CN107771785A - 提高低温冻存烟草花粉生活力的方法 - Google Patents

Abstract

提高低温冻存烟草花粉生活力的方法，包括采集花粉；液体培养法测定花粉活力；在花粉中添加低温保护剂可溶性淀粉和纳米微粒；花粉冻存：液氮速冻后分别保存在‑20℃、‑80℃和‑196℃；花粉复融：冻存花粉取出后立即用流水冲5min。同时使用纳米微粒和可溶性淀粉作为低温冷冻保护剂，可以有效提高烟草花粉的低温冻存花粉活力。可溶性淀粉在低温冻存花粉时能保持花粉的干燥状态。羟基磷灰石纳米微粒对生物细胞膜就有较好的生物相容性，在增加冷却速率、提高细胞黏附程度和保护细胞遗传物质方面有重要的作用。在花粉复融时采用流水冲的方式，避免了在化冻过程中产生花粉细胞内的次生结冰对细胞膜体系的破坏，提高了花粉在低温长期冻存后的活力。

Description

提高低温冻存烟草花粉生活力的方法

技术领域

本发明属于农作物花粉储藏技术领域，涉及一种提高低温冻存烟草花粉生活力的方法。

背景技术

烟草花粉中含有烟草的全部遗传信息，在花粉育种的工作中，需对花粉进行长期保存，直到母本花开时，再将保存的花粉直接授粉给母本，解决烟草传统育种中存在的父母本花期不遇的问题。随着花粉保存时间的延长，花粉活力会降低，会影响育种出来的种子质量不高。

温度和湿度是影响花粉生活力的两个重要因素，低温和低湿有助于花粉维持较长时间的生活力。低温保存花粉可分为慢速冻存和快速冻存两种保存方法，慢速冻存花粉的过程中会出现 “溶质损伤”和“冰晶形成”的问题，损伤花粉细胞，影响花粉产业化的保存；快速冻存可避免花粉细胞内、外冰晶的形成，花粉的细胞结构稳定，生活力高，该保存方法已经成功运用于人类血液、精子、卵母细胞、胚胎、胰岛、角膜、皮肤及血管的保存。

相关研究发现，在快速冻存生物组织的过程中，使用低温保护剂可以较好的保护生物组织。传统的低温保护剂甘油、二甲基亚砜等大多是液体，仅适用于保存含水量较高或者放置在培养基中的动物细胞；而烟草花粉的保存需要低温干燥的条件，使用的低温保护剂必须是对冷冻有缓冲作用或者对水分有吸附作用的固体物质，甘油、二甲基亚砜等液体低温保护剂不适用于保存烟草花粉。

发明内容

本发明针对现有技术中，低温保存烟草花粉存在花粉内容易形成冰晶，会损伤花粉细胞，花粉生活力低的问题，提供一种提高低温冻存烟草花粉生活力的方法，具体方案是：

一种提高低温冻存烟草花粉生活力的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、采集花粉：采集大蕾期的烟草花药放置在干燥盒中，将花药放置在恒温箱中干燥48h，温度控制在23 ℃，干燥结束后，用真空泵收集花药中的花粉，收集的花粉分装在离心管中，每管装0.01 g，备用；

B、新鲜花粉活力的测定：采用液体培养法，将干净的载玻片放在培养盒中，取1 mL培养基放置在载玻片上，然后将步骤A中收集的花粉0.001 g悬浮于培养基上，放入恒温箱中暗培养3 h，温度控制在28 ℃，暗培养结束后，用显微镜观察花粉萌发率和花粉管生长长度，花粉萌发率达到85%，花粉管平均能长到300μm；所述的培养基组成为：10 %蔗糖+0.01 %硼酸+0.002 % CaCl2 +10 mmol/Lγ-氨基丁酸，即100mL培养基中加入10 g蔗糖，0.01 g硼酸，0.002 g CaCl2和0.1031 gγ-氨基丁酸；

C、添加低温保护剂：在步骤A中制得的花粉中添加可溶性淀粉和纳米羟基磷灰石，花粉与可溶性淀粉和纳米羟基磷灰石的重量比为1：1：1，然后用漩涡仪将三种物质的混合物进行混匀；

