CN104285792B - 一种台湾桤木的组织快繁方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种台湾桤木组织培养方法，包括茎段无菌体系建立、增殖继代培养、生根培养、炼苗移栽，增殖继代培养基包括0.5mg/L 6‑BA、0.15 mg/L KT、0.2 mg/L IBA；生根培养的培养基配方包括0.2mg/L的IBA、0.2mg/L的NAA、0.2mg/L的IAA。本发明为台湾桤木优质种苗的快速繁殖提供一条有效途径，其增殖系数较高，诱导的不定芽多而健壮，长势好无玻璃化现象，有利于生根和移栽，本发明的生根率和炼苗成活率等技术参数已能达到很高水平。

Description

一种台湾桤木的组织快繁方法
技术领域
本发明属于组织培养的植物再生领域，特别涉及台湾桤木的组织培养方法。
背景技术
近年来，随着重庆的经济快速发展和人们对木材产品的消费增加，木材、纸浆等原料的需求大增，而重庆本地木材原料的供给缺口很大。为了满足木材加工产业的需要，重庆一直以引进的速生桉和杨树为主大力发展短周期工业原料林，但是桉树原产热带，其耐寒性和对碱性紫色土的适应性较差，渝东南、三峡库区海拔1000m以上和渝西大面积的紫色土地区不适合发展速生桉树种；而长期的试验研究也表明杨树在重庆的生长受到立地条件的很大限制，不适合大面积推广和发展。因此研究开发出乡土、适生范围广、以用材为主要目的的树种，成了木材加工业产业链攻关任务中的首要环节。
台湾桤木(Alnus formosana.Makino)为桦木科(Betulaceae)桤木属(Alnus B.Ehm)的落叶阔叶大乔木，为非豆科菌根树种，原产于中国台湾，是国际公认的优良工业原料林树种。台湾桤木适应性强、速生、材质好，适应在碱性紫色土环境生长，耐寒性较强，根系发达且有根瘤，具有较强的固氮能力，种植后还可改良土壤。栽植试验表明，相同立地条件下，台湾桤木和杨树两者树高生长无明显差异，而桤木平均胸径比杨树大1/3以上，台湾桤木整体的生产量和生长速度高于杨树。其优良的特性正好能够弥补目前我市速封林发展中的一些不足，在重庆地区将有很大的推广和发展空间，是一种十分重要的用材树种，很有开发利用价值。引种台湾桤木，不仅可丰富我国南方人工阔叶林种类，改良土壤，治理环境，而且有较高的经济价值，具有广阔的推广前景。台湾桤木在重庆、福建、四川等南方广大地区得到迅速推广。目前，台湾桤木繁殖主要采用实生苗繁殖，其遗传保守性弱，个体差异大，育苗受季节限制，且难以对优株进行快速繁殖，已不能满足市场对优质台湾桤木种苗的需求。
发明内容
单靠实生苗繁殖已不能满足市场对优质台湾桤木种苗的需求，本发明的目的在于提供一种有效方法实现台湾桤木的规模化育苗。
本发明的目的是通过以下措施实现的：
一种台湾桤木组织快繁的方法，步骤包括无菌体系建立、增殖培养、生根培养、炼苗移栽，其特征在于：增殖继代培养基包括0.5mg/L的6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)、0.15mg/L的KT(激动素)、0.2mg/L的IBA(吲哚丁酸)，pH值为5.8。进一步地，所述增殖培养基还包括MS(Murashige and Skoog Stock)培养基、30g/L蔗糖和7g/L卡拉胶，调节pH值至5.8。激素是植物组织培养中的必需物质，同不定芽的诱导密切相关。不同激素组合对不同植株的不定芽诱导的影响不同。本发明的增殖培养基配方不仅有利于提高桤木的增殖系数，同时诱导的不定芽多而效果佳，长势好无玻璃化现象，有利于生根和移栽，提高存活率和存活质量。
上述生根培养的培养基配方包括0.2mg/L的IBA(吲哚丁酸)、0.2mg/L的NAA(萘乙酸)、0.2mg/L的IAA(吲哚乙酸)。进一步的，生根培养基还包括1/2MS培养基、30g/L蔗糖，PH值为5.8。使植株有效生根，30天生根率可达90％，且生根的条数、粗壮度均良好，根系平均数量为7.8条，植株叶片油绿，长势好。
