CN102668989B - 一种甘蔗液体浅层培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种甘蔗液体浅层培养方法，包括抑菌剂的配制、培养容器消毒、培养基配制、诱导培养、增殖培养、生根培养和瓶苗移栽。采用本发明的甘蔗液体浅层培养方法，培养基无需高压灭菌，简化了培养基的配制环节；本发明的培养基中省去了琼脂粉，并且提高增殖率29.2%以上，每丛壮苗数提高53.9%以上，可以降低组培成本25%以上；而且，粗壮的瓶苗有利于瓶苗移栽。本发明具有操作简单，投资少，实用性强，推广性好的特点，适合在甘蔗组培工厂化育苗中推广。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物种苗培育方法，具体涉及一种甘蔗液体浅层培养方法，属生物技术领域。
背景技术
甘蔗（Saccharum Complex）是我国最主要的糖料作物，甘蔗糖产量占我国食糖总产的92%，因此，蔗糖生产关系我国食糖安全，而蔗糖生产则取决于原料甘蔗的生产，种苗质量直接影响原料蔗的产量和品质。
甘蔗组织培养，一方面可以扩大其繁殖系数，从而实现规模化繁殖；另一方面，可以在保存其原有的优良性状的基础上，实现甘蔗种苗的脱毒和快速繁殖。甘蔗组织培养的成本主要包括组培苗生产所需的培养基、设施设备的折旧费、供电成本、耗材和人工成本。常规的甘蔗组织培养方法要求接种过程、培养过程都在无菌培养基中进行，无菌消毒耗能大，人工操作成本高。如果能通过培养基改造，获得既保证甘蔗组织正常生长，又具有杀菌、抗菌或抑菌功能的培养基，菌类也就不能在培养基中滋生。由于这种改造后的培养基不需要进行高温高压灭菌，一方面可以降低甘蔗组织培养对设施设备的要求，尤其不需要高温高压灭菌所需配置的高压锅设备，缩减了投资成本，电能消耗也将大幅度降低；另一方面，采用液体浅层培养方法，又可以省去琼脂粉的用量，从而使组培成本更低。采用这种培养基开展甘蔗组织培养，组培环节大为简化，人工操作的速度大幅提高，从而降低了人工成本。此外，由于改造后的培养基自身具有杀菌、抗菌或抑菌作用，组织培养过程中的污染问题得到有效控制，甘蔗组织培养无需在严格的无菌环境中进行，从根本上简化了甘蔗组织培养。
申请号为201110311185.4的发明专利申请“一种开放式培养甘蔗脱毒种苗的方法”，介绍了一种培养基无需高压灭菌，不需要超净工作台，接种只要在自然、开放的环境中进行的开放式培养甘蔗脱毒种苗的方法，从根本上简化组培环节，可降低组培成本20%；但是，组培苗的增殖系数和壮苗数/丛，还是有局限性。
本发明的甘蔗液体浅层培养方法，建立了甘蔗液体浅层培养的技术体系，使培养成本更低，瓶苗更壮，为甘蔗种苗生产提供了一种很实用的关键技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种甘蔗液体浅层培养方法。
本发明的目的是通过以下方法实现的。
本发明的一种甘蔗液体浅层培养方法，包括抑菌剂的配制、培养容器消毒、培养基配制、诱导培养、增殖培养、生根培养和瓶苗移栽，其特征在于：
1. 抑菌剂的配制：使用益培隆杀菌剂配制抑菌剂1号和抑菌剂2号。抑菌剂1号的配制方法：在益培隆杀菌剂A瓶药剂中加入20 ml蒸馏水稀释后与B瓶药剂混合，并用蒸馏水定容到100 ml，即为抑菌剂1号；抑菌剂2号的配制方法：在益培隆杀菌剂A瓶药剂中加入20 ml蒸馏水稀释后与B瓶药剂混合，加入1g头孢霉素，并用蒸馏水定容到100 ml，即为抑菌剂2号；所述益培隆杀菌剂由A瓶药剂和B瓶药剂组成，由市场购得；
2. 培养容器消毒：将培养瓶及瓶盖在抑菌剂1号与水的体积比为0.3 %～0.5 %（Ｖ/Ｖ）的水溶液中浸泡不少于10 h，保存备用；
3. 培养基配制：诱导培养基为；MS＋2.0 mg/L 6-BA ＋0.5～2.0 mg/L KT +5 ml/L抑菌剂2号＋30 g/L蔗糖，pH5.8；增殖培养基为MS+0.5～1 mg/L 6-BA+0.5～1 mg/L KT+3～5 ml/L抑菌剂2号+30.0 g/L蔗糖，pH5.8；生根培养基为1/2MS+1～3 mg/L NAA +3ml/L抑菌剂2号＋30 g/L蔗糖；所述MS培养基为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；所述6-BA，指6-苄氨基嘌吟；所述KT，指6-糠氨基嘌吟；所述NAA，指〆-萘乙酸；配制培养基时，先不加抑菌剂2号，按各培养基配方配齐其他原料后，定容、煮开，当温度冷却至50℃时，再按各培养基配方添加抑菌剂2号，用1 mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到培养容器中，封口，冷却后备用；
