CN105746496A - 利用玻璃化超低温离体保存扁桃休眠芽的方法 - Google Patents

利用玻璃化超低温离体保存扁桃休眠芽的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105746496A
CN105746496A CN201610258196.3A CN201610258196A CN105746496A CN 105746496 A CN105746496 A CN 105746496A CN 201610258196 A CN201610258196 A CN 201610258196A CN 105746496 A CN105746496 A CN 105746496A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
almond
distilled water
vitrification
settled
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610258196.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105746496B (zh
Inventor
姜喜
于军
焦培培
陈加利
赵书珍
党艳青
徐冰冰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tarim University
Original Assignee
Tarim University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tarim University filed Critical Tarim University
Priority to CN201610258196.3A priority Critical patent/CN105746496B/zh
Publication of CN105746496A publication Critical patent/CN105746496A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105746496B publication Critical patent/CN105746496B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N3/00—Preservation of plants or parts thereof, e.g. inhibiting evaporation, improvement of the appearance of leaves or protection against physical influences such as UV radiation using chemical compositions; Grafting wax

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Dentistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Cultivation Of Plants (AREA)

Abstract

本发明属于果树栽培和植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用玻璃化超低温离体保存扁桃休眠芽的方法。本发明公开了一种利用玻璃化超低温离体保存扁桃休眠芽的预处理液、装载培养液、洗涤液、玻璃化液、生长培养基和恢复培养基。所述步骤为：1)从健康扁桃植株上剥取含1?2个叶原基的0.6～1.5mm休眠芽茎尖，放入预处理液中预培养1d；2)室温下用装载液装载20min，0℃下用玻璃化液处理70min，再加入少量新鲜玻璃化液后迅速投入液氮罐，保存15d后取出；3)40℃水浴锅中化冻2～3min，用洗涤液卸载30min，吸干洗涤液后转至恢复培养基24℃暗培养7d后转光照下培养。本发明的成活率可达61.01％。

