CN104904592B

CN104904592B - 一种龙州半蒴苣苔的离体保存方法

Info

Publication number: CN104904592B
Application number: CN201410739913.5A
Authority: CN
Inventors: 李翠; 张占江; 缪剑华; 韦坤华; 李林轩; 韦莹; 郭晓云; 吕惠珍; 王诺; 王一诺; 王晓峰
Original assignee: Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants
Current assignee: Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants
Priority date: 2014-12-09
Filing date: 2014-12-09
Publication date: 2017-03-15
Anticipated expiration: 2034-12-09
Also published as: CN104904592A

Abstract

本发明公开了一种龙州半蒴苣苔的离体保存方法，包括龙州半蒴苣苔的组培快繁，再利用组培快繁得到具有4～6片叶的试管苗，接种到保存培养基进行离体保存，本发明保存培养基为1/2MS+PPP3331.5mg/l+AC1.0％+蔗糖2.5％+琼脂0.4％。培养基温度为15±1℃，光照强度1400～1600lx，光照时间为8～10小时/天。利用本发明的方法可以使龙州半蒴苣苔种质资源得到长期的保存，并且得到的种苗健壮、成活率高，可在短期内提供大量龙州半蒴苣苔的优质种苗，有利于龙州半蒴苣苔种质资源合理开发和可持续利用。

Description

一种龙州半蒴苣苔的离体保存方法

技术领域

本发明属于组织培养技术领域，具体地，涉及龙州半蒴苣苔的离体保存方法。

背景技术

广西地处我国苦苣苔科植物分布和特有中心位置，是半蒴苣苔属的主要产地之一，资源丰富(全国23种，广西11种，占全国种类的47.8％)。由于半蒴苣苔属多数种类的生长环境都十分恶劣，许多种处于濒危状态，其中产于广西龙州的龙州半蒴苣苔被收入《中国植物红皮书》，对其进行保护具有十分重要的意义。龙州半蒴苣苔具有消肿止痛的功效，能够治疗蛇伤，因此找出一种种质资源保护的有效新途径，对龙州半蒴苣苔资源的修复和再生，防止流失、退化和灭绝，保障资源的可持续利用具有重要意义。

龙州半蒴苣苔目前仅在广西龙州县和云南东南部有分布，对环境条件要求较高，适生的温度范围、湿度范围和土壤酸碱度范围比较小，在引种栽培时较难成活，给种质保存与利用带来较大的困难。目前如何妥善保存稀有的种质资源已成为一个急需解决的问题，而组织培养为离体种质保存提供了最便捷、稳定的手段。

目前对于龙州半蒴苣苔离体保存的研究还比较少，申请人在公开号为CN104041412 A的中国发明专利“一种贵州半蒴苣苔的组织培养快速繁殖方法”中公开了利用组织培养技术快速繁殖贵州半蒴苣苔的方法，但是并没有公开贵州半蒴苣苔是如何进行保存的，另外申请人还在公开号为CN103651127A的中国发明专利“一种弄岗唇柱苣苔的离体保存方法”一文中公开了对弄岗唇柱苣苔的离体保存时将生长健壮的弄岗唇柱苣苔试管苗单芽切下接种到最佳保存培养基上保存300d，但是并没有公开此最佳保存培养基的具体配比，而对于离体保存来说，其保存培养基的配比是其保存能否成功的一个重要条件，因此，对其保存培养基的研究和公开具有十分重要的意义。

发明内容

针对目前存在的问题，本发明提供一种龙州半蒴苣苔的离体保存方法，利用组织培养技术对其进行离体繁殖，通过采用合适的保存培养基对其进行离体保存，不仅可以有效挽救濒危的龙州半蒴苣苔物种，使之成为可再生资源，还可以为龙州半蒴苣苔种植提供优良一致种苗的技术和室内离体保存提供技术支持。是目前保护和持续开发利用龙州半蒴苣苔植物的多、快、好、省的对策。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

一种龙州半蒴苣苔的离体保存方法，包括如下步骤：

(1)外植体诱导培养：取野外采集的龙州半蒴苣苔的顶芽作为外植体，在70％乙醇中浸泡30～45s，无菌水冲洗1～3次，投入0.1％升汞4min，再用无菌水冲洗1～3次，再次投入0.1％升汞4min，最后用无菌水冲洗1～3次后切割为0.5～1.0cm长接种在接种培养基上，培养7～14天，顶芽分化形成嫩黄绿色丛生芽；所述培养基的pH值为5.8～6.0，培养温度为23～25℃，光照强度1200～1600lx，光照时间为10～12小时/天；