上述无菌体系建立，采用0.1％升汞处理7min后，75％酒精处理10s，再1.5％浓度的CaCl2处理。外植体灭菌时间和灭菌方式对外植体灭菌成活率影响较大，以无菌CaCl2(氯化钙)溶液能降低褐化率。本发明组织快繁的外植体为台湾桤木顶部带芽茎段，带芽茎段长度为0.8～1.5cm。台湾桤木组培快繁技术的难点在于茎段外植体无菌体系建立。桤木茎段的表面有绒毛，且有2枚芽鳞，灭菌难度较大。同时，以桤木茎段为外植体易产生褐化，易造成植株死亡。本发明以春季即将萌动的幼嫩顶芽为最佳外植体，植株的苗龄越小越有利于后续外植体增殖启动诱导。
本发明所述台湾桤木的组培快繁方法，是通过对台湾桤木的离体培养，建立起台湾桤木的快速繁殖体系，包括以下步骤：
(1)外植体无菌体系建立：用枝剪快速剪下0.8～1.5cm顶部带芽茎段，流水冲洗15min，备用；在超净工作台上灭菌，采用0.1％升汞处理7min+75％酒精处理10s+1.5％浓度的CaCl2冲洗，灭菌后转接入MS(Murashige and Skoog Stock)空白培养基。茎段外植体成活率为9.1％。
(2)增殖继代培养：将成活的茎段外植体转入增殖继代培养基，增殖继代培养基为MS培养基+蔗糖30g/L+卡拉胶7g/L+6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.5mg/L+KT(激动素)0.15mg/L+IBA(吲哚丁酸)0.2mg/L，pH值为5.8。增殖系数平均 为3.4，叶色正常，植株无畸形，无玻璃化现象，继代周期为30天。
(3)生根培养：将增殖培养获得的丛生芽转接入生根培养基，生根培养基为1/2MS培养基+蔗糖30g/L+IBA(吲哚丁酸)0.2mg/L+NAA(萘乙酸)0.2mg/L+IAA(吲哚乙酸)0.2mg/L，PH值为5.8。30天生根率可达90％，根系平均数量为7.8条。
(4)炼苗移栽：将生根苗置于温室中不揭封口薄膜炼苗1周，1周后去掉封口膜，在瓶内加入少许自来水(为防止长菌)，置于通风良好的环境中继续炼苗4-5天；炼苗结束后，取出幼苗，用清水洗去根系表面附着的培养基，800倍多菌灵浸泡20min-30min，将生根苗移栽到轻基质(菇渣∶蛭石∶珍珠岩＝2∶1∶1)中生长，移栽成活率为89.6％。炼苗及苗期管护是移栽成功的关键。组培培养室温度为26±2℃，光照时间为12个小时，光照强度2000lx。
附图说明
图1为灭菌成活的外植体的照片图
图2为增殖继代培养阶段的照片图
图3为生根培养阶段的照片图
图4为炼苗移栽成活后植株照片图
有益效果
1.本发明为台湾桤木优质种苗的快速繁殖提供一条有效途径，其生根率炼苗成活率及存活质量，短时间内植株的高度、粗度等技术参数已能达到很高水平。
2.本发明桤木的增殖系数较高，诱导的不定芽多而健壮，长势好无玻璃化现象，有利于生根和移栽，提高存活率和存活质量。植株有效生根，且生根的条数、粗壮度均良好，植株叶片油绿，长势好。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
1.材料处理
选取春季快速生长的顶芽为外植体，用枝剪快速剪下1cm带芽茎段，流水冲洗15min，备用；在超净工作台上灭菌，采用0.1％升汞浸泡处理7min后，75％酒精浸泡处理10s，再1.5％浓度的CaCl2冲洗，灭菌后转接入MS空白培养基，附加蔗糖30g/L，卡拉胶7g/L，调节pH值至5.8。茎段外植体成活率9.1％。
接种100瓶，每瓶1株，3次重复。培养室温度为26±2℃，光照时间为12个小时，光照强度2000lx。培养20天后，统计成活率。灭菌成活的植株如图1所示。
2.增殖继代培养
激素是植物组织培养中的必需物质，同不定芽的诱导密切相关。当6-BA和KT浓度提高时，有利于提高桤木的增殖系数，但是植株生长异常表现增多，玻璃化现象加重，甚至出现植株枯萎死亡的情况。但是低浓度情况下，不能诱导出不定芽。IBA对不定芽的生长有明显的促进作用，但是在高浓度IBA情况下，不定芽的诱导效果较差且易诱导出过多的愈伤组织；IBA低浓度情况下，虽然有助于增殖系数的提高，但是不定芽生长势弱，出现较多的无效芽，这些无效芽在后续的转接中始终不能正常发育。
