CN103141473A

CN103141473A - 一种营养繁殖花卉水仙超低温保存及植株再生方法

Info

Publication number: CN103141473A
Application number: CN2013100760876A
Authority: CN
Inventors: 林田; 杨华; 龙萍; 朱天生; 刘灶长; 李天菲; 罗利军
Original assignee: SHANGHAI MUNICIPAL AGRICULTURAL BIOLOGICAL GENE CENTER
Current assignee: SHANGHAI MUNICIPAL AGRICULTURAL BIOLOGICAL GENE CENTER
Priority date: 2013-03-11
Filing date: 2013-03-11
Publication date: 2013-06-12

Abstract

本发明涉及到一种营养繁殖花卉水仙的超低温保存及植株再生方法，其包括如下步骤：将水仙的鳞茎进行诱导，切取其带有根原基和芽原基的茎尖进行预培养，然后放于预处理溶液中在室温下进行处理，再转入玻璃化保护剂中进行冰浴处理，后将茎尖转移至装有预冷过的新鲜玻璃化保护剂的冷冻管中，然后把冷冻管迅速投入液氮中保存，使用时从液氮中取出冻存的冷冻管，立即放入39～41℃水浴中快速解冻，再置于培养基中培养。本发明记载的营养繁殖花卉水仙超低温保存方法简便易行，稳定可靠，保存后水仙恢复生长状况良好，其对鳞茎和球宿根类植物遗传资源的超低温保存，具有很好的参考价值。

Description

一种营养繁殖花卉水仙超低温保存及植株再生方法

技术领域

本发明涉及到一种植物种质资源的保存及植株再生方法，，尤其涉及到一种营养繁殖花卉的超低温保存及植株再生方法，具体的说是涉及到一种崇明水仙的超低温保存及植株再生方法,属植物细胞工程技术领域。

背景技术

崇明水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）是上海市特色花卉品种之一，早在明朝就有栽培。它花香优雅、花期长，株型矮小，园林上适合配植在草地边缘或布置花坛、花境，具有广泛应用前景，近年来已销售国际市场。在常规生产及保存过程中，由于病毒病严重及种源退化，严重阻碍了崇明水仙的产业化发展：因崇明水仙为同源三倍体，具高度不孕性，无法通过种子保存资源。通常采用鳞茎在圃地保存的方式，并通过分离小籽球的方法进行繁殖，１个种球1年仅能繁殖 3～4 个籽球，年繁殖系数低。此外，我国水仙病毒病危害非常严重，作为种源用的鳞茎在长年持续栽培下，病毒积累日益严重，造成产量逐年萎缩，种性退化，失去观赏价值和商品性。通过组织培养保存除了需定期继代，需要大量人力及物力外，还有污染及品种退化的危险。因此，建立一套经济高效的崇明水仙种质保存体系，探索快速、有效、稳定的崇明水仙离体脱毒方法，对有效保护崇明水仙种质资源,提纯复壮、加速产业化进程具有现实意义。

超低温保存是指在液氮（-196℃）下的低温保存。在此条件下，植物的生物化学活性近乎停止，贮藏过程中的生理和遗传变化能够控制在最低限度内，被认为是植物遗传资源长期保存的最优选择。它避免了田间保存易受自然灾害影响而导致种质变异或毁灭，以及组织培养保存中因多次继代引起遗传性状变异或污染的危险。关于植物超低温保存的研究，在进入到20世纪90年代后，保存技术的多样化与简易化方面不断取得进步，能够保存的植物物种数也在不断地增长，但多数集中在苹果、樱桃、柑桔、香蕉、木薯等木本植物以及马铃薯、红薯、草莓等薯类植物为主的植物遗传资源的超低温保存。在超低温保存技术方面，崇明水仙属球宿根植物，目前对此类植物中百合及大蒜的相关报导较多，水仙同科（石蒜科）植物中，上海市农业生物基因中心（申报单位）已对红花石蒜成功进行超低温保存并申请相关专利（中国：CN1934941: 2007）。