4. 诱导培养：取健壮的甘蔗植株，从最高肥厚带往下30 cm处切下，用75%（Ｖ/Ｖ）的酒精表面消毒；剥离外层叶鞘，取含生长点0.5～1cm长的茎尖，接种到诱导培养基上。诱导培养基的液面与培养瓶底面的距离为0.3～0.5cm，15天转接一次；培养室温度为25～28 ℃，光照12h，光照强度为1200 ～1500 lx；
5. 增殖培养：取0.2 cm2诱导培养的丛生芽．接种到增殖培养基上，增殖培养基的液面与培养瓶底面的距离为0.8～1cm，15天转接一次；培养室温度为25～28 ℃，光照12h，光照强度为1200 ～ 1500 lx；
6. 生根培养：将苗高不低于2.0cm、且茎粗不小于0.2cm的增殖苗，转入生根培养基上，生根培养基的液面与培养瓶底面的距离为0.8～1cm，20～30天移栽；培养室温度为25～28 ℃，光照12h，光照强度为1200 ～1500 lx；
7. 瓶苗移栽：将生根苗取出后，洗净根部的培养基，用800倍的多菌灵浸泡30min后移栽至穴盘，放到大棚内。移栽的基质为河沙，种植后浇透水，大棚上层用50%以上的遮光网遮盖，移栽的环境温度为20～32℃。
本发明的应用效果
1. 本发明的一种甘蔗液体浅层培养方法对甘蔗增殖系数和污染率的影响：在甘蔗液体浅层培养过程中比较容易产生细菌污染，所以，在抑菌剂２号中加入了头孢霉素，专用于抑制细菌的生长。由于本发明的甘蔗液体浅层方法，配制的培养基是无需高温高压灭菌，所以在增殖过程中，除了要考虑增殖率外，还要考虑污染率的问题。通过实验证实，本发明的甘蔗液体浅层培养方法与开放组培方法和常规的甘蔗组培方法相比，从增殖系数和壮苗数来看，液体浅层培养的都是最高，分别达到6.2和8.62,其次是开放培养达到4.8和5.60,常规组培最低只达到3.2和4.85,三者之间的差异都达到极显著性水平；从污染率看，常规组培污染率最高达0.5%,其余二种只有0.2%和0.3%，三者之间差异不显著。从瓶苗的生长状况看，本发明的甘蔗液体浅层培养方法也是最好的。由于甘蔗液体浅层培养方法，培养基是不经过高温高压灭菌，激素和营养元素损失较少，加上是液体培养，培养基中的养分能够得到充分的利用，使甘蔗组培苗更绿，更壮。本发明的甘蔗液体浅层培养方法与其它二种组培方法对甘蔗增殖系数、壮苗数和污染率的影响如表1所示。
表１ 液体浅层培养的增殖情况
备注：壮苗指：茎粗不小于1.5 mm，且苗高不低于2 cm。
表1采用字母标记方法来表示多重比较结果，按照统计分析平均数多重比较标记字母法规定，用小写拉丁字母a、b、c、d......表示差异显著水平α＝0.05，用大写拉丁字母A、B、C、D......表示差异显著水平α＝0.01。先将各处理平均数由大到小排列，最大平均数后标记a或A，并将该平均数与以下各平均数相比，差异显著的依次标记b或B。依次类推，不显著的标记同一字母。两平均数之间凡有相同字母的即为差异不显著，否则为差异显著。
2. 本发明的一种甘蔗液体浅层培养方法对甘蔗生根率和污染率的影响：在生根过程中，本发明的甘蔗液体浅层培养方法与开放组培方法和常规的甘蔗组培方法相比，结果如表2所示，生根率和污染率都没有太大差异；从瓶苗的生长状况看，用本发明的液体浅层培养方法，甘蔗组培苗茎更粗，叶片更绿，苗壮。
表2 液体浅层培养的甘蔗瓶苗生根、生长情况
3. 利用L9(34)正交表对本发明的一种甘蔗液体浅层培养方法中的抑菌剂2号和NAA的不同浓度对生根率和污染率的影响进行试验，其结果如表3，表4和表5所示：从表3的R值大小可以看出，不同NAA浓度对生根率影响最大对污染率影响不大；抑菌剂2号的不同浓度对污染率影响最大，对生根率影响不大。从第3列和第4列相对应的R值大小看，二者之间的交互作用不明显。从表4中可以看出，NAA浓度以3 mg/L为好，生根率达95.7%。与其它2种浓度的差异达到极显著水平。从表5中可以看出，每升培养基中加入3 ml抑菌剂2号比4ml和5 ml抑菌剂2号，污染率高，差异达显著性水平，每升培养基中加入4ml和5 ml抑菌剂2号，其污染率差异不显著。
表3 甘蔗液体浅层培养方法中抑菌剂2号和NAA的不同浓度对生根率和污染率的影响
