CN103299907B - 三叶青种质资源的离体保存及保存后恢复生长的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种三叶青种质资源的离体的保存和保存后的恢复方法，它是以三叶青带腋芽的茎尖为外植体，用8%次氯酸钠表面消毒8min，无菌水冲洗2次，再用0.1%升汞灭菌5min，无菌水冲洗8次后，将其切割成1cm左右的茎段接入培养基1中；20天后将萌发的腋芽转接到培养基2中进行扩繁；再30天后将增殖的不定芽转入培养基3中诱导生根；再20天后将形成的试管苗转入培养基4中于8±1℃和光照600Lux条件下进行保存。本发明提供的三叶青种质资源的离体的保存和保存后的恢复方法，应用该项技术保存种质时间长、种质质量稳定，且种质保存工艺简便，技术稳定可靠，可重复性强，适合大规模三叶青种质资源的保存。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物组培技术，特别是一种三叶青种质资源离体保存及保存后恢复生长的方法。
背景技术
三叶青(Tetrastigma hemsleyanum)又名金线吊葫芦，可用于治疗高热、肝炎、风湿性关节炎及病毒性脑膜炎等多种疾病,也是抗肿瘤常用药物。其主要活性成份黄酮对肝癌、肠癌、胃癌和血癌细胞株具有“促凋亡作用”。目前该植物野生资源濒临灭绝,且其对生长环境的要求非常苛刻，人工栽培难度大，三叶青药材的来源主要靠扦插，移栽等，但各项技术尚不成熟，繁殖系数低，开发和利用受到极大限制。2011年三叶青被列入“浙江省首批农作物种质资源保护名录”。在保护现有野生资源的同时，利用植物组织培养方法对三叶青种质资源进行离体快繁和试管保存显得十分重要。
离体继代培养技术正日益成为种质资源保存的常用手段。但利用继代培养的方法进行种质保存，一个比较普遍的问题就是继代频繁。每一次继代都可能造成交叉污染，而当保存量较大时，继代培养所消耗的人力和物力成本很高。不仅如此，一些保存的植物组织培养物，经过多次继代还会引发遗传变异。国内外对三叶青的研究主要集中在临床应用、化学成份以及药理作用方面，组织培养、快繁技术目前有少量报道，但有关其种质资源的离体保存技术以及其遗传评价均未见报道。
另外，三叶青种质资源田间种植难度大，保存工作量大，易受环境气候及病虫害影响，而组织培养正常继代保存转接频繁、成本高。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述技术的不足而提供一种不但保存10个月后植株生长正常，而且保存材料的后代未发生遗传性变异的三叶青种质资源的离体保存及保存后恢复生长的方法。
为了实现上述目的，本发明所提供的一种三叶青种质资源的离体保存方法，是以三叶青带腋芽的茎尖为外植体，用8%次氯酸钠表面消毒8min，无菌水冲洗2次，再用0.1%升汞灭菌5min，无菌水冲洗8次后，将其切割成1cm左右的茎段接入培养基1中，所述培养基1是在每升MS培养基中含3mg6-BA和0.5mgNAA；20天后将萌发的腋芽转接到培养基2中进行扩繁，所述培养基2是在每升MS培养基中含2mg 6-BA和1mg NAA；再30天后将增殖的不定芽转入培养基3中诱导生根，所述培养基3是在每升1/2MS培养基中含2mg IBA；再20天后将形成的试管苗转入培养基4中，所述培养基4是在每升pH值为6.4的1/4MS培养基中附加了100mg水杨酸(SA)、0.2 mg青鲜素、0.3mg6-BA、重量比为10% 蔗糖、 重量比为2% 琼脂，将已转入试管苗的培养基4于低温(8±1)℃和光照600 Lux(6h/天)条件下进行保存。
在此，所述的6-BA是6－苄氨基嘌呤；所述的NAA是吲哚乙酸；所述的IBA是吲哚丁酸；所述的1/2MS培养基、1/4MS培养基都是市售商品的商品名，可以直接购买到的，在此也不作详细说明。
发明所提供的一种三叶青种质资源的离体保存后恢复生长的方法，是将上述所述试管苗在保存材料恢复生长培养基中恢复生长，所述的保存材料恢复生长培养基是在每升MS培养基中附加了0.5 mg赤霉素、3mg6-BA和0.5mg NAA。