发明内容

本发明的目的是提供一种营养繁殖花卉水仙的超低温保存及植株再生方法。

为了实现上述的目的，本发明采用的技术方案是提供一种营养繁殖花卉的超低温保存及植株再生的方法，所述超低温保存方法包含以下步骤：将营养繁殖花卉的鳞茎进行诱导，切取大小2~5mm的茎尖，将所述带有根原基和芽原基的茎尖进行预培养，然后置于预处理溶液中在室温下处理15～30min，将预处理溶液中处理过的茎尖转入玻璃化保护剂中进行冰浴处理60～120min，将冰浴处理的茎尖转移至装有预冷过的新鲜玻璃化保护剂的冷冻管中，然后将冷冻管迅速投入到液氮中保存。

本发明采用的优选实施方案是，所述的营养繁殖花卉为崇明水仙。

本发明采用的优选实施方案是，所述诱导包含的步骤有：选取3～4年生崇明水仙鳞茎；将崇明水仙的鳞茎用70%酒精消毒1 min，0.1%的升汞消毒10~20min，然后用无菌水冲洗；将冲洗过的鳞茎切块接种于含1 mg·L^-1 BA及1 mg·L^-1 NAA的MS培养基上诱导出小鳞茎。

本发明采用的优选实施方案是，所述MS培养基上诱导的培养温度为23～27℃, 光照12 h·d^-1，光照强度36 μmol m^-2 s^-1，继代为3个月。

本发明采用的优选实施方案是，所述预培养是指将诱导后的茎尖接种到含0.3~0.5 mol·L^-1蔗糖的MS培养基内在25℃下培养1~5天。

本发明采用的优选实施方案是，所述预处理溶液为2 mol·L^-1甘油和0.4 mol·L^-1蔗糖的MS液体培养基。

本发明采用的优选实施方案是，所述玻璃化保护剂为3.26 mol·L^-1甘油、 2.42 mol·L^-1乙二醇、1.9 mol·L^-1DMSO和0.4 mol·L^-1蔗糖。

本发明采用的另一种实施方案是，提供一种植株再生的方法，其包含以下步骤：取保存后带有茎尖的冷冻管立即放入40℃水浴中快速解冻2～4 min，将解冻后的茎尖在室温下用含1.2 mol·L^-1蔗糖的MS培养液洗涤2～3 次，洗涤时间为每次5～10 min，将洗涤后的茎尖用滤纸吸干，将吸干的茎尖转移至含1 mg·L-1 BA、 0.5 mg·L-1 NAA和 0.5 mg·L-1 GA3的MS半固体培养基中进行暗光或弱光培养5~7 天，然后转入含1 mg·L-1 BA和1 mg·L-1 NAA的MS固体培养基中培养。

本发明提供的营养繁殖花卉崇明水仙的超低温保存及植株再生方法简便易行，稳定可靠，保存后崇明水仙恢复生长状况良好，成活率可达80%。

本发明还对其他球宿根类植物遗传资源的超低温保存提供了很好的参考价值。

附图说明

图1、本发明的保存方法操作流程图；

图2、本发明的诱导方法操作流程图；

图3、本发明植株再生的操作流程图。

（a、将营养繁殖花卉水仙的鳞茎进行诱导，切取大小2~5mm的茎尖；b、将所述带有根原基和芽原基的茎尖进行预培养，然后置于预处理溶液中在室温下处理15～30min；c、将预处理溶液中处理过的茎尖转入玻璃化保护剂中进行冰浴处理60～120min；d、将冰浴处理的茎尖转移至装有预冷过的新鲜玻璃化保护剂的冷冻管中；e、将上述冷冻管迅速投入到液氮中保存；

a'、选取3～4年生崇明水仙鳞茎；b'、将步骤a'的鳞茎用70%酒精消毒1 min，0.1%的升汞消毒10~20min，然后用无菌水冲洗； c'、将步骤b'的鳞茎切块接种于含1 mg·L^-1 BA及1 mg·L^-1 NAA的MS培养基上诱导出小鳞茎。