注：培养基其它成份为：1/2MS+20 g/L蔗糖+3.5 g/L琼脂粉，pH5.8；甘蔗品种为：ROC22
表3中的K1表示第1个水平试验结果的平均数；K2表示第2个水平试验结果的平均数；K3表示第3个水平试验结果的平均数；R表示水平间的最大极差。
表4 NAA的不同浓度对生根率影响的多重比较
表5 抑菌剂2号的不同浓度对污染率影响的多重比较
本发明的一种甘蔗液体浅层培养方法中抑菌剂1号和抑菌剂2号对甘蔗增殖丛芽污染的影响：我们设计了抑菌剂1号和抑菌剂2号的对比试验，结果如表6所示。试验结果表明，以抑菌剂2号为好，甘蔗增殖丛芽污染率为0，而使用抑菌剂1号的情况下，污染率为46.7 %。
表6 培养基中不同抑菌剂对甘蔗丛芽增殖中污染率的影响
备注：抑菌剂1号和抑菌剂2号的浓度皆为 5 ml/L。
本发明具有如下有益效果
1. 采用本发明的甘蔗液体浅层培养方法，培养基无需高压灭菌，简化培养基配制环节；本发明的培养基中省去了琼脂粉，并且提高了增殖率和壮苗数，从而降低了组培成本。
2. 液体浅层培养可以提高增殖率29.2%以上，每丛壮苗数提高53.9%以上。同时培养出来的瓶苗更加粗壮，有利于瓶苗的移栽。
3. 本发明操作简单，实用性强，推广性好。
4. 液体浅层培养与传统组培对比，可以降低成本25%以上。
5. 本发明操作简单，投资少，适合在甘蔗组培工厂化育苗中推广。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明而不是限制本发明，以下结合实例加以说明。
实施例一：一种甘蔗液体浅层培养方法
一种甘蔗液体浅层培养方法，包括以下步骤：
1. 抑菌剂的配制：使用益培隆杀菌剂配制抑菌剂１号和抑菌剂2号；抑菌剂１号的配制方法：在益培隆杀菌剂A瓶中加入10 ml蒸馏水稀释后与B瓶混合，再用蒸馏水定容到100 ml，即为抑菌剂１号；抑菌剂2号的配制方法：在益培隆杀菌剂A瓶中加入10 ml蒸馏水稀释后与B瓶混合，再加1g头孢霉素，用蒸馏水定容到100 ml，即为抑菌剂2号；
2. 器皿消毒：培养瓶及瓶盖在0.5%（Ｖ/Ｖ）抑菌剂1号的水溶液中浸泡10h后取出备用；
3.培养基配制：诱导培养基为；MS＋2.0 mg/L 6-BA ＋1.0 mg/L KT +5 ml/L抑菌剂2号＋30 g/L蔗糖，pH5.8；增殖培养基为MS+1 mg/L 6-BA+1mg/L KT+5 ml/L抑菌剂2号+30.0 g/L蔗糖，pH5.8；生根培养基为1/2MS+3 mg/L NAA +5ml/L 抑菌剂2号＋30 g/L蔗糖；配制培养基时，先不加抑菌剂2号，按各培养基配方配齐其他原料后，定容、煮开，当温度冷却至50℃时，再按各培养基配方添加抑菌剂2号，用1 mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到培养容器中，封口，冷却后备用；
4.诱导培养：取健壮的甘蔗植株，从最高肥厚带往下30 cm处切下，用75%（Ｖ/Ｖ）的酒精表面消毒；剥离外层叶鞘，取含生长点0.5～1cm长的茎尖，接种到诱导培养基上。诱导培养基的液面与培养瓶底面的距离为0.3～0.5cm，15天转接一次；培养室温度为25～28 ℃，光照12h，光照强度为1200 ～1500 lx；
5.增殖培养：取0.2 cm2诱导培养的丛生芽．接种到增殖培养基上，增殖培养基的液面与培养瓶底面的距离为0.8～1cm，15天转接一次；培养室温度为25～28 ℃，光照12h，光照强度为1200～1500 lx；
6.生根培养：将苗高不低于2.0cm、且茎粗不小于0.2cm的增殖苗，转入生根培养基上，生根培养基的液面与培养瓶底面的距离为0.8～1cm，20～30天后移栽；培养室温度为25～28 ℃，光照12h，光照强度为1200 ～1500 lx；
7.瓶苗移栽：将生根苗取出后，洗净根部的培养基，用800倍的多菌灵浸泡30min后移栽至穴盘，放到大棚内，移栽的基质为河沙，种植后浇透水，大棚上层用50%以上的遮光网遮盖；移栽的环境温度为22～30 ℃。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
Claims (3)
1.一种甘蔗液体浅层培养方法，包括抑菌剂的配制、培养容器消毒、培养基配制、诱导培养、增殖培养、生根培养和瓶苗移栽，其特征在于：