D、冻存花粉：将步骤C中制得的花粉混合物用液氮速冻，然后分别放置在-20 ℃的冰箱、-80℃的冰箱和-196 ℃的液氮罐中保存，备用；

E、复融花粉：将步骤D中保存了30天的花粉混合物分别从-20℃、-80℃和-196℃取出后，立即用流水冲5 min，制得花粉；

F、冻存花粉活力的测定：采用步骤B新鲜花粉活力的测定方法测定三个温度下冻存的花粉的生活力，三种温度冻存的花粉生活力无显著差异。

本发明的有益效果是：同时使用纳米微粒和可溶性淀粉作为低温冷冻保护剂，可以有效提高烟草花粉的低温冻存花粉活力。可溶性淀粉是一种有机大分子，是干燥剂的主要成分之一，它不能被细胞直接利用，在低温冻存花粉时能保持花粉的干燥状态。羟基磷灰石纳米微粒对生物细胞膜就有较好的生物相容性，无毒性，在增加冷却速率、提高细胞黏附程度和保护细胞遗传物质方面有重要的作用。同时使用流水复融的方式避免了在化冻过程中产生花粉细胞内的次生结冰对细胞膜体系的破坏．提高了花粉在低温长期冻存后的活力。

具体实施方式

实施例1：

一种提高低温冻存烟草花粉生活力的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、采集烟草N.alata花粉：采集大蕾期的烟草花药放置在干燥盒中，将花药放置在恒温箱中干燥48 h，温度控制在23 ℃，干燥结束后，用真空泵收集花药中的花粉，收集的花粉分装在离心管中，每管装0.01 g，备用；

B、新鲜花粉活力的测定：采用液体培养法，将干净的载玻片放在培养盒中，取1 mL培养基放置在载玻片上，然后将步骤A中收集的花粉0.001 g悬浮于培养基上，放入恒温箱中暗培养3 h，温度控制在28 ℃，暗培养结束后，用显微镜观察花粉萌发率和花粉管生长长度，N.alata花粉萌发3h后，花粉萌发率为91 %，花粉管平均长度为498.63 μm；所述的培养基组成为：10 %蔗糖+0.01 %硼酸+0.002 % CaCl2 +10 mmol/L γ-氨基丁酸，即100mL培养基中加入10 g蔗糖，0.01 g硼酸，0.002 g CaCl2和0.1031gγ-氨基丁酸；

C、添加低温保护剂：在步骤A中制得的花粉中添加可溶性淀粉和纳米羟基磷灰石，花粉与可溶性淀粉和纳米羟基磷灰石的重量比为1：1：1，然后用漩涡仪将三种物质的混合物进行混匀；

D、冻存花粉：将步骤C中制得的花粉混合物用液氮速冻，然后分别放置在-20 ℃的冰箱、-80℃的冰箱和-196 ℃的液氮罐中保存，备用；

E、复融花粉：将步骤D中保存了30天的花粉混合物分别从-20℃、-80℃和-196℃取出后，立即用流水冲5 min，制得花粉；

F、冻存花粉活力的测定：采用步骤B新鲜花粉活力的测定方法测定三个温度下冻存的花粉的生活力，结果为：-20℃冻存的花粉，萌发率为89%，花粉管平均长度为461.62μm；-80℃冻存的花粉，萌发率为88%，花粉管平均长度为493.69μm；-196℃冻存的花粉，萌发率为90%，花粉管平均长度为504.58μm。说明使用纳米微粒和可溶性淀粉作为低温冷冻保护剂保存N.alata的花粉，并采用流水复融，能使花粉在低温冻存30后还能保持新鲜花粉所具备的生活力。

实施例2：

一种提高低温冻存烟草花粉生活力的方法，与实施例的步骤基本相同，不同之处在于本实施例采用烟草N. tabacum L. cv. K326的花粉进行冻存花粉的生活力测定。

A、采集烟草N. tabacum L. cv. K326花粉：采集大蕾期的烟草花药放置在干燥盒中，将花药放置在恒温箱中干燥48 h，温度控制在23 ℃，干燥结束后，用真空泵收集花药中的花粉，收集的花粉分装在离心管中，每管装0.01 g，备用；