本发明提供的三叶青种质资源的离体保存方法，即三叶青试管苗的保存方法，与现有技术相比具有如下优点和积极效果:
1. 本发明首次利用在培养基中添加水杨酸和青鲜素保存三叶青试管苗，并首次利用附加了0.5 mg/L赤霉素的MS培养基对保存后的三叶青试管苗进行恢复培养。
2.本发明所提供的方法用于三叶青离体保存，试管苗保存10个月后存活率仍为100%，且植株生长正常，与常规正常培养基上的试管苗仅能存活3个月相比，大大延长了继代培养时间，使继代间隔由平时的1～2个月继代1次转为10个月继代1次。因此该方法可防止普通的传代保存法由于多次传代后造成的种性退化及病毒感染，保证种质的优良性和纯洁性。
3.减少生产中繁重的继代工作，而且降低生产操作过程中不必要的人力、物力资源的浪费，为实际生产降低生产成本和提高经济效益提供必要的途径。
4.与传统的三叶青田间种植保存相比，打破了植物生长季节的限制，可随时提供材料，工作量小，同时具有节省贮存空间，便于运输和交流等优点。
5.可避免该濒危种质资源的流失。
6.本发明方法保存10个月的三叶青试管苗，其后代POD同工酶酶谱及引物810的ISSR扩增谱带与对照没有差异，说明保存材料稳定，没有发生遗传变异。
附图说明
图1是保存前后试管苗POD同工酶谱；
图2是保存前后试管苗ISSR分子标记。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
实施例1：
本实施例提供的一种三叶青种质资源的离体保存方法，是以三叶青种质资源的离体保存方法，是以三叶青带腋芽的茎尖为外植体，用8%次氯酸钠表面消毒8min，无菌水冲洗2次，再用0.1%升汞灭菌5min，无菌水冲洗8次后，将其切割成1cm左右的茎段接入培养基1中，所述培养基1是在每升MS培养基中含3mg6-BA和0.5mgNAA；20天后将萌发的腋芽转接到培养基2中进行扩繁，所述培养基2是在每升MS培养基中含2mg 6-BA和1mg NAA；再30天后将增殖的不定芽转入培养基3中诱导生根，所述培养基3是在每升1/2MS培养基中含2mg IBA；再20天后将形成的试管苗转入培养基4中，所述培养基4是在每升pH值为6.4的1/4MS培养基中附加了100mg水杨酸(SA)、0.2 mg青鲜素、0.3mg6-BA、重量比为10% 蔗糖、 重量比为2% 琼脂，将已转入试管苗的培养基4于低温(8±1)℃和光照600 Lux(6h/天)条件下进行保存。
在此，所述的6-BA是6－苄氨基嘌呤；所述的NAA是吲哚乙酸；所述的IBA是吲哚丁酸；所述的1/2MS培养基、1/4MS培养基都是市售商品的商品名，在此不作详细说明。
本实施例提供的一种三叶青种质资源的离体保存后恢复生长的方法，是将试管苗在保存材料恢复生长培养基中恢复生长，所述的保存材料恢复生长培养基是在每升MS培养基中附加了0.5 mg赤霉素、3mg6-BA和0.5mg NAA。
根据本实施例提供的三叶青种质资源的离体保存及保存后恢复生长的方法所得到的试管苗及恢复生长后的移栽苗进行后代的遗传稳定性鉴定可知：
三叶青常规试管苗在不添加生长抑制剂的增殖培养基(对照)上生长3个月后，其顶梢及叶片枯萎，而本实施例试管苗在抑制生长的培养基上生长缓慢，10个月后株高仅有 2.0～3.3cm，气生根发达但植株生长正常，整株可用，大大延长了继代培养时间，使继代间隔由平时的1～2个月继代1次转为10个月继代1次，且移栽成活率为100%。经过氧化物酶同工酶(POD)、ISSR分子标记检测未发现有特异性条带产生(如图1、图2所示)。以上结果说明在该保存方法保存10个月的三叶青种质保持了良好的遗传稳定性。其中：图1中的同工酶谱自左向右泳道依次为保存前，保存5个月，保存10个月试管苗；图2中的ISSR分子标记自左向右泳道依次为Marker, 保存前，保存5个月，保存10个月试管苗。
