CN114052010A - 一种利用抗坏血酸超低温保存芋茎尖的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用抗坏血酸超低温保存芋茎尖的方法。本发明公开的利用抗坏血酸超低温保存芋茎尖的方法包括：利用含有抗坏血酸的预培养液对芋茎尖进行预处理，得到预处理的芋茎尖；将预处理的芋茎尖于超低温环境中保存，实现芋茎尖的超低温保存；预培养液由溶质和溶剂组成，溶剂为MS液体培养基，溶质及其在预培养液中的浓度分别为0.1‑0.4mmol/L抗坏血酸和0.3mol/L蔗糖。利用本发明的芋茎尖超低温保存方法保存芋茎尖，芋茎尖的存活率和再生率均由23.13％提高至63.43％。本发明的方法成本低廉、操作简便，是井冈山芋种质超低温保存的一条有效途径。

Description

一种利用抗坏血酸超低温保存芋茎尖的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域中，一种利用抗坏血酸超低温保存芋茎尖的方法。
背景技术
芋(Colocasia esculenta L.Schott)，是天南星科芋属(Colocasia)多年生宿根性草本植物，是芋属植物的主要栽培种。芋喜湿，不耐干旱。芋在中国广泛栽培，其中生产面积较大的省份主要有福建、云南、广东、四川和浙江等。芋的地下球茎营养丰富，富含淀粉、蛋白质、多种维生素，脂肪含量低，是主要的食用部位，俗称芋头。芋是一种世界性的粮食兼蔬菜作物，抗逆性强、适应性广，在非洲、西印度、太平洋和亚洲地区的发展中国家，芋的球茎是人们主食淀粉的来源之一。
无性繁殖及多年生作物种质资源的保存可采用田间保存(field repository)、试管苗保存(in vitro conservation)和超低温保存(cryopreservation)等保存方式。芋目前主要采用田间保存和试管苗保存。田间保存(field repository)利于种质资源的分发利用，但长期反复种植易使一些病毒病病害广泛传播，造成许多优良品种种性退化、品质变劣，种植面积日益减少，甚至濒临绝种，如经芋花叶病毒侵染后，产量下降，品质降低，出现久煮不烂现象。一些野生芋种质资源也因环境的改变和人为因素的破坏而逐渐消失，严重威胁芋种质资源的安全保存。试管苗保存(in vitro conservation)方式占地面积小、不易受自然灾害和病原菌影响、便于种质交换，但因试管苗保存的材料仍处于生长状态，因此需要定期继代，且经多次频繁继代后易发生退化或变异等现象。
超低温保存(cryopreservation)，即植物组织材料经一系列的保存前处理后，投入液氮保存(气相液氮或液相液氮条件下)，经化冻复苏后仍能在一定培养条件下再生成植株，并保持其遗传稳定性。超低温保存方式既避免了田间保存易受自然灾害影响而导致种质变异或毁灭，也避免了试管苗保存中因多次继代引起遗传性状变异或污染的危险。衡量茎尖超低温保存方法成功在于，经超低温保存处理化冻后的茎尖在适宜条件下恢复培养后，可直接再生成正常苗，不经过愈伤阶段。目前芋种质已报道有标准玻璃化法、小滴玻璃化法、包埋玻璃化法超低温保存方法，但不同品种其存活率有很大差别。每个不同品种需要优化其最佳技术体系，以获得超低温保存后的较高成活率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何对芋茎尖进行超低温保存。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种芋茎尖超低温保存方法，所述方法包括：利用含有抗坏血酸的预培养液对芋茎尖进行预处理，得到预处理的芋茎尖；将所述预处理的芋茎尖于超低温环境中保存，实现芋茎尖的超低温保存。
