CN104145722A - 桑树休眠芽段的超低温保存及嫁接复活方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物种质资源保护领域，特别是提供一种桑树休眠芽段的超低温保存及嫁接复活方法，包括1)获取休眠枝条；2)剪成休眠芽段；3)干燥；4)密封；5)梯度降温；6)液氮保存；(7)化冻；8)回湿；9)嫁接复活。本发明的方法是一种利用干燥-梯度降温冷冻法进行桑树休眠芽段的超低温保存及嫁接复活方法。将桑树休眠芽段进行干燥至含水量20％-40％，经缓慢逐级降温处理、冻存、化冻、回湿和嫁接复活等步骤，获得较高存活率。采用本发明提供的方法，桑树休眠芽段超低温保存后平均存活率最高可达95％。本发明提供的桑树休眠芽段的超低温保存方法程序简单，易于操作，冻存效果好，是桑树种质资源离体长期保存的一条有效途径。

Description

桑树休眠芽段的超低温保存及嫁接复活方法

技术领域

本发明涉及植物种质资源保护领域，特别是涉及一种桑树休眠芽段的超低温保存及嫁接复活方法。

背景技术

桑树为双子叶，桑科，桑属(Morus alba L.)多年生木本植物(落叶乔木或灌木)。具有极高的经济价值、药用价值和园林观赏价值。桑木木材坚硬，可以用来制造家具、乐器、雕刻等，还可做弓(桑弧)、造纸、制造农业生产工具，如桑杈、车辕等。枯枝可以作为干柴；树皮可以作为药材或造纸；桑叶为养蚕的主要饲料，亦作药用，并可作土农药。桑椹不但可以充饥，还可以酿酒，称桑子酒。桑树树冠宽阔，树叶茂密，秋季叶色变黄，颇为美观，且能抗烟尘及有毒气体，适于城市、工矿区及农村四旁绿化。我国是桑树的重要起源中心之一，桑树遍布全国各地，经长期的自然选择和人工选择，形成了多种多样的桑树种质资源，具有丰富的桑树遗传多样性。我国目前收集保存的桑树种质分属12个桑种，3个变种。桑树在我国栽培范围广泛，东北自哈尔滨以南；西北从内蒙古南部至新疆、青海、甘肃、陕西；南至广东、广西，东至台湾；西至四川、云南；长江中下游各地栽培最多。

桑树种质资源一般进行田间、盆和温室栽培保存。但栽培保存不仅占用耕地，并且栽培管理需耗费人力物力，还面临干旱、洪涝、低温、热害、病虫害等自然灾害的影响而导致种质资源丢失的危险。试管苗组织培养保存因多次继代，耗费人力物力，易引起遗传性状变异或污染的危险。超低温保存被认为是这类植物种质资源目前安全、有效、成本低廉的长期保存重要方法。

现已证明，植物材料经超低温保存后，仍能在适宜的条件下复活,再生出新的植株，并保持其遗传稳定性。它避免了田间保存易受自然灾害影响而导致种质变异或毁灭，以及试管苗组织培养保存中因多次继代引起遗传性状变异或污染的危险。

超低温保存方法已发展了很多种。由于植物的繁殖特性、种属、基因型、抗冻性不同，适宜进行超低温保存的种质外植体材料类型也有所不同。迄今为止，国际上尚未建立起具有普适性的超低温保存方法，这也是超低温保存技术实际应用中的一个主要瓶颈。

发明内容

为了更好地保存桑树种质资源，本发明的目的是提供一种桑树的超低温保存及嫁接复活方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种桑树休眠芽段的超低温保存及嫁接复活方法，包括如下步骤：

1)获取休眠枝条；2)剪成休眠芽段；3)干燥；4)密封；5)梯度降温；6)液氮保存；(7)化冻；8)回湿；9)嫁接复活。

其中，步骤1)所述获取休眠枝条，为冬天从桑树上剪取带有健康休眠芽的一年生枝条。具体为：冬天从田间生长的桑树上剪取带有健康休眠芽的一年生新枝条，其上休眠芽处于深度休眠期，没有被打破休眠。

