CN106879468A - 一种提高甘蔗茎尖培养成活率的方法 - Google Patents

一种提高甘蔗茎尖培养成活率的方法 Download PDF

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刘丽敏
黄永才
余坤兴
刘俊仙
刘红坚
李松
何为中
翁梦苓
卢曼曼
何毅波
刘欣
游建华
张伟珍
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Abstract

本发明提供了一种提高甘蔗茎尖培养成活率的方法，包括以下步骤：挑选生长健康的大田甘蔗植株尾梢为外植体；剥去外层叶鞘，切取茎尖；放入MS培养液内浸泡10~30min；置于配方为MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+白糖30g/L+抗坏血酸5~15mg/L+核黄素10~20mg/L并垫有滤纸的培养基上培养；每天摇动培养瓶一次，使甘蔗茎尖改变位置；每星期更换一次培养基。这个方法增强了茎尖的生长活力，降低酚害物质的影响，缩短茎尖萌发时间，显著的提高甘蔗茎尖培养成活率。

Description

一种提高甘蔗茎尖培养成活率的方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种提高甘蔗茎尖培养成活率的方法。
背景技术
甘蔗属无性系繁殖作物，利用自身的蔗茎作为种源繁殖，连续种植多年后容易感染或者积累病菌。巴西李增生（Lee.TSC）博士报道，所有甘蔗品种的健康良种在生产上使用5年后，100％感染宿根矮化病。因此，一个优良的甘蔗品种，在连续种植多年之后，由于病虫害的侵染，种性严重退化，造成甘蔗品质改变，产量减少等问题。通过热处理结合茎尖分生组织培养是现在生产上培养甘蔗脱毒健康种苗的一个主要的技术。研究结果表明:这个方法可以把蔗株上的花叶病、宿根矮化病等用常规方法难以防治的病害根除，生产无病、无毒的健康种苗。很多国家如巴西、澳大利亚、古巴等都应用此技术建立工厂化生产脱毒苗。但是目前此技术还存在些许问题，如程序繁多，培养周期时间长、酚污染严重，茎尖培养成活率不高，培养成本偏高等，这极大的限制了甘蔗脱毒健康种苗的生产数量和速度。
发明内容
针对上述问题，本发明公开了一种提高甘蔗茎尖培养成活率的方法，简洁有效的解决了甘蔗茎尖培养酚污染严重、培养成活率不高的技术问题。
对此，本发明的技术方案为：
一种提高甘蔗茎尖培养成活率的方法，包含以下步骤：
步骤S1：外植体挑选，挑选生长健康的大田甘蔗植株尾梢为外植体；
步骤S2：前处理，将甘蔗尾梢表面消毒，剥去外层叶鞘；
步骤S3：培养基配置，配置配方为MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+白糖30g/L+抗坏血酸5~15mg/L +核黄素10~20mg/L的培养基溶液放入培养瓶，培养瓶内放置滤纸；
步骤S4：接种，切取甘蔗茎尖，放入MS培养液内浸泡，取出后接种到步骤S3所述培养瓶内的滤纸上进行培养；
步骤S5：培养管理，每天摇动培养瓶一次，使甘蔗茎尖改变在滤纸上了位置。
优选的，所述步骤S1中，挑选生长期为4-6个月，健康、无病虫害的大田甘蔗植株尾梢为外植体。
优选的，所述步骤S3中，培养瓶内垫上4层大小为4cm*4cm的滤纸，培养基溶液不淹没滤纸。
优选的，所述步骤S4中，在超净工作台上剥去外层的叶鞘，直至露出甘蔗茎尖生长点为止，切取包含1-2个芽原基的甘蔗茎尖，切割点位于生长点下方2-3mm。
优选的，所述步骤S4中，将切取的甘蔗茎尖放入MS培养液内浸泡10~30min，取出后接种在培养瓶内的滤纸垫上进行培养。
优选的，所述步骤S5中，甘蔗茎尖每星期转接一次新的培养基。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、外植体获取材料方便，不需要沙床培养，节省时间，茎尖生长活力强，培养易成活。
2、在培养基内添加抗坏血酸和核黄素，抗坏血酸具有抗氧化作用，核黄素具有促进发育和细胞再生的作用。因此，此配方具有降低茎尖酚害，促进茎尖生长的作用。
3、在液体培养基内放滤纸，相比传统的固体培养，茎尖可以移动位置，滤纸可以吸附酚害物质，液体可以稀释茎尖切割产生的酚类物质，有助于降低酚类物质对茎尖的伤害。
4、切取的甘蔗茎尖先浸泡后接种，这样可以清洗茎尖被切割所破坏的细胞质液，同时使表面细胞吸附营养，有助于减少酚害物质的产生以及茎尖的生长。
5、这个方法相比传统的固体培养相比，茎尖成活率提高40-55%，培养周期缩短20-30天。
具体实施方式
下面对本发明的较优的实施例作进一步的详细说明。
实施例1
（1）外植体的挑选：挑选生长期为4个月的健康、生长旺盛、无病虫害的甘蔗植株尾梢作为外植体。
（2）前处理：将甘蔗尾梢表面使用75%的酒精消毒，剥去外层叶鞘。
（3）培养基的配置：培养基配方为MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+抗坏血酸5mg/L+核黄素10mg/L+白糖30g/L；先按照配方量取各个成分的母液，称量白糖，将其混合溶解在总体积1/3的蒸馏水内，加入白糖，充分搅拌溶解后加入蒸馏水定容至所需的体积；然后用1mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl 调节pH 值至5.8；在每个培养瓶内放入一张折成4层，大小为4cm*4cm的滤纸；用移液器量取10ml配好的培养液分装到各个培养瓶内；最后在1.1 kg/cm2 压力下灭菌30 分钟，出锅冷却后即为茎尖培养基。