A、取权利要求1所述的冷冻管立即放入40℃水浴中快速解冻2～4 min；B、将解冻后的茎尖在室温下用含1.2 mol·L^-1蔗糖的MS培养液洗涤2～3 次，洗涤时间为每次5～10 min；C、将洗涤后的茎尖用滤纸吸干；D、将吸干的茎尖转移至含1 mg·L-1 BA、 0.5 mg·L-1 NAA和 0.5 mg·L-1 GA3的MS半固体培养基中进行暗光或弱光培养5~7 天，然后转入含1 mg·L-1 BA和1 mg·L-1 NAA的MS固体培养基中培养。）

具体实施方式

为了更好的说明本发明的实施方案，下面结合本发明附图以及实施例对本发明做进一步的说明，本发明叙述的实施例虽用来说明本发明，但不能用于限制本发明的保护范围。

实施例1、崇明水仙小鳞茎的诱导

如图2所示，说明的是本发明的崇明水仙小鳞茎的诱导操作流程图，其操作步骤是：a'、选取3～4年生崇明水仙鳞茎；b'、将步骤a'的鳞茎用70%酒精消毒1 min，0.1%的升汞消毒10~20min，然后用无菌水冲洗；c'、将步骤b'的鳞茎切块接种于含1 mg·L^-1 BA及1 mg·L^-1 NAA的MS培养基上诱导出小鳞茎，其中，在培养基上的诱导培养温度为25±2℃, 光照12 h·d^-1，光照强度36 μmol m^-2 s^-1，诱导3个月，得到直径0.5~1cm的小鳞茎。

实施例2、崇明水仙预优培养

如图1所示，说明的是本发明的保存方法操作流程图，保存方法的操作方法是：a、将营养繁殖花卉水仙的鳞茎进行诱导，切取大小2~5mm的茎尖；b、将所述带有根原基和芽原基的茎尖进行预培养，然后置于预处理溶液中在室温下处理15～30min；c、将预处理溶液中处理过的茎尖转入玻璃化保护剂中进行冰浴处理60～120min；d、将冰浴处理的茎尖转移至装有预冷过的新鲜玻璃化保护剂的冷冻管中；e、将上述冷冻管迅速投入到液氮中保存。

实施例3、茎尖大小对崇明水仙超低温保存成活率的影响

将1～1.5 mm、2～3 mm、4～5 mm的茎尖在蔗糖浓度为0.3 mol·L^-1的MS培养基内预培养5天后，用预处理液处理20 min，然后用玻璃化保护剂冰浴处理60～120min，优选的处理时间为80 min，冻存后恢复培养的结果表明：茎尖直径为2～3mm的成活率最高，可达80%。茎尖小于 2 mm的成活率仅为40%，茎尖大于4 mm的成活率仅为10% 。

实施例4、玻璃化试剂处理时间对茎尖成活率的影响

取2～3 mm的石蒜茎尖放在蔗糖浓度为0.4 mol·L^-1的MS培养基上培养5 天后，用预处理液处理20 min并以预冷过的玻璃化保护剂分别进行30、60、80、120、150 min的冰浴处理，步骤d为将茎尖转移至装有预冷过的新鲜玻璃化保护剂的2 mL冷冻管中，其中10个茎尖·管^-1，步骤e显示是把冷冻管迅速投入液氮中保存。恢复培养的结果表明：处理时间少于30 min，茎尖冻存后没有存活，60min时成活率仅为30%，80 min时最高可达80%。后随处理时间延长，成活率略有下降，至150 min时，成活率仍可达50%。