Description

利用玻璃化超低温离体保存扁桃休眠芽的方法
技术领域
本发明属于果树栽培和植物组织培养技术领域，具体涉及一种利用玻璃化超低温离体保存扁桃休眠芽的方法。
背景技术
扁桃(AmygdaluscommunisL.)属蔷薇科(Rosaceae)李亚科(Prunoideae)桃属(Amygdalus)扁桃亚属(Subg.Amygdalus)植物，俗称巴旦杏，其种仁具有很高的营养价值和经济价值，深受广大人民的喜爱，为世界四大干果之一，起源于中亚细亚，约6000年的栽培历史，大面积栽培始于19世纪后期。目前扁桃的引种栽培遍及美国、西班牙、希腊、意大利、土耳其等32个国家和地区，其中美国的栽培面积及产量均居世界之首。扁桃品种极其丰富，据报道，全世界有扁桃品种4000余个，我国自行培育和引进的品种有200多个，其中新疆约有90多个。主要集中在中国新疆南疆的喀什、疏勒、疏附、英吉沙、叶城、泽普及和田等地，栽培面积约为10000hm2。
目前，由于自然因素和人为活动的影响，扁桃呈现品种混杂、抗逆性差，甚至部分品种面临遗失的危险。超低温保存一般是在液氮(-196℃)条件下保存植物细胞、组织或器官，使植物种质的新陈代谢活动基本停止，无限期地保持种质的遗传稳定性，对种质资源长期保存发挥重要作用。玻璃化超低温保存可以节省空间，避免继代、病虫害和气候等因素造成的种质丢失，并且设备简单，操作简便，是一种植物细胞和组织长期稳定保存的理想方法。目前该方法已经成功地应用于菠萝、苹果、马铃薯、草莓、刺梨等园艺植物的茎尖玻璃化超低温保存上，在柿和麻花秦艽等植物的休眠芽上也取得了较好的保存效果。
迄今为止，尚未见到利用玻璃化超低温离体保存扁桃休眠芽的方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种利用玻璃化超低温离体保存扁桃休眠芽的方法，所述的方法具有简单、快速和有效保存扁桃植物种质资源的特点，通过本发明的实施，使扁桃休眠芽的成活率达到61.01％以上。
本发明通过下列技术方案实现：
一种利用玻璃化超低温离体保存扁桃休眠芽的方法，包括配制预处理液、装载培养液、洗涤液、玻璃化液PVS2、生长培养基和恢复培养基；
预处理液：MS，附加0.5mol/L蔗糖；用蒸馏水定容至1L；
装载培养液：MS，附加2mol/L甘油和0.4mol/L蔗糖；用蒸馏水定容至1L；
洗涤液：MS，附加1.2mol/L蔗糖；用蒸馏水定容至1L；
玻璃化液PVS2：30％甘油，15％二甲基亚砜，15％乙二醇，0.4mol/L蔗糖；用蒸馏水定容至1L；
生长培养基：MS，附加6-BA0.3mg/L，IAA0.5mg/L,用蒸馏水定容至1L，pH值为5.8；
恢复培养基：MS，附加6-BA0.3mg/L，IAA1.0mg/L,用蒸馏水定容至1L，pH值为5.8；
按照以下步骤：
(1)从健康扁桃植株上剥取含有1-2个叶原基的0.6～1.5mm休眠芽茎尖，放入所述的预处理液中预培养1d；
(2)在室温下用所述的装载培养液装载20min，于0℃下用玻璃化液PVS2处理70min，加入少量新鲜的玻璃化液PVS2后迅速投入液氮罐，保存15d后取出；
(3)在40℃水浴锅中化冻2～3min，用所述的洗涤液卸载30min，无菌纸吸干洗涤液后转至恢复培养基(MS，附加6-BA0.3mg/L，IAA1.0mg/L,用蒸馏水定容至1L，PH值为5.8)中，于24℃条件下暗培养7d后进行正常光照下培养(光照强度为3000lx)。2周后检查成活率，经实施成活率达到61.01％。
本发明的方法可用于离体保存扁桃休眠芽。
与现有技术相比，本发明具有以下突出优点：
本发明的材料选自扁桃休眠芽，不需进行低温锻炼，简化了操作步骤，直接预培养后，装载培养液装载20min，用玻璃化液PVS2处理70min，超低温冷冻保存。
本发明的方法所用材料来源于新疆扁桃品种，操作简单、有效，不需特殊仪器和繁琐的处理工序，超低温保存后扁桃恢复生长良好，成活率可达61.01％，是一种可靠的方法。
附图说明
图1：预培养时间及浓度对离体休眠芽成活率的影响柱形图。附图标记说明：图中各处理如下：预培养时间分1d、3d、5d，预处理液中的蔗糖的浓度分别为0mol/L、0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.7mol/L。
图2：装载培养液不同处理时间对离体扁桃休眠芽活性的影响的柱形图。附图标记说明：图中处理：装载培养液液处理处理时间设定0min、10min、20min、30min、40min等不同时间。
图3：装载培养液不同处理时间对离体扁桃休眠芽成活率的影响。附图标记说明：图中处理：扁桃休眠芽装载20min后，在0℃冰水混合物条件下用玻璃化液PVS2离体处理扁桃休眠芽的时间分别为0min、10min、30min、50min、70min、90min。
图4：再生培养3d后的扁桃休眠芽开始萌动的直观图。
图5：再生培养2周后的扁桃休眠芽变绿的直观图。
图6：再生培养12周后的扁桃扁桃无菌苗的直观图。
具体实施方式
实施例1：通用实施例
一种利用玻璃化超低温离体保存扁桃休眠芽的方法，包括配制预处理液、装载培养液、洗涤液、玻璃化液PVS2、生长培养基和恢复培养基；
其中：
预处理液：MS，附加0.5mol/L蔗糖；用蒸馏水定容至1L；
装载培养液：MS，附加2mol/L甘油和0.4mol/L蔗糖；用蒸馏水定容至1L；
洗涤液：MS，附加1.2mol/L蔗糖；用蒸馏水定容至1L；
玻璃化液PVS2：30％甘油，15％二甲基亚砜，15％乙二醇，0.4mol/L蔗糖；用蒸馏水定容至1L；
生长培养基：MS，附加6-BA0.3mg/L，IAA0.5mg/L,用蒸馏水定容至1L，pH值为5.8；
恢复培养基：MS，附加6-BA0.3mg/L，IAA1.0mg/L,用蒸馏水定容至1L，pH值为5.8；
说明：MS为植物组织培养领域常用培养基(1962年配方，MS或称MS基本培养基配制方法参见：李明浚编译，植物组织培养，中国农业出版社，1992年版)。
所述的操作步骤为：
A.本发明在每年扁桃芽进入休眠期(11月至次年3月)进行，实施例1的试验于2014年11月-2015年3月在新疆塔里木大学园艺试验站内进行，采集已嫁接4年的“矮丰”(实施本发明不限于此品种)扁桃树冠外围的1年生枝条上的休眠芽。