其中，步骤2)所述剪成休眠芽段，为将步骤1)所获休眠枝条的中部条段剪成长4-30cm长的节段，每段带1-3个芽。优选剪成长4-5cm长的节段，每段带2个芽。

其中，步骤3)所述干燥为使休眠芽段含水量降低到质量百分含量20％-40％。处理具体为：将休眠芽段用尼龙网袋装好后进行缓慢干燥3-200小时。

其中，步骤4)所述密封为：将干燥后的休眠芽段用铝箔袋或聚丙烯冷冻管密封。

其中，步骤5)所述梯度降温，为将步骤4)密封好的休眠芽段顺序以以下温度和时长降温：5℃1天，0℃1天，-5℃1天，-10℃1天，-15℃1天，-20℃1天，-30℃2天。

其中，步骤6)所述液氮保存为将步骤5)梯度降温后的休眠芽段投入液氮或液氮蒸汽中保存。

其中，步骤7)所述化冻为室温化冻，具体为室温化冻1-4小时。

其中，步骤8)所述回湿为将化冻后的休眠芽段放在湿润的沙土加蛭石或泥炭加蛭石中回湿24-48小时。

其中，步骤9)所述嫁接复活为：从回湿后的休眠芽段上削下1.5-2.5cm长、带有1个休眠芽的芽片，嫁接到砧木条上；每根砧木条嫁接1-2个休眠芽，嫁接1-2周后在接芽上方1-2厘米处剪去上部砧木。

本发明还提供所述桑树休眠芽段的超低温保存及嫁接复活方法在桑树种质资源保护中的应用。

其中，所述桑树的品种优选“湖桑32号”、“育71-1”或“中桑9703”。

本发明所述桑树的超低温保存及嫁接复活方法是一种利用干燥-梯度降温冷冻法进行桑树休眠芽段的超低温保存及嫁接复活方法。将桑树休眠芽段进行干燥至含水量20％-40％，经缓慢逐级降温处理、冻存、化冻、回湿和嫁接复活等步骤，获得较高存活率。采用本发明提供的方法，桑树休眠芽段超低温保存后平均存活率最高可达95％。本发明提供的桑树休眠芽段的超低温保存方法程序简单，易于操作，冻存效果好，是桑树种质资源离体长期保存的一条有效途径。

附图说明

图1为实施例1中从田间取回的桑树休眠枝条的照片。

图2为实施例1中剪成的桑树休眠芽段的照片。

图3为实施例1中桑树休眠芽段进行干燥处理的照片。

图4为实施例1中休眠芽段密封包装的照片。

图5为实施例1中超低温保存后嫁接复活芽及成活枝条的照片。

具体实施方式

以下实施进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所做的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 不同品种休眠芽段干燥处理时间、含水量与超低温保存成活率的关系

实验材料：实验所用桑树品种为“湖桑32号”、“育71-1”和“中桑9703”。

实验方法具体步骤如下：

获取休眠枝条：2013年12月27日，从中国农业科学院蚕业研究所的“国家桑树种质圃”生长健康的桑树上剪取带有正常休眠芽的一年生新枝条，其上休眠芽处于深度休眠期，没有被打破休眠，即进入持续休眠后当地气温没有超过12℃。从田间取回的桑树休眠枝条的照片见图1。

剪成休眠芽段：选取休眠枝条的中部条段，剪成带有2个芽，4-5cm长的节段。剪成的桑树休眠芽段的照片见图2。

干燥：将休眠芽段用尼龙网袋装好后进行缓慢干燥(室温)0-165小时，含水量在质量百分含量17.70％-47.34％。通过减重法测定不同干燥时间处理节段的含水量。4次重复，每次重复15个芽段。桑树休眠芽段进行干燥处理的照片见图3。