(2)丛生芽壮苗生根培养：经20～30天，丛生芽长至2～3cm，转入生根培养基培养1个月后，长成具3～5条根和4～6片叶的试管苗；所述培养基的pH值为5.8，温度为23～26℃，光照强度2000～2400lx，光照时间为10～12小时/天；(3)试管苗离体保存：将由丛生芽分化产生的具有4～6片叶的试管苗，接种到保存培养基进行离体保存，所述的保存培养基为1/2MS+CCC1.0mg/l+AC0.5％+蔗糖2.5％+琼脂0.4％；所述培养基的pH值为5.8～6.0，温度为15±1℃，光照强度1400～1600lx，光照时间为8～10小时/天。

前述龙州半蒴苣苔的离体保存方法中，步骤(1)中所述的接种培养基为：MS+6-BA0.5mg/l+NAA0.5mg/l+KT0.3mg/l+蔗糖2.5％(每升培养基里含有蔗糖25～30g+琼脂0.4％(每升培养基里面含有琼脂4～4.5g)。

前述龙州半蒴苣苔的离体保存方法中，步骤(2)中所述的壮苗生根培养基为：1/2MS+IBA1.0mg/l+6-BA0.3mg/l+AC0.5％+蔗糖2.5％+琼脂0.4％。

本发明的有益效果：

本发明打破了对龙州半蒴苣苔离体保存研究的空白，利用本发明的方法可以使种质资源得到长期的保存，并且得到的种苗健壮、成活率高，可在短期内提供大量龙州半蒴苣苔的优质种苗，有效解决了龙州半蒴苣苔种质资源合理开发和可持续利用问题。

附图说明

图1表示本发明光强对龙州半蒴苣苔离体保存的影响。

其中，横坐标表示光强(lx)，纵坐标表示保存天数(d)。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

一种龙州半蒴苣苔离体保存方法，通过以下方法实现：

一、龙州半蒴苣苔经快速繁殖得试管苗：

1、供试材料

龙州半蒴苣苔Hemiboea lungzhouensis W.T.Wang ex Z.Y.Li顶芽。

2、外植体的消毒处理

将选择的顶芽，在70％乙醇中浸泡30～45s，无菌水冲洗1～3次，投入0.1％升汞4min，再用无菌水冲洗1～3次，再次投入0.1％升汞4min，最后用无菌水冲洗1～3次。

3、外植体诱导

将采集到的龙州半蒴苣苔顶芽灭菌后切割为0.5～1.0cm长的小段，接种在培养基(MS+6-BA0.5mg/l+NAA0.5mg/l+KT0.3mg/l+蔗糖2.5％和+琼脂0.4％)上，培养7～14天，顶芽分化形成丛生芽，丛生芽可切割重复培养。在此培养基上，长成完整试管苗，供移栽。所述培养基的pH值为5.8～6.0，培养温度为23～25℃，光照强度1200～1600lx，光照时间为10～12小时/天；

4、丛生芽壮苗生根

上一步骤中顶芽培养14天左右，可得到大量丛生芽(繁殖系数1∶4～8倍)，又经过20～30天的培养可以得到高约2～3cm芽体，转入壮苗生根培养基(1/2MS+IBA1.0mg/l+6-BA0.3mg/l+AC0.5％+蔗糖2.5％+琼脂0.4％)，培养基的温度为23～26℃，光照强度2000～2400lx，光照时间为10～12小时/天；培养1个月后加强光(3000Lx及以上)，培养一个月左右，试管苗可达到移苗标准。整个周期为2～3个月。

5、试管苗移栽

当试管苗至少具有4～6片伸展叶，3条以上长度大于3cm的不定根，高度为6cm左右的健康植株时，即可出瓶移栽，先要经室内炼苗2～3天，出瓶时不能折伤叶片和根尖，清除根系上的培养基，分株种植，种植基质为石灰岩∶珍珠岩∶泥炭土＝3∶3∶4，基质需经过高温高压灭菌，盖上透光率50％的黑色遮阴网以保持较低光强，2天浇水1次以保持湿润。栽后放在大棚内，隐蔽度为70％，棚内温度控制在20℃～28℃，注意保湿。约20天试管苗长出新根，揭开遮阴网，单株移栽入盆。盆土为河沙∶石灰岩∶草炭土＝1∶3∶6。试管苗移栽不宜太深，移栽的成活率可达97％。

二、取上述所得龙州半蒴苣苔试管苗进行离体保存

选择上述具有4～6片叶龙州半蒴苣苔试管苗为试验材料进行离体保存。

下面对其进行培养基类型、温度、光强、生长抑制剂的筛选，保存天数均以试管苗存活率为60％进行统计。

1、培养基对龙州半蒴苣苔离体保存的影响

将试验材料接种到试验设计MS、1/2MS、1/4MS三种培养基上，接种10瓶，每瓶5株单芽；培养基中含有25g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养温度25±1℃，光强2000lx，光照9h/d；结果表明，龙州半蒴苣苔在1/2MS培养基上保存时间最长，为246天，具体结果见表1。