上述方法中，所述预培养液由溶质和溶剂组成，所述溶剂为MS液体培养基，所述溶质及其在所述预培养液中的浓度分别为0.1-0.4mmol/L抗坏血酸和0.3mol/L蔗糖。
进一步，所述预培养液中抗坏血酸的浓度可为0.2mmol/L。
上述方法中，所述预处理可在黑暗中进行。所述预处理的时间可为2天。所述预处理可在25℃进行。
上述方法中，将所述预处理的芋茎尖于超低温环境中保存可包括：
a1)将所述预处理的芋茎尖利用装载液进行处理，得到装载液处理的芋茎尖；所述装载液由溶质和溶剂组成，所述溶剂为MS液体培养基，所述溶质及其在所述装载液中的浓度分别为2.0mol/L甘油和0.4mol/L蔗糖；
a2)将所述装载液处理的芋茎尖于超低温环境中保存，实现芋茎尖的超低温保存。
上述方法中，将所述预处理的芋茎尖利用装载液进行处理的时间可为20分钟。
a1)可在25℃进行。a1)可在光照下进行。
上述方法中，步骤a2)可包括：
a21)将所述装载液处理的芋茎尖利用PVS2玻璃化保护剂处理，得到保护剂处理的芋茎尖；所述PVS2玻璃化保护剂由溶质和溶剂组成，所述溶剂为MS液体培养基，所述溶质及其在所述PVS2玻璃化保护剂中的浓度分别为3.26mol/L甘油、2.42mol/L乙二醇、1.9mol/L二甲基亚砜和0.4mol/L蔗糖；
a22)将所述保护剂处理的芋茎尖于超低温环境中保存，实现芋茎尖的超低温保存。
上述方法中，将所述装载液处理的芋茎尖利用PVS2玻璃化保护剂处理的时间可为40分钟。将所述装载液处理的芋茎尖利用PVS2玻璃化保护剂处理可在0℃下进行。
a21)可在光照下进行。
上述方法还可包括对超低温保存的芋茎尖在卸载液中进行化冻，所述卸载液由溶质和溶剂组成，所述溶剂为MS液体培养基，所述溶质及其在所述卸载液中的浓度为1.20mol/L蔗糖。
本发明还提供了一种成套试剂，所述成套试剂包括所述预培养液。
所述成套试剂还可包括所述装载液和/或所述PVS2玻璃化保护剂。
所述成套试剂可仅由所述预培养液组成，还可由所述预培养液于所述装载液组成，还可以由所述预培养液于所述PVS2玻璃化保护剂组成，还可由所述预培养液、所述装载液与所述PVS2玻璃化保护剂组成。
所述成套试剂中的各试剂均可独立包装。
所述成套试剂可用于芋茎尖超低温保存，也可用于制备芋茎尖超低温保存产品。
所述产品可为试剂盒。
所述成套试剂在芋茎尖超低温保存中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述成套试剂在制备芋茎尖超低温保存产品中的应用，也属于本发明的保护范围。
所述产品可为试剂盒。
本发明中，所述超低温为液相液氮条件下温度。
所述芋茎尖可为2-3个月苗龄井冈山芋组培苗的茎尖。
在本发明的一个实施例中，所述芋为井冈山芋。
利用本发明的芋茎尖超低温保存方法保存芋茎尖，芋茎尖的存活率和再生率均由23.13％提高至63.43％。本发明提供的方法成本低廉、操作简便，是井冈山芋种质超低温保存的一条有效途径。
附图说明
图1为芋种质试管苗离体茎尖照片。
图2为超低温保存小滴玻璃化冻存处理。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
井冈山芋组培苗，来源于国家种质武汉水生蔬菜资源圃，保存于国家种质库试管苗库，种质编号为T4B00003。
抗坏血酸：SIGMA产品，货号V900134。
下述实施例中的正常光照的光照强度为2000～3000lx。
实施例1、利用抗氧化剂提高井冈山芋茎尖超低温保存存活率与再生率
一、相关试剂的配制
预培养液1：预培养液1由溶质和溶剂组成，溶剂为MS液体培养基，溶质及其在预培养液1中的浓度分别为0.1mmol/L抗坏血酸和0.3mol/L蔗糖(终浓度)。