（4）茎尖接种：在超净工作台上将甘蔗尾梢一层层地剥去外部叶鞘，直至露出生长点，切取生长点下2-3mm的位置，放入经过灭菌的MS培养液内浸泡10分钟；捞出后接种到茎尖培养基的滤纸垫上进行培养。
（5）培养管理：每天摇动培养瓶一次，使茎尖改变在滤纸上了位置。每星期转接一次新的培养基，直至茎尖长出新的侧芽为止。
本实施例所述培养方法中，茎尖成活率为60%，培养周期为55天。
实施例 2
（1）外植体的挑选：挑选生长期为5个月的甘蔗健康、生长旺盛、无病虫害的植株尾梢作为外植体。
（2）前处理：将甘蔗尾梢表面使用75%的酒精消毒，剥去外层叶鞘。
（3）培养基的配置：培养基配方为MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+抗坏血酸10mg/L+核黄素15mg/L+30 g/L 白糖；先按照配方量取各个成分的母液，称量白糖，将其混合溶解在总体积1/3的蒸馏水内，加入白糖，充分搅拌溶解后加入蒸馏水定容至所需的体积；然后用1mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl调节pH值至5.8；在每个培养瓶内放入一张折成4层，大小为4cm*4cm的滤纸；用移液器量取10ml配好的培养液分装到各个培养瓶内；最后在1.1 kg/cm2压力下灭菌30 分钟，出锅冷却后即为茎尖培养基。
（4）茎尖接种：在超净工作台上将甘蔗尾梢一层层地剥去外部叶鞘，直至露出生长点，切取生长点下2-3mm的位置，放入经过灭菌的MS培养液内浸泡20分钟；捞出后接种到茎尖培养基的滤纸垫上进行培养。
（5）培养管理：每天摇动培养瓶一次，使茎尖改变在滤纸上了位置。每星期转接一次新的培养基，直至茎尖长出新的侧芽为止。
本实施例所述培养方法中，茎尖成活率为75%，培养周期为40天。
实施例 3
（1）外植体的挑选：挑选生长期为6个月的甘蔗健康、生长旺盛、无病虫害的植株尾梢作为外植体。
（2）前处理：将甘蔗尾梢表面使用75%的酒精消毒，剥去外层叶鞘。
（3）培养基的配置：培养基配方为MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+抗坏血酸15mg/L+核黄素20mg/L+30 g/L白糖；先按照配方量取各个成分的母液，称量白糖，将其混合溶解在总体积1/3的蒸馏水内，加入白糖，充分搅拌溶解后加入蒸馏水定容至所需的体积；然后用1mol/L的NaOH或1 mol/L的HCl调节pH值至5.8；在每个培养瓶内放入一张折成4层，大小为4cm*4cm的滤纸；用移液器量取10ml配好的培养液分装到各个培养瓶内；最后在1.1 kg/cm2压力下灭菌30 分钟，出锅冷却后即为茎尖培养基。
（4）茎尖接种：在超净工作台上将甘蔗尾梢一层层地剥去外部叶鞘，直至露出生长点，切取生长点下2-3mm的位置，放入经过灭菌的MS培养液内浸泡30分钟；捞出后接种到茎尖培养基的滤纸垫上进行培养。
（5）培养管理：每天摇动培养瓶一次，使茎尖改变在滤纸上了位置。每星期转接一次新的培养基，直至茎尖长出新的侧芽为止。
本实施例所述培养方法中，茎尖成活率为65%，培养周期为50天。
由实施例1～3可知，本发明所述的培养方法方法可使甘蔗茎尖培养成活率达到60-75%，培养周期为40-55天。
对比例
（1）外植体的挑选和准备：挑选健康的甘蔗蔗茎，砍成单芽，放入52°C的温水中浸泡半个小时，再将其种在沙床上进行催芽15-20天，待芽长至10-15cm高时便可作为茎尖培养的外植体。
（2）前处理：切下腋芽苗，清洗干净，使用75%的酒精拭擦表面。
（3）培养基的配置：培养基配方为MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L +30 g/L 白糖+4.5g/L琼脂；先按照配方量取各个成分的母液，称量白糖和琼脂，将其混合溶解在总体积1/3的蒸馏水内，加入白糖和琼脂，充分搅拌溶解后加入蒸馏水定容至所需的体积；然后用1mol/L 的NaOH 或1 mol/L 的HCl 调节pH 值至5.8；用移液器量取10ml配好的培养液分装到各个培养瓶内；最后在1.1 kg/cm2 压力下灭菌30 分钟，出锅冷却培养基凝固后即为茎尖培养基。
（4）茎尖接种：在超净工作台上将甘蔗腋芽苗一层层地剥去外部叶鞘，直至露出生长点，切取生长点下2-3mm的位置，接种到茎尖培养基上进行培养。
（5）培养管理：每星期转接一次新的培养基，直至茎尖长出新的侧芽为止。
本实施例所述培养方法中，茎尖成活率为20%，培养周期为70天。
由本对比例可知，当所述步骤(1)中使用甘蔗腋芽催苗作为外植体，步骤（3）培养基配方内没有添加抗坏血酸和核黄素时，培养瓶内未放入滤纸，步骤（4）切下的茎尖叶原基未在灭菌的MS培养基中浸泡再接种。茎尖在培养一周后，慢慢变褐，死亡，只有少数生长力比较旺盛的茎尖可以成活，培养成活率比本发明方法低50%；甘蔗腋芽培养需要15天，加上茎尖生长速度慢，整个茎尖培养周期会多出20-30天作用；在腋芽培养和外植体准备的过程中，多出许多工序，花费了更多的人力物力，促使组培苗成本增高。