表1培养基对龙州半蒴苣苔离体保存时间的影响

2、温度对龙州半蒴苣苔离体保存的影响

将试验材料接种到1/2MS培养基上分别放置于温度12、15℃，18℃，21℃、24℃的光照培养箱培养，接种10瓶，每瓶5株单芽；培养基中含有25g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，光强2000lx，光照9h/d，结果表明，龙州半蒴苣苔在温度为15℃的培养箱中保存时间最久，为291天，具体见表3。

表2温度对龙州半蒴苣苔离体保存时间的影响

3、光强对龙州半蒴苣苔离体保存的影响

将试验材料接种到1/2MS培养基上，设计0、1200lx，1400lx，1600lx、1800lx五种光照强度，每种光强接种10瓶，每瓶5株单芽；培养基中含有25g/L蔗糖和4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养温度15±1℃，光照9h/d，结果表明，光强为1600lx时龙州半蒴苣苔保存时间最久，为335天，具体比较结果见图1。

4、生长抑制剂对龙州半蒴苣苔离体保存的影响

将试验材料接种到添加下述浓度CCC、ABA、PPP₃₃₃的1/2MS培养基上，接种10瓶，每瓶5株单芽；培养基中含有25g/l蔗糖和4g/l的琼脂，培养基的pH值为5.8，培养温度15±1℃，光强1600lx，光照9h/d，结果表明，龙州半蒴苣苔在PP333浓度为1.5mg/l是保存时间最久，为341天，具体情况见表3。

表3激素对龙州半蒴苣苔保存时间的影响

通过上述实验，最终确定龙州半蒴苣苔离体保存培养基为1/2MS+PP3331.0mg/l+AC0.5％+蔗糖2.5％+琼脂0.4％；培养基温度为15±1℃，光照强度1400～1600lx，光照时间为8～10h/d，保存时间为341天。

5、生长状况考察

离体保存的龙州半蒴苣苔试管苗的生长恢复情况考察：将生长健壮的龙州半蒴苣苔试管苗单芽切下接种到最佳保存培养基上保存300d后，存活的半蒴苣苔试管苗接种到MS+6-BA1.0mg/l+NAA0.5mg/l+KT0.5mg/l，添加AC0.1％，添加2.5％的蔗糖和0.4％的琼脂培养基上，每30d继代1次，继代3次后，以株高、繁殖倍数、单株生根率为指标考察龙州半蒴苣苔试管苗的恢复情况，见表4。从对比中可以看出，经过300d离体保存后的试管苗恢复情况良好。

表4离体保存后恢复的试管苗和保存前试管苗的比较

本发明中所用的物质分别注释为6-BA(6-苄氨基嘌呤)，NAA(萘乙酸)，KT(激动素)，IBA(吲哚丁酸)，AC(活性炭)，CCC(矮壮素)，PPP333(多效唑)，ABA(脱落酸)。

Claims

1.一种龙州半蒴苣苔的离体保存方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)外植体诱导培养：取野外采集的龙州半蒴苣苔的顶芽作为外植体，在70％乙醇中浸泡30～45s，无菌水冲洗1～3次，投入0.1％升汞4min，再用无菌水冲洗1～3次，再次投入0.1％升汞4min，最后用无菌水冲洗1～3次后切割为0.5～1.0cm长接种在接种培养基上，培养7～14天，顶芽分化形成嫩黄绿色丛生芽；所述的接种培养基为：MS+6-BA0.5mg/l+NAA0.5mg/l+KT0.3mg/l+蔗糖2.5％+琼脂0.4％；所述接种培养基的pH值为5.8～6.0，培养温度为23～25℃，光照强度1200～1600lx，光照时间为10～12小时/天；

(2)丛生芽壮苗生根培养：经20～30天，丛生芽长至2～3cm，转入壮苗生根培养基培养1个月后，长成具3～5条根和4～6片叶的试管苗；所述的壮苗生根培养基为：1/2MS+IBA1.0mg/l+6-BA0.3mg/l+AC0.5％+蔗糖2.5％+琼脂0.4％；所述壮苗生根培养基的pH值为5.8～6.0，温度为23～26℃，光照强度2000～2400lx，光照时间为10～12小时/天；

(3)试管苗离体保存：将由丛生芽分化产生的具有4～6片叶的试管苗，接种到保存培养基进行离体保存，所述的保存培养基为1/2MS+CCC1.0mg/l+AC0.5％+蔗糖2.5％+琼脂0.4％；所述保存培养基的pH值为5.8～6.0，温度为15±1℃，光照强度1400～1600lx，光照时间为8～10小时/天。