B、新鲜花粉活力的测定：采用液体培养法，将干净的载玻片放在培养盒中，取1 mL培养基放置在载玻片上，然后将步骤A中收集的花粉0.001 g悬浮于培养基上，放入恒温箱中暗培养3 h，温度控制在28 ℃，暗培养结束后，用显微镜观察花粉萌发率和花粉管生长长度，N. tabacum L. cv. K326花粉萌发3h后，花粉萌发率为89 %，花粉管平均长度为335.84μm；所述的培养基组成为：10 %蔗糖+0.01 %硼酸+0.002 % CaCl2 +10 mmol/L γ-氨基丁酸，即100mL培养基中加入10 g蔗糖，0.01 g硼酸，0.002 g CaCl2和0.1031gγ-氨基丁酸；

C、添加低温保护剂：在步骤A中制得的花粉中添加可溶性淀粉和纳米羟基磷灰石，花粉与可溶性淀粉和纳米羟基磷灰石的重量比为1：1：1，然后用漩涡仪将三种物质的混合物进行混匀；

D、冻存花粉：将步骤C中制得的花粉混合物用液氮速冻，然后分别放置在-20 ℃的冰箱、-80℃的冰箱和-196 ℃的液氮罐中保存，备用；

E、复融花粉：将步骤D中保存了30天的花粉混合物分别从-20℃、-80℃和-196℃取出后，立即用流水冲5 min，制得花粉；

F、冻存花粉活力的测定：采用步骤B新鲜花粉活力的测定方法测定三个温度下冻存的花粉的生活力，测定结果为：-20℃冻存的花粉，萌发率为86 %，花粉管平均长度为305.91μm；-80℃冻存的花粉，萌发率为85 %，花粉管平均长度为369.41μm；-196℃冻存的花粉，萌发率为88 %，花粉管平均长度为323.02μm。说明使用纳米微粒和可溶性淀粉作为低温冷冻保护剂保存N. tabacum L. cv. K326的花粉，并采用流水复融，能使花粉在低温冻存30后还能保持新鲜花粉所具备的生活力。

Claims (1)

1.提高低温冻存烟草花粉生活力的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、采集花粉：采集大蕾期的烟草花药放置在干燥盒中，将花药放置在恒温箱中干燥48h，温度控制在23 ℃，干燥结束后，用真空泵收集花药中的花粉，收集的花粉分装在离心管中，每管装0.01 g，备用；

B、新鲜花粉活力的测定：采用液体培养法，将干净的载玻片放在培养盒中，取1 mL培养基放置在载玻片上，然后将步骤A中收集的花粉0.001 g悬浮于培养基上，放入恒温箱中暗培养3 h，温度控制在28 ℃，暗培养结束后，用显微镜观察花粉萌发率和花粉管生长长度，花粉萌发率达到85%，花粉管平均能长到300μm；所述的培养基组成为：10 %蔗糖+0.01 %硼酸+0.002 % CaCl₂ +10 mmol/L γ-氨基丁酸，即100mL培养基中加入10 g蔗糖，0.01 g硼酸，0.002 g CaCl₂和0.1031 gγ-氨基丁酸；

C、添加低温保护剂：在步骤A中制得的花粉中添加可溶性淀粉和纳米羟基磷灰石，花粉与可溶性淀粉和纳米羟基磷灰石的重量比为1：1：1，然后用漩涡仪将三种物质的混合物进行混匀；

D、冻存花粉：将步骤C中制得的花粉混合物用液氮速冻，然后分别放置在-20℃的冰箱、-80℃的冰箱和-196℃的液氮罐中保存，备用；

E、复融花粉：将步骤D中保存了30天的花粉混合物分别从-20℃、-80℃和-196℃取出后，立即用流水冲5 min，制得花粉；

F、冻存花粉活力的测定：采用步骤B新鲜花粉活力的测定方法测定三个温度下冻存的花粉的生活力，三种温度冻存的花粉生活力无显著差异。