密封：将干燥处理后的芽段用铝箔袋进行密封包装，休眠芽段密封包装的照片见图4。以聚丙烯冷冻管密封也能取得相同效果。

梯度降温处理：将密封包装后的节段顺序置于以下温度不同时间，即5℃1天，0℃1天，-5℃1天，-10℃1天，-15℃1天，-20℃1天，-30℃2天。

液氮保存：从-30℃取出后直接投入到液氮气相中保存。

化冻：2014年3月22-29日，将装有干燥芽段的铝箔袋从液氮蒸汽中取出后放室温化冻4小时。

回湿：将化冻处理后的芽段放在湿润的泥炭+蛭石(两者的混合比例为体积比1:2，用体积比1:2的沙土+蛭石替换能实现同样的效果)中回湿24小时。

嫁接复活：从回湿后的芽段上削下1.5-2.5cm长，带有1个休眠芽的芽片，嫁接到砧木条上。每根砧木条嫁接1-2个休眠芽。嫁接1周后在接芽上方1-2厘米处剪去上部砧木。超低温保存后嫁接复活芽及成活枝条的照片见图5。超低温保存结果如表1所示。

表1 休眠芽段干燥处理时间、含水量与超低温保存成活率的关系

从表1可以看出，不同品种和不同含水量休眠芽段超低温保存后成活率不同。其中含水量20-30％的成活率最高，达82.95-94.83％。

实施例2 休眠芽段生理状态与超低温保存后成活率的关系

仅改变取材时间(即分别于2014年1月16日和2014年2月17日取材)，其余步骤同实施例1，研究休眠芽段生理状态与超低温保存后成活率的关系。超低温保存结果如表2所示。

表2 生理状态与超低温保存后成活率的关系

从表2可以看出，2014年1月16日和2014年2月17日两次取材的35个处理中，只有6个处理有成活的，而且成活率也比较低。因为在2013年12月27日第一次取材后至2014年1月16日第二次取材和2014年2月17日第三次取材之间均出现了连续高温，芽的休眠状态被打破，不耐低温处理。比如2013年12月31日至2014年1月3日连续4天的最高气温均大于15℃，最高的达18.39℃；2014年1月30日至2014年2月1日连续3天的最高气温均大于15℃，最高的达22.67℃。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行参数范围内的修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种桑树休眠芽段的超低温保存及嫁接复活方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)获取休眠枝条；2)剪成休眠芽段；3)干燥；4)密封；5)梯度降温；6)液氮保存；(7)化冻；8)回湿；9)嫁接复活。

2.根据权利要求1所述的桑树休眠芽段的超低温保存及嫁接复活方法，其特征在于，步骤1)所述获取休眠枝条，为冬天从桑树上剪取带有健康休眠芽的一年生枝条。

3.根据权利要求1所述的桑树休眠芽段的超低温保存及嫁接复活方法，其特征在于，步骤2)所述剪成休眠芽段，为将步骤1)所获休眠枝条的中部条段剪成长4-30cm长的节段，每段带1-3个芽。

4.根据权利要求1所述的桑树休眠芽段的超低温保存及嫁接复活方法，其特征在于，步骤3)所述干燥为使休眠芽段含水量降低到质量百分含量20％-40％。

5.根据权利要求1所述的桑树休眠芽段的超低温保存及嫁接复活方法，其特征在于，步骤4)所述密封为：将干燥后的休眠芽段用铝箔袋或聚丙烯冷冻管密封。

6.根据权利要求1所述的桑树休眠芽段的超低温保存及嫁接复活方法，其特征在于，步骤5)所述梯度降温，为将步骤4)密封好的休眠芽段顺序以以下温度和时长降温：5℃1天，0℃1天，-5℃1天，-10℃1天，-15℃1天，-20℃1天，-30℃2天。

7.根据权利要求1所述的桑树休眠芽段的超低温保存及嫁接复活方法，其特征在于，步骤8)所述回湿为将化冻后的休眠芽段放在湿润的沙土加蛭石或泥炭加蛭石中回湿24-48小时。

8.根据权利要求1所述的桑树休眠芽段的超低温保存及嫁接复活方法，其特征在于，步骤9)所述嫁接复活为：从回湿后的休眠芽段上削下1.5-2.5cm长、带有1个休眠芽的芽片，嫁接到砧木条上；每根砧木条嫁接1-2个休眠芽，嫁接1-2周后在接芽上方1-2厘米处剪去上部砧木。

9.权利要求1-8任一项所述桑树休眠芽段的超低温保存及嫁接复活方法在桑树种质资源保护中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述桑树的品种优选“湖桑32号”、“育71-1”或“中桑9703”。