B.材料灭菌：将“矮丰”扁桃休眠芽放入烧杯加少量洗洁精，用流动自来水冲洗半小时后，蒸馏水冲洗2～3遍，75％酒精消毒20s，0.1％HgCl2溶液消毒7-8min，最后后用无菌水冲洗3～4次，作为离体培养玻璃化超低温保存的材料；
C.休眠芽的剥离：在无菌条件下，将步骤B的休眠芽剥成含有1-2个叶原基的0.1～0.5mm、0.6～1.5mm、1.6～3.0mm等不同大小，剥芽后将外植体放入不同浓度蔗糖的预培养液上；
D.预培养:将步骤C的休眠芽放入MS，附加有0、0.1、0.3、0.5、0.7mol/L蔗糖浓度的预培养液(此为本实施例设计的试验步骤，目的在于探索适宜的蔗糖浓度，即碳源浓度)中，分别预培养1d、3d和5d，以筛选适宜的蔗糖浓度及预培养时间。
E.装载:常温下将预培养结束后的扁桃休眠芽茎尖放入1.8mL的冷冻管中(每管接种10个扁桃休眠芽茎尖)，试验重复3次，用所述的装载培养液装载不同时间如0min、10min、20min、30min、40min的扁桃休眠芽茎尖；
F.玻璃化溶液处理:用无菌胶头滴管吸出装载处理液，加入玻璃化液PVS2并在0℃冰水混合物条件下处理0min、10min、30min、50min、70和90min，处理结束后换上新鲜的PVS2，将冷冻管放入液氮罐提桶中，迅速将冷冻管浸入液氮中。
G.化冻、洗涤处理和成活率的测定:休眠芽超低温保存15d后取出，放入40℃水浴锅中迅速化冻，吸去玻璃化溶液PVS2，用所述的洗涤液卸载3次，每次卸载10min。取出扁桃休眠芽，用无菌滤纸吸去残留在表面的洗涤液，一部分投入0.5％浓度的氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液中，在35℃的温箱中保温处理4h左右，检测扁桃休眠芽的成活率(每2周检测一次)；另一部分接种在所述的生长培养基上，于24℃黑暗条件下培养7d后转到正常光条件下(光照强度3000lx)培养14d左右统计成活率(以休眠芽变绿为标准)。
表1休眠芽大小对超低温保存后成活率的影响
休眠芽的大小对扁桃成活率有一定的影响。本发明的结果表明，当休眠芽为0.6～1.5mm大小时，有利于材料的脱水，成活率最高，比0.1～0.5mm休眠芽的成活率显著高出65.73％(P<0.05)。当休眠芽为1.6～3.0mm大小时，外部裹得鳞片较厚，不利于材料的脱水，成活率不高。在本发明的实施例中用于扁桃休眠芽玻璃化超低温保存的休眠芽大小应在保持在0.6～1.5mm最为适宜。试验结果见表1。
预培养时间和预处理液对扁桃休眠芽超低温保存后的成活率有较大的影响。随着预培养时间的增加，休眠芽超低温保存后成活率降低，即预培养1天时休眠芽的成活率高于第3天和第5天休眠芽成活率。扁桃休眠芽预培养1天预处理液蔗糖浓度为MS+0.5mol/L时存活率最高，达93.93％，且显著高于其他浓度；随着预培养时间的增加，扁桃休眠芽组织细胞进一步脱水，细胞的正常生理代谢遭受迫害，至5d时休眠芽的成活率在蔗糖浓度为0.5mol/L为13.33％，其他蔗糖浓度的成活率均为0，差异显著((P<0.05)。说明扁桃休眠芽玻璃化超低温保存最适宜的预处理液为MS，附加0.5mol/L蔗糖的预处理液，预培养的最佳时间是1d。
装载处理可以进一步使扁桃休眠芽脱水，并减轻玻璃化液PVS2对扁桃休眠芽的毒性。为此，本发明将扁桃休眠芽置于MS附加0.5mol/L蔗糖预处理液中预处理1d后，再用装载培养液(MS+2mol/L甘油+0.4mol/L蔗糖)处理不同时间，装载时间为20min，超低温保存后休眠芽成活率最高，达77.31％，显著高于其他装载时间(如0min、10min、30min和40min)，且装载10min、30min和40min的休眠芽成活率无显著差异，未经装载培养液液装载的扁桃休眠芽成活率最低，比装载20min后的成活率低55.28％，结果表明，用装载培养液处理休眠芽20min，减缓了玻璃化液PVS2对扁桃休眠芽的渗透毒害，提高了成活率。因此，扁桃休眠芽玻璃化超低温保存最适宜的装载时间为20min。
进一步将休眠芽装载20min后，在0℃冰水混合物条件下用玻璃化液PVS2分别处理0min、10min、30min、50min、70和90min，结果表明：随着玻璃化液PVS2处理时间的延长，扁桃休眠芽的成活率呈现先增加后降低的趋势，未经玻璃化液PVS2处理的休眠芽脱水不够，成活率较低，为13.33％；随着玻璃化液PVS2处理时间的延长扁桃休眠芽成活率提高，至处理70min，扁桃休眠芽的成活率达到最高为65.00％，与其他处理间差异显著；当处理时间进一步延长至90min后，扁桃休眠芽的成活率比70min时成活率下降了59.23％。因此，在本发明中扁桃休眠芽玻璃化超低温保存的处理时间为70min效果最好。
扁桃休眠芽冷冻保存15天后从液氮罐中迅速取出，放于40℃水浴锅中化冻2-3min，用1.2mol/L洗涤液冲洗，无菌纸吸干休眠芽表面液体，一部分用0.5％浓度的氯化三苯基四氮唑(TTC)进行检测，另一部分接种于生长培养基中，暗培养7天后转入光培养(光照强度3000Lx)，14天后统计成活率。结果表明，扁桃休眠芽用0.5％浓度的TTC染色后均成红色，成活率可达65.33％，但经过再生培养后休眠芽的成活率为52.01％。再生培养3d休眠芽开始萌动(图4)，1周后休眠芽膨大，转入正常光培养(3000Lx)培养，2周后休眠芽均变绿(图5)，12周后扁桃苗生长良好(图6)。
扁桃休眠芽玻璃化超低温保存技术最优流程为：从健康扁桃植株上剥取0.6～1.5mm大小的扁桃休眠芽茎尖，放入含MS附加0.5mol/L蔗糖的预处理液(用蒸馏水定容至1L，)中预培养1d后，室温下用装载培养液(MS，附加2mol/L甘油和0.4mol/L蔗糖，用蒸馏水定容至1L，)装载20min，再在0℃下用玻璃化液PVS2处理70min，加入少量新鲜的玻璃化液PVS2后迅速投入液氮罐，保存15d后取出，在40℃水浴锅中化冻2～3min，用MS，附加1.2mol/L蔗糖的洗涤液(用蒸馏水定容至1L)，卸载30min，无菌纸吸干洗涤液后转至恢复培养基(MS，附加6-BA0.3mg/L，吲哚乙酸(IAA)1.0mg/L，用蒸馏水定容至1L，pH值为5.8)中，24℃条件下暗培养7d后转入正常光照(光照强度3000lx)培养，2周后检查扁桃休眠芽成活率达61.01％。