Claims (6)

1.一种提高甘蔗茎尖培养成活率的方法，其特征在于，包含以下步骤：
步骤S1：外植体挑选，挑选生长健康的大田甘蔗植株尾梢为外植体；
步骤S2：前处理，将甘蔗尾梢表面消毒，剥去外层叶鞘；
步骤S3：培养基配置，配置配方为MS+BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+白糖30g/L+抗坏血酸5~15mg/L +核黄素10~20mg/L的培养基溶液放入培养瓶，培养瓶内放置滤纸；
步骤S4：接种，切取甘蔗茎尖，放入MS培养液内浸泡，取出后接种到步骤S3所述培养瓶内的滤纸上进行培养；
步骤S5：培养管理，每天摇动培养瓶一次，使甘蔗茎尖改变在滤纸上的位置。
2.根据权利要求1所述的提高甘蔗茎尖培养成活率的方法，其特征在于：所述步骤S1中，挑选生长期为4-6个月，健康、无病虫害的大田甘蔗植株尾梢为外植体。
3.根据权利要求1所述的提高甘蔗茎尖培养成活率的方法，其特征在于：所述步骤S3中，培养瓶内垫上4层大小为4cm*4cm的滤纸，培养基溶液不淹没滤纸。
4.根据权利要求1所述的提高甘蔗茎尖培养成活率的方法，其特征在于：所述步骤S4中，在超净工作台上剥去外层的叶鞘，直至露出甘蔗茎尖生长点为止，切取包含1-2个芽原基的甘蔗茎尖，切割点位于生长点下方2-3mm。
5.根据权利要求1所述的提高甘蔗茎尖培养成活率的方法，其特征在于：所述步骤S4中，将切取的甘蔗茎尖放入MS培养液内浸泡10~30min，取出后接种在培养瓶内的滤纸上进行培养。
6.根据权利要求1所述的提高甘蔗茎尖培养成活率的方法，其特征在于：所述步骤S5中，甘蔗茎尖每星期转接一次新的培养基。
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