 촉진하고 식물의 굴광성을 나타내고 하는 물질이다. 옥신의 종류로는 인돌아세트산 (IAA), 인돌아세토니트릴 (IAN) 및 인돌부틸산 (IBA)과 같은 천연 옥신과 나프탈렌아세트산 (NAA), 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid) 및 MCPA(2-metyl-4-chlorophenoxyacetic acid)과 같은 인공합성 옥신 등이 있다.
본 발명에서 처리되는 옥신은 나프탈렌아세트산 (NAA), 인돌아세트산 (IAA) 및 인돌부틸산 (IBA)으로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 인돌부틸산 (IBA)이다.
본 발명에서 처리되는 옥신으로 인돌부틸산 (IBA)을 사용할 경우 처리하는 농도는 0.8 내지 1.2㎎/ℓ인 것이 바람직하며, 나프탈렌아세트산 (NAA)을 사용할 경우 처리하는 농도는 0.5 내지 0.8㎎/ℓ인 것이 바람직하다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
실시예 1: 청미래덩굴 기내배양
<1-1> 청미래덩굴 정아조직을 이용한 기내배양체 확보
5~6월 경남 진주시 가좌산에서 청미래덩굴 정아 부분을 절취하여 70% (w/v) 에탄올용액에 1분, 3% (w/v) 차아염소산나트륨 용액에 10분간 표면을 소독한 후 멸균수로 5회 수세하였다. 표면 살균된 조직은 3% (w/v) 설탕, 0.45% (x/v) 겔라이트가 함유된 1/2MS 고체배지가 든 페트리디쉬 (100 X 40 mm)에 치상하여 25℃에서 배양하였다. 한 달 후 정아부분에서 분화된 식물체는 상기 배지에서 4주마다 계대배양 하면서 기내배양 조건 확립에 사용하였다.
<1-2> 청미래덩굴의 기내배양을 위한 최적의 배지 탐색
상기 실시예 <1-1>의 방법을 통해 확보된 청미래덩굴의 기내 배양체는 기내 최적의 생장을 위한 적정 배지를 구명하기 위하여 기내 배양체를 1.5㎝로 동일하게 자른 다음 준비된 각각의 배지 1/2MS, MS, 2MS, WPM, B5, SH 가 들어있는 배양병 (500)에 치상하여 25℃ 배양실에서 배양하여 2개월 후 생장을 측정하였다 (배지를 제외한 다른 모든 기내배양 조건을 동일하게 함).
그 결과 도 1에서 나타낸 바와 같이 청미래덩굴의 생장은 1/2MS배지에서 배양 2개월 후 3㎝ 정도의 줄기 생장을 보여 가장 좋았으며, MS배지에서는 2.5㎝ 자람으로 두 번째로 생장이 높음을 알 수 있었다. 나머지 4종의 배양배지(2MS, WPM, B5, SH)에서는 모두 다 2㎝이상 자람으로 비슷한 생장을 보였다.
<1-3> 청미래덩굴의 기내배양을 위한 최적의 탄소원 농도 탐색
상기 <1-1>의 방법을 통해 확보된 청미래덩굴의 기내 배양체는 기내 최적의 생장을 위한 적정 탄소원의 농도를 탐색하기 위해 실시예 <1-2>와 동일한 방법으로 실시하였다. 준비된 식물체는 1/2MS 배지에 탄소원(sucrose) 농도 1, 3, 5, 7, 9% 가 첨가된 각각의 배지에 배양하여 생장을 측정하였다.
그 결과 도 2에서 나타난 바와 같이 탄소원 농도에 따른 청미래덩굴의 생장은 5%의 탄소원 (sucrose)가 첨가된 1/2MS 배지에서 배양 2개월 후 3.3㎝ 자람으로 가장 좋음을 알 수 있었으며, 3%의 탄소원 (sucrose)이 첨가된 1/2MS 배지에서는 3㎝ 자람으로 그 다음으로 좋음을 알 수 있었다.
<1-4> 청미래덩굴의 기내배양을 위한 최적의 질소원 농도 탐색
기내 배양체의 탄소원에 따른 생장은 1/2MS 배지에 수크로오스 5% 조합에서 가장 자람이 좋았다. 따라서 1/2MS 수크로오스 5% 조합에 기내 배양체의 질소함량에 따른 영향력을 구명하기 위하여 NH4NO3, KNO3의 함유량을 조절하였다.
MS배지 성분 함량을 기준으로 NH4NO3, KNO3를 제외한 다른 성분 함량은 동일시하며 NH4NO3, KNO3는 1650mg/L(1), 1900mg/L(1)을 기준으로 1/4, 1/2, 1, 2, 4배 농도로 처리하였으며 7일 간격으로 생장률을 조사하였음. 그 결과 도 3에서 나타난 바와 같이 1의 농도 (NH4NO3 : 1650mg/L, KNO3 : 1900mg/L)로 첨가하여 배양하였을 때 가장 좋은 생장률을 나타내었다.
<1-5> 청미래덩굴의 기내배양을 위한 최적의 광 조건 탐색
양지 식물인 청미래덩굴의 기내 배양체 배양에 있어 광 조건에 따른 최적의 생장을 탐색하기 위해 상기 <1-1>의 방법을 통해 확보된 청미래덩굴의 기내 배양체를 준비하여 실험하였다. 청미래덩굴의 기내 배양체를 1/2MS에 치상하였으며 광 조건이 1000, 1400, 2000 lux인 각각의 식물배양기에 배양하여 생장을 측정하였다.