Claims (2)

1.一种利用玻璃化超低温离体保存扁桃休眠芽的方法，其特征在于：包括配制预处理液、装载培养液、洗涤液、玻璃化液PVS2、生长培养基和恢复培养基；
预处理液：MS，附加0.5mol/L蔗糖；用蒸馏水定容至1L；
装载培养液：MS，附加2mol/L甘油和0.4mol/L蔗糖；用蒸馏水定容至1L；
洗涤液：MS，附加1.2mol/L蔗糖；用蒸馏水定容至1L；
玻璃化液PVS2：30％甘油，15％二甲基亚砜，15％乙二醇，0.4mol/L蔗糖；用蒸馏水定容至1L；
生长培养基：MS，附加6-BA0.3mg/L，IAA0.5mg/L，用蒸馏水定容至1L，pH值为5.8；
恢复培养基：MS，附加6-BA0.3mg/L，IAA1.0mg/L，用蒸馏水定容至1L，pH值为5.8；
按照以下步骤：
(1)从健康扁桃植株上剥取含有1-2个叶原基的0.6～1.5mm休眠芽茎尖，放入所述的预处理液中预培养1d；
(2)在室温下用所述的装载培养液装载20min，于0℃下用玻璃化液PVS2处理70min，加入少量新鲜的玻璃化液PVS2后迅速投入液氮罐，保存15d后取出；
(3)在40℃水浴锅中化冻2～3min，用所述的洗涤液卸载30min，无菌纸吸干洗涤液后转至恢复培养基中，于24℃下暗培养7d后转移至光照强度为3000lx的光照下培养。
2.权利要求1所述的方法在离体保存扁桃休眠芽中的应用。
CN201610258196.3A 2016-04-23 2016-04-23 利用玻璃化超低温离体保存扁桃休眠芽的方法 Expired - Fee Related CN105746496B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610258196.3A CN105746496B (zh) 2016-04-23 2016-04-23 利用玻璃化超低温离体保存扁桃休眠芽的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610258196.3A CN105746496B (zh) 2016-04-23 2016-04-23 利用玻璃化超低温离体保存扁桃休眠芽的方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105746496A true CN105746496A (zh) 2016-07-13
CN105746496B CN105746496B (zh) 2018-06-01