上述同工酶检测的方法为，取植株心叶0.3g，加入500ml缓冲液冰浴上迅速研磨成匀浆，转移至离心管中10000rpm/min，4℃离心10min，上清液即为酶的粗提液；制备8%的分离胶、3%的浓缩胶，采用垂直板不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳法分析POD同工酶，每孔点样20μl。浓缩胶部分采用100V稳压电泳，进入分离胶后改用150V稳压电泳。当溴酚蓝色带跑至接近底部1cm时停止电泳；联苯胺法染色，凝胶成像分析仪(Bio-Rad公司，Gel Doc XR+型)上观察发现，离体保存材料后代植株和对照的酶谱一致(如图1所示)，说明用该保存方法保存10个月的三叶青种质在蛋白质水平上没有发生遗传变异。
上述ISSR分子标记鉴定的方法为：取植株心叶于研钵中加入液氮磨样。样品总DNA提取参照CTAB法(方法见参考文献：温景辉. 基于SSR分子标记的山葡萄种质遗传多样性研究与核心种质构建[D].吉林农业大学，2011)。扩增反应采用25μl反应体系(见表1，所有试剂均购自上海生工生物工程有限公司)，于美国Bio-Rad公司MJ Mini型扩增仪中进行PCR扩增，反应程序为:94℃预变性8min；94℃变性45s，50℃复性40s；72℃延伸60s，45个循环；72℃延伸10min，10℃保存。扩增反应结束后，将ISSR扩增产物5μl与6×溴酚蓝1μl混匀后注入2%琼脂糖凝胶上的点样孔中电泳，凝胶含0.05%溴化乙锭(EB)，缓冲液为l×Tris-乙酸(TAE)，分离电压120V，电泳120min后在凝胶成像分析仪(Bio-Rad公司，Gel Doc XR+型)上观察发现，离体保存材料后代株DNA经引物810的ISSR扩增条带与对照一致，没有特异性条带产生(如图2所示)，说明该方法保存10个月的三叶青种质在分子水平上没有发生遗传变异。
表1 PCR反应体系
| 成份 | 体积μL |
| 10×PCR buffer(Mg2+ free) | 2.5μL |
| 25mM Mg2+ | 1.5μL |
| 10mM dNTP | 0.5μL |
| 5U/μL Taq酶 | 0.5μL |
| 20μM引物810 | 2.0μL |
| 20ng/μL模板DNA | 2.0μL |
| 灭菌超纯水 | 16.0μL |
| 反应总体积 | 25μL |
注：引物810的序列为GAG AGA GAG AGA GAG AT。
Claims (2)
1.一种三叶青种质资源的离体保存方法，其特征是：所述三叶青种质资源的离体保存方法，是以三叶青带腋芽的茎尖为外植体，用8%次氯酸钠表面消毒8min，无菌水冲洗2 次，再用0.1%升汞灭菌5min，无菌水冲洗8 次后，将其切割成1cm 左右的茎段接入培养基1 中，所述培养基1 是在每升MS 培养基中含3mg6-BA 和0.5mgNAA ；20 天后将萌发的腋芽转接到培养基2 中进行扩繁，所述培养基2 是在每升MS 培养基中含2mg 6-BA 和1mg NAA ；再30天后将增殖的不定芽转入培养基3 中诱导生根，所述培养基3 是在每升1/2MS 培养基中含2mg IBA ；再20 天后将形成的试管苗转入培养基4 中，所述培养基4 是在每升pH 值为6.4的1/4MS培养基中附加了100mg水杨酸、0.2 mg青鲜素、0.3mg6-BA、重量比为10% 蔗糖、 重量比为2% 琼脂，将已转入试管苗的培养基4 于低温(8±1)℃和光照强度为600 Lux，光照时间为6h/天的条件下进行保存。
2.一种三叶青种质资源的离体保存后恢复生长的方法，其特征是：将权利要求1 所述的三叶青种质资源的离体保存方法得到的试管苗在保存材料恢复生长培养基中恢复生长，所述的保存材料恢复生长培养基是在每升MS 培养基中附加了0.5 mg 赤霉素、3mg6-BA 和0.5mg NAA。
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