그 결과 도 4에서 나타난 바와 같이 기내 배양체의 생장은 광도가 가장 강한 2000 lux에 배양하였을 때 2.9㎝ 자람으로 가장 양호하였으며, 1400 lux에서는 2.4㎝, 1000 lux에서는 2㎝의 줄기 신장을 보였다.
실시예 2: 청미래덩굴의 다경줄기 및 발근 유도
<2-1> 다경줄기 유도
청미래덩굴의 기내 배양체를 생장시켜 얻은 청미래덩굴 식물체에서 다경줄기 유도 조건을 탐색하였다. 청미래덩굴 식물체를 1/2MS 배지에 생장조절물질인 사이토키닌 벤질아미노퓨린 (BAP)을 농도 0, 0.1, 0.5, 1.0, 2.0㎎/ℓ로 각각 처리하여 다경줄기 유도 조건을 유도하였으며, 유도된 줄기의 수와 생장을 측정하였다.
그 결과 도 5에서 나타난 바와 같이 청미래덩굴은 생장조절제가 첨가되지 않은 기본 1/2MS 배지에서는 다경줄기가 얻어지지 않았으며, 1/2MS 배지에 벤질아미노퓨린 (BAP) 0.5㎎/ℓ가 처리된 배지에 배양했을 때, 평균 3개의 가장 많은 싹 (shoot)이 형성되었다. 청미래덩굴 줄기의 생장은 도 6에서 나타난 바와 같이 생장조절물질인 사이토키닌 벤질아미노퓨린 (BAP)이 처리되지 않은 1/2MS 배지에서 평균 3cm 생장을 보여 가장 높았으며, 벤질아미노퓨린 (BAP) 0.1㎎/ℓ 처리 시 2.3㎝ 정도로 자라 생장이 좋음을 알 수 있다.
<2-2> 발근 유도
기내에서 유도된 청미래덩굴 식물체에서 발근 유도를 위해 생장조절물질인 옥신 나프탈렌아세트산 (NAA), 인돌아세트산 (IAA) 및 인돌부틸산 (IBA)을 농도 조절을 통해 기내 발근 조건을 탐색하였다. 청미래덩굴 식물체를 1/2MS 배지에 생장조절물질인 옥신 NAA, IAA, IBA 0.5, 1.0㎎/ℓ를 각각 처리하여 식물체를 배양하여 발근수와 뿌리길이를 측정하였다.
그 결과 도 7에서 나타난 바와 같이 1/2MS 배지에 인돌부틸산 (IBA) 1.0 ㎎/ℓ 처리구에서 3.3개의 뿌리를 생산하여 가장 양호한 것으로 나타났으며, 다음으로 나프탈렌아세트산 (NAA) 0.5㎎/ℓ 처리구에서 2.5개의 발근을 보였다. 유도된 뿌리의 길이는 도 8에서 나타난 바와 인돌부틸산 (IBA) 1.0㎎/ℓ 처리구에서 길이 1.4㎝ 자람으로 가장 좋았으며, 나프탈렌아세트산 (NAA) 0.5/l 처리구에서는 0.7 자람을 보였다. 따라서 인돌부틸산 (IBA) 1.0㎎/ℓ 처리구가 청미래덩굴의 발근에 가장 양호한 조합으로 나타났다.

Claims (10)

  1. (a) 청미래덩굴의 정아조직을 1/2 내지 1 MS 배지에 치상한 후 배양하여 분화된 기내 배양체를 얻는 단계;
    (b) 상기 기내 배양체를 1/2 MS 배지에 3 내지 5% 수크로오스로 이루어진 탄소원이 첨가된 증식배지 또는 1/2 MS 배지에 1500 내지 1800㎎/ℓ의 NH4NO3 및 1800 내지 2000㎎/ℓ의 KNO3로 이루어진 질소원이 첨가된 증식배지에서 생장시켜 청미래덩굴 식물체를 얻는 단계; 및
    (c) 상기 배양된 청미래덩굴 식물체를 1/2 MS 배지에 벤질아미노퓨린 (BAP)을 포함하는 사이토키닌 (cytokinin)을 처리하여 배양함으로써 다경줄기 (multiple shoot)를 유도하는 단계 또는 1/2 MS 배지에 인돌부틸산 (IBA), 인돌아세트산 (IAA) 및 나프탈렌아세트산 (NAA)으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 옥신을 처리하여 배양함으로써 발근 (rooting)을 유도하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 청미래덩굴 조직배양방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계에서 기내 배양체를 생장시키는 광 조건이 1400 내지 2000Lux인 것을 특징으로 하는 청미래덩굴 조직배양방법.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 처리되는 사이토키닌 (cytokinin)은 벤질아미노퓨린 (BAP) 0.2 내지 0.8㎎/ℓ인 것을 특징으로 하는 청미래덩굴 조직배양방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 처리되는 사이토키닌 (cytokinin)은 벤질아미노퓨린 (BAP) 0.4 내지 0.8㎎/ℓ인 것을 특징으로 하는 청미래덩굴 조직배양방법.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 처리되는 옥신은 인돌부틸산 (IBA) 0.8 내지 1.2㎎/ℓ인 것을 특징으로 하는 청미래덩굴 조직배양방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계에서 처리되는 옥신은 나프탈렌아세트산 (NAA) 0.5 내지 0.8㎎/ℓ인 것을 특징으로 하는 청미래덩굴 조직배양방법.
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