Family

ID=56324542

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610258196.3A Expired - Fee Related CN105746496B (zh) 2016-04-23 2016-04-23 利用玻璃化超低温离体保存扁桃休眠芽的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105746496B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111616140A (zh) * 2020-06-11 2020-09-04 中国农业科学院特产研究所 一种软枣猕猴桃休眠芽玻璃化超低温保存方法和应用
CN111802380A (zh) * 2020-07-27 2020-10-23 中国农业科学院郑州果树研究所 一种桃休眠芽茎尖超低温离体保存方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101796925A (zh) * 2010-04-02 2010-08-11 浙江省农业科学院 东方百合种质资源离体保存方法
CN104145722A (zh) * 2014-07-29 2014-11-19 中国农业科学院作物科学研究所 桑树休眠芽段的超低温保存及嫁接复活方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101796925A (zh) * 2010-04-02 2010-08-11 浙江省农业科学院 东方百合种质资源离体保存方法
CN104145722A (zh) * 2014-07-29 2014-11-19 中国农业科学院作物科学研究所 桑树休眠芽段的超低温保存及嫁接复活方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
晋玲 等: "麻花秦艽休眠芽的玻璃化超低温保存及植株再生", 《中药材》 *
肖巍 等: "扁桃休眠茎尖包埋玻璃化超低温保存的初探", 《新疆农业科学》 *
陈加利 等: "扁桃茎尖包埋玻璃化超低温保存条件研究", 《塔里木大学学报》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111616140A (zh) * 2020-06-11 2020-09-04 中国农业科学院特产研究所 一种软枣猕猴桃休眠芽玻璃化超低温保存方法和应用
CN111802380A (zh) * 2020-07-27 2020-10-23 中国农业科学院郑州果树研究所 一种桃休眠芽茎尖超低温离体保存方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN105746496B (zh) 2018-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104054583B (zh) 一种苹果砧木t337快速繁殖的方法
CN101401568B (zh) 菊花超低温保存方法
CN104041412B (zh) 一种贵州半蒴苣苔的组织培养快速繁殖方法
CN104106468B (zh) 一种五指毛桃的组织培养快速繁殖方法
WO2019134331A1 (zh) 一种通过胚拯救技术快速培育百山祖冷杉幼苗的方法
CN104186295A (zh) 兜兰种子萌发培养基及培养方法
CN106171985A (zh) 一种生姜的液体浅层快繁方法
CN108293878A (zh) 一种栝楼嫩叶的组培育苗方法
CN100401886C (zh) 一种营养繁殖花卉石蒜的超低温保存方法
CN105309317B (zh) 大叶千斤拔的组织培养繁殖方法
CN104186317A (zh) 云南紫薇的组培快繁方法
CN103782785B (zh) 一种梅花种子栽培方法
CN104686347A (zh) 一种防风愈伤组织超低温保存技术
KR101412052B1 (ko) 왕벚나무 종자 발아 유도 방법
CN104756866A (zh) 一种香椿试管苗扦插快繁的方法
CN105104206B (zh) 见血青的离体保存方法
CN105746496A (zh) 利用玻璃化超低温离体保存扁桃休眠芽的方法
CN105475133B (zh) 程序降温法和玻璃化法相结合超低温保存枇杷属植物种质的方法
CN107278414A (zh) 一种促进珍稀濒危植物马蹄香种子萌发的方法
CN104429976B (zh) 一种甜樱桃砧木高效脱毒方法
CN103125391B (zh) 大豆当地一年多代育种方法
CN105123526A (zh) 一种百日草组培繁殖的种质保存方法
CN105815104A (zh) 一种提高油用牡丹移栽发枝率的四步法
CN106134999A (zh) 京薯6号组培脱毒培育的方法
CN105766894A (zh) 人参丛生芽超低温保存及植株再生培养方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20180601

Termination date: 20190423