实施例5、茎尖恢复培养与植株再生

如图3所示，其操作步骤是：A、取权利要求1所述的冷冻管立即放入40℃水浴中快速解冻2～4 min；B、将解冻后的茎尖在室温下用含1.2 mol·L^-1蔗糖的MS培养液洗涤2～3 次，洗涤时间为每次5～10 min；C、将洗涤后的茎尖用滤纸吸干；D、将吸干的茎尖转移至含1 mg·L-1 BA、 0.5 mg·L-1 NAA和 0.5 mg·L-1 GA3的MS半固体培养基中进行暗光或弱光培养5~7 天，然后转入含1 mg·L-1 BA和1 mg·L-1 NAA的MS固体培养基中培养，在培养条件与鳞茎诱导的条件相同。茎尖解冻后接种在培养基上约5～7 天后，未成活的茎尖发生褐变或漂白,而成活的茎尖则转成淡黄至黄褐色。继续培养约14～28天后便恢复生长，但最长的需40～60 天才能在茎尖见到有芽萌动，再生率可达50%。

Claims

1.一种营养繁殖花卉水仙的超低温保存及植株再生的方法，其特征在于，

所述超低温保存的方法包含步骤有：将营养繁殖花卉的鳞茎进行诱导，切取大小2~5mm的茎尖，将带有根原基和芽原基的茎尖进行预培养，然后置于预处理溶液中在室温下处理15～30min，将在预处理溶液中处理过的茎尖转入玻璃化保护剂中进行冰浴处理60～120min，将冰浴处理的茎尖转移至装有预冷过的新鲜玻璃化保护剂的冷冻管中，然后将冷冻管迅速投入到液氮中保存。

2.根据权利要求1所述的营养繁殖花卉水仙的超低温保存及植株再生的方法，

其特征在于，所述的营养繁殖花卉为崇明水仙。

3.根据权利要求1或2所述的营养繁殖花卉水仙的超低温保存及植株再生的方法,其特征在于，所述诱导包含的步骤有：选取3～4年生崇明水仙鳞茎，然后将水仙鳞茎用70%酒精消毒1 min，0.1%的升汞消毒10~20min，再用无菌水冲洗，冲洗后将鳞茎切块接种于含1 mg·L^-1 BA及1 mg·L^-1 NAA的MS培养基上诱导出小鳞茎。

4.根据权利要求3所述的营养繁殖花卉水仙的超低温保存及植株再生的方法,其特征在于，所述MS培养基上诱导的培养温度为23～27℃, 光照12 h·d^-1，光照强度36 μmol m^-2 s^-1，继代为3个月。

5.根据权利要求1所述的营养繁殖花卉水仙的超低温保存及植株再生的方法,其特征在于，所述预培养是指将诱导后的茎尖接种到含0.3~0.5 mol·L^-1蔗糖的MS培养基内在25℃下培养1~5天。

6.根据权利要求1所述的营养繁殖花卉水仙的超低温保存及植株再生的方法,其特征在于，所述预处理溶液为2 mol·L^-1甘油和0.4 mol·L^-1蔗糖的MS液体培养基。

7.根据权利要求1所述的营养繁殖花卉水仙的超低温保存及植株再生的方法,其特征在于，所述玻璃化保护剂为3.26 mol·L^-1甘油、 2.42 mol·L^-1乙二醇、1.9 mol·L^-1DMSO和0.4 mol·L^-1蔗糖。

8.一种营养繁殖花卉水仙的超低温保存及植株再生的方法,其特征在于，所述植株再生的方法包括如下步骤：取权利要求1~7所述带有保存后茎尖的冷冻管立即放入40℃水浴中快速解冻2～4 min，将解冻后的茎尖在室温下用含1.2 mol·L^-1蔗糖的MS培养液洗涤2～3次，洗涤时间为每次5～10 min，将洗涤后的茎尖用滤纸吸干，将吸干的茎尖转移至含1 mg·L-1 BA、 0.5 mg·L-1 NAA和 0.5 mg·L-1 GA3的MS半固体培养基中进行暗光或弱光培养5~7 天，然后转入含1 mg·L-1 BA和1 mg·L-1 NAA的MS固体培养基中培养。