将灭菌成活的茎段外植体转入增殖培养基进行增殖继代培养。增殖继代培养基为MS培养基+蔗糖30g/L+卡拉胶7g/L+6-BA 0.5mg/L+KT 0.15mg/L+IBA 0.2mg/L，pH值为5.8。增殖系数平均为3.4，叶色正常，植株无畸形，无玻璃化现象，继代周期为30天接种20瓶，每瓶5棵萌芽苗，3次重复。培养室温度为26±2℃，光照时间为12个小时，光照强度2000lx。培养30天后，观察植株的启动增殖情况包括成活率、启动率和增殖率。增殖继代的植株如图2所示。
增殖系数＝每瓶形成的有效苗数/接种苗数
3.生根培养
随着IBA和NAA浓度的升高，植株生根率及平均生根条数呈先升高后降 低的趋势。在高浓度情况下，虽然生根率和生根数略有增加，但是植株的愈伤组织显著增加，部分根从愈伤组织生长出，植株叶片发黄，生长势弱。当IBA和NAA浓度较低的时候，生根率显著下降，平均生根数少。
植株经增殖继代培养后，选取生长健壮，苗高2-3cm的组培苗接种于生根培养基中。基本培养基为1/2MS培养基，附加蔗糖30g/L，卡拉胶7g/L，调节pH值至5.8，激素为IBA 0.2mg/L+NAA 0.2mg/L+IAA 0.2mg/L。接种20瓶，每瓶5棵，3次重复。培养室温度为26士2℃，光照时间为12个小时，光照强度2000lx。培养30天后，观察植株的生根情况包括生根率、根系长度和生根数、生根苗数量、平均生根条数及植株生长势。生根结果如图4所示。
本实验对生长势进行量化，比如定义叶色正常，植株无畸形，无玻璃化现象的幼苗定义为4分；叶色黄或褐，植株畸形，玻璃化的幼苗定义为1分。从1-4分别用-、+、++、+++表示。
生根培养的实验结果
(注：“+++”、“++”、“+”、“-”分别表示生长势好、较好、一般、差。)
4.炼苗移栽
当植株在生根培养基中培养30d后，当根长出1cm以上时，选取生长健壮的植株，将其置于温室中不揭封口薄膜炼苗1周，1周后去掉封口膜，在瓶内加入少许自来水(为防止长菌)，置于通风良好的环境中继续炼苗4-5天。炼苗结束后，取出幼苗，用清水洗去根系表面附着的培养基，800倍多菌灵浸泡20min-30min，然后将其移栽入不同基质中。采用黄壤土、紫色土和轻基质(菇渣∶蛭石∶珍珠岩＝2∶1∶1)作为基质进行对比研究。每种处理分别移栽25株，3次重复。组培苗炼苗后分别移栽至装有不同基质的穴盘里。待桤木幼苗移栽60天后，进行株高和地径测定以及成活率的统计。
不同基质条件下对成活率和株高的影响差异不显著，成活率约为89％。但是轻基质中生长的桤木组培苗地径和株高更佳。
不同基质条件下桤木的生长状况(平均值±标准误差)
注：不同字母表示差异显著(P＜0.05)。

Claims (1)

1. 一种台湾桤木组织快繁的方法，包括以下步骤：
（1）无菌体系建立：用枝剪快速剪下0.8～1.5cm顶部带芽茎段，流水冲洗15min，备用；在超净工作台上灭菌，采用0.1%升汞处理7min后，75%酒精处理10s，再1.5%浓度的CaCl2冲洗，灭菌后转接入MS空白培养基；
（2）增殖继代培养：将成活的茎段外植体转入增殖继代培养基，增殖继代培养基为MS培养基+蔗糖30g/ L、卡拉胶7g/L、0.5mg/ L6-苄氨基腺嘌呤、0.15 mg/L激动素、0.2 mg/L吲哚丁酸，pH值为5.8；
（3）生根培养：将增殖培养获得的丛生芽转接入生根培养基，生根培养基为1/2MS培养基+蔗糖30g/L、0.2mg/L吲哚丁酸、0.2mg/L萘乙酸、0.2mg/L吲哚乙酸，PH值为5.8；
（4）炼苗移栽：将生根苗置于温室中不揭封口薄膜炼苗1周，1周后去掉封口膜，在瓶内加入少许自来水，置于通风良好的环境中继续炼苗4-5天；炼苗结束后，取出幼苗，用清水洗去根系表面附着的培养基，800倍多菌灵浸泡20min-30min，将生根苗移栽到菇渣：蛭石：珍珠岩按2：1：1重量比组成的轻基质中生长，培养温度为26±2℃，光照时间为12个小时，光照强度2000 lx。
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