预培养液2：预培养液2由溶质和溶剂组成，溶剂为MS液体培养基，溶质及其在预培养液2中的浓度分别为0.2mmol/L抗坏血酸和0.3mol/L蔗糖(终浓度)。
预培养液3：预培养液3由溶质和溶剂组成，溶剂为MS液体培养基，溶质及其在预培养液3中的浓度分别为0.4mmol/L抗坏血酸和0.3mol/L蔗糖(终浓度)。
预培养液4：预培养液4由溶质和溶剂组成，溶剂为MS液体培养基，溶质及其在预培养液4中的浓度分别为0.6mmol/L抗坏血酸和0.3mol/L蔗糖(终浓度)。
对照预培养液：对照预培养液由溶质和溶剂组成，溶剂为MS液体培养基，溶质及其在对照预培养液中的终浓度为0.3mol/L蔗糖。
装载液：装载液由溶质和溶剂组成，溶剂为MS液体培养基，溶质及其在装载液中的浓度分别为2.0mol/L甘油和0.4mol/L蔗糖。
PVS2玻璃化保护剂：PVS2玻璃化保护剂由溶质和溶剂组成，溶剂为MS液体培养基，溶质及其在PVS2玻璃化保护剂中的浓度分别为3.26mol/L甘油、2.42mol/L乙二醇、1.9mol/L二甲基亚砜、0.4mol/L蔗糖。
卸载液：卸载液由溶质和溶剂组成，溶剂为MS液体培养基，溶质及其在卸载液中的浓度为1.20mol/L蔗糖。
二、井冈山芋茎尖的超低温保存
取2-3个月苗龄的井冈山芋组培苗，逐层剥去外层叶片，至剩余1-2片叶原基包围茎尖分生组织(如图1所示)，切取1-2mm左右茎尖，先浸泡在预培养液1中25℃暗培养2天(转速为60rpm/min)，暗培养结束后将茎尖于装载液中25℃浸泡20min(正常光照，即超净台日光灯下)，浸泡结束后将茎尖在PVS2玻璃化保护剂中于0℃下浸泡40min(正常光照，即超净台日光灯下)，再然后将茎尖置于无菌铝箔条上的PVS2玻璃化保护剂(每滴16微升，容纳2～4个茎尖)中，将铝箔条转移至液氮中，如图2所示，而后放入1.8ml冻存管中，投入液氮保存，冻存时间为1小时以上，得到预培养液1处理茎尖的冻存管，每个处理15个茎尖，每个处理3重复。
按照上述方法，将预培养液1分别替换为预培养液2、预培养液3和对照预培养液，分别得到预培养液2、预培养液3和对照预培养液处理茎尖的冻存管。
三、再培养和存活率、再生率统计
1、取出步骤二中的液氮中的各冻存管，在室温下化冻，将含有茎尖的铝箔条放入卸载液中化冻20min，每10min换一次新的卸载液，茎尖完全解冻后将茎尖转移到含有0.3mol/L蔗糖的半固体MS培养基(即向MS培养基中添加蔗糖，蔗糖添加量为0.3mol/L，琼脂减半)的培养皿中放于培养箱中恢复培养培养，1天后转入含有正常MS固体培养基恢复培养，恢复培养前4天在25℃黑暗下进行，黑暗培养4天后转入光照培养，光照培养温度为25℃，光照为正常光照。
2、恢复培养2周后，观察到有保持绿色的为存活，统计存活率(存活率＝存活植株数量÷茎尖处理总数量×100％)；恢复培养4周后观察长出叶子和根的植株，即为再生植株，统计再生率(再生率＝再生植株数量÷茎尖数量×100％)。
结果显示，预培养液1处理后，平均存活率为38.26％(三次重复实验平均存活率分别为27.27％、37.50％、50.00％)，平均再生率为38.26％(三次重复实验平均存活率分别为27.27％、37.50％、50.00％)。
预培养液2处理后，平均存活率为53.19％(三次重复实验平均存活率分别为60.00％、57.89％、41.67％)，平均再生率为49.85％(三次重复实验平均再生率分别为50.00％、57.89％、41.67％)。
预培养液3处理后，平均存活率为63.43％(三次重复实验平均存活率分别为63.64％、40.00％、86.67％)，平均再生率为63.43％(三次重复实验平均再生率分别为63.64％、40.00％、86.67％)。