（1）抑菌剂的配制：使用益培隆杀菌剂配制抑菌剂1号和抑菌剂2号；抑菌剂1号的配制方法：在益培隆杀菌剂A瓶药剂中加入20 ml蒸馏水稀释后与B瓶药剂混合，并用蒸馏水定容到100 ml，即为抑菌剂1号；抑菌剂2号的配制方法：在益培隆杀菌剂A瓶药剂中加入20 ml蒸馏水稀释后与B瓶药剂混合，加入1g头孢霉素，并用蒸馏水定容到100 ml，即为抑菌剂2号；
（2）培养容器消毒：将培养瓶及瓶盖在抑菌剂1号与水的体积比为0.3 %～0.5 %的水溶液中浸泡不少于10 h，保存备用；
（3）培养基配制：诱导培养基为；MS＋2.0 mg/L 6-BA ＋0.5～2.0 mg/L KT +5 ml/L抑菌剂2号＋30 g/L蔗糖，pH5.8；增殖培养基为MS+0.5～1 mg/L 6-BA+0.5～1 mg/L KT+3～5 ml/L抑菌剂2号+30.0 g/L蔗糖，pH5.8；生根培养基为1/2MS+1～3 mg/L NAA +3ml/L抑菌剂2号＋30 g/L蔗糖；所述MS培养基为1962年，Murashige和Skoog公开的MS培养基；所述6-BA，指6-苄氨基嘌吟；所述KT，指6-糠氨基嘌吟；所述NAA，指〆-萘乙酸；配制培养基时，先不加抑菌剂2号，按各培养基配方配齐其他原料后，定容、煮开，当温度冷却至50℃时，再按各培养基配方添加抑菌剂2号，用1 mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到培养容器中，封口，冷却后备用；
（4）诱导培养：取健壮的甘蔗植株，从最高肥厚带往下30 cm处切下，用75%（Ｖ/Ｖ）的酒精表面消毒；剥离外层叶鞘，取含生长点0.5～1cm长的茎尖，接种到诱导培养基上；诱导培养基的液面与培养瓶底面的距离为0.3～0.5cm，15天转接一次；培养室温度为25～28 ℃，光照12h，光照强度为1200 ～1500 lx；
（5）增殖培养：取0.2 cm2诱导培养的丛生芽，接种到增殖培养基上，增殖培养基的液面与培养瓶底面的距离为0.8～1cm，15天转接一次；培养室温度为25～28 ℃，光照12h，光照强度为1200 ～ 1500 lx；
（6）生根培养：将苗高不低于2.0cm、且茎粗不小于0.2cm的增殖苗，转入生根培养基上，生根培养基的液面与培养瓶底面的距离为0.8～1cm，20～30天移栽；培养室温度为25～28 ℃，光照12h，光照强度为1200 ～1500 lx；
（7）瓶苗移栽：将生根苗取出后，洗净根部的培养基，用800倍的多菌灵浸泡30min后移栽至穴盘，放到大棚内；移栽的基质为河沙，种植后浇透水，大棚上层用50%以上的遮光网遮盖，移栽的环境温度为20～32℃。
2.根据权利要求1所述的一种甘蔗液体浅层培养方法，其特征在于所述培养容器消毒，将培养瓶及瓶盖在体积比为0.5%抑菌剂1号的水溶液中浸泡10h。
3.根据权利要求1所述的一种甘蔗液体浅层培养方法，其特征在于所述培养基配制的内容如下：诱导培养基为；MS＋2.0 mg/L 6-BA ＋1.0 mg/L KT +5 ml/L抑菌剂2号＋30 g/L蔗糖，pH5.8；增殖培养基为MS+1 mg/L 6-BA+1mg/L KT+5 ml/L抑菌剂2号+30.0 g/L蔗糖，pH5.8；生根培养基为1/2MS+3 mg/L NAA +5ml/L 抑菌剂2号＋30 g/L蔗糖；配制培养基时，先不加抑菌剂2号，按各培养基配方配齐其他原料后，定容、煮开，当温度冷却至50℃时，再按各培养基配方添加抑菌剂2号，用1 mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl调pH值至5.8，分装到培养容器中，封口，冷却。
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
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| C14 | Grant of patent or utility model | ||
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
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Granted publication date: 20130807 Termination date: 20160613 |