预培养液4处理后，平均存活率为5.11％(三次重复实验平均存活率分别为6.25％、0.00％、9.09％)，平均再生率为5.11％(三次重复实验平均再生率分别为6.25％、0.00％、9.09％)。
对照预培养液处理后，平均存活率为23.13％的存活率(三次重复实验平均存活率分别为20.00％、20.00％、29.41％)，平均再生率为23.13％(三次重复实验平均再生率分别为20.00％、20.00％、29.41％)。
上述结果说明，当预培养液添加抗坏血酸后，芋茎尖的存活率和再生率均显著增加，但当预培养液中抗坏血酸的浓度为0.6mmol/L时，再生率显著下降，表明，抗坏血酸可以提高芋茎尖超低温保存后的存活率和再生率，预培养液中抗坏血酸的浓度为0.1-0.4mmol/L时最有利于超低温保存后芋茎尖的存活与再生。

Claims (10)

1.一种芋茎尖超低温保存方法，包括：利用含有抗坏血酸的预培养液对芋茎尖进行预处理，得到预处理的芋茎尖；将所述预处理的芋茎尖于超低温环境中保存，实现芋茎尖的超低温保存。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述预培养液由溶质和溶剂组成，所述溶剂为MS液体培养基，所述溶质及其在所述预培养液中的浓度分别为0.1-0.4mmol/L抗坏血酸和0.3mol/L蔗糖。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述预处理在黑暗中进行；和/或，所述预处理的时间为2天。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：将所述预处理的芋茎尖于超低温环境中保存包括：
a1)将所述预处理的芋茎尖利用装载液进行处理，得到装载液处理的芋茎尖；所述装载液由溶质和溶剂组成，所述溶剂为MS液体培养基，所述溶质及其在所述装载液中的浓度分别为2.0mol/L甘油和0.4mol/L蔗糖；
a2)将所述装载液处理的芋茎尖于超低温环境中保存，实现芋茎尖的超低温保存。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：将所述预处理的芋茎尖利用装载液进行处理的时间为20分钟。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：步骤a2)包括：
a21)将所述装载液处理的芋茎尖利用PVS2玻璃化保护剂处理，得到保护剂处理的芋茎尖；所述PVS2玻璃化保护剂由溶质和溶剂组成，所述溶剂为MS液体培养基，所述溶质及其在所述PVS2玻璃化保护剂中的浓度分别为3.26mol/L甘油、2.42mol/L乙二醇、1.9mol/L二甲基亚砜和0.4mol/L蔗糖；
a22)将所述保护剂处理的芋茎尖于超低温环境中保存，实现芋茎尖的超低温保存。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：将所述装载液处理的芋茎尖利用PVS2玻璃化保护剂处理的时间为40分钟；
和/或，将所述装载液处理的芋茎尖利用PVS2玻璃化保护剂处理在0℃下进行。
8.成套试剂，包括权利要求1或2中所述预培养液。
9.根据权利要求8所述的成套试剂，其特征在于：所述成套试剂还包括权利要求4中所述装载液和/或权利要求6中所述PVS2玻璃化保护剂。
10.权利要求8或9所述的成套试剂在芋茎尖超低温保存中的应用；
或，权利要求8或9所述的成套试剂在制备芋茎尖超低温保存